2型糖尿病患者外周血淋巴细胞氧化应激对淋巴细胞功能的影响

型糖尿病患者外周血淋巴细胞氧化应激对2淋巴细胞功能的影响朱秀坤曾令奋陈谕摘要目的探讨2型糖尿病患者外周血淋巴细胞氧化应激改变对淋巴细胞功能的影响方法；纳入2型糖尿病患者29例A组和健康对照者31例B组，分离各组样本外周血淋巴细胞，检测淋巴细胞内氧化型谷胱甘肽GSSH和还原型谷胱甘肽GSH;作外周血淋巴细胞涂片，先以活性氧荧光染液处理涂片，观察荧光强度，继以糖原染色PAS计算外周血淋巴细胞阳性率；体外以植物血凝素PHA刺激分离得到的淋巴细胞并检测其增殖活性结果A组淋巴细胞GSSH/GSH为

1.69±

0.73,B组为

1.14±

0.63,两组比较有统计学差异PvO.05A组淋巴细胞PAS阳性率为31±9%,B组为25±7%,两者有统计学差异P

0.05o在PHA刺激下淋巴细胞的增殖活性A组为

0.61±

0.21,B组

0.37±

0.10,两组比较有统计学差异P

0.01结论:2型糖尿病患者外周血淋巴细胞GSSH/GSH比值增高和PAS阳性率较高与细胞内氧化应激有关；通过检测2型糖尿病患者糖化血红蛋白可间接反映淋巴细胞的转化活性关键词糖尿病，2型；淋巴细胞；氧化应激；增殖试验Effect ofoxidative stresson lymphocyticproliferation intype2diabetic patientsZHU Xiu-kun；ZENG Ling-fen,CHEN Shu.*Second AffiliatedHaspital,Guangzhou MedicalUniversity,Cuangzhou510260,China Correspondingauthor:CHEN ShuE-mail;zenglfmail@

163.com[Abstract]Objective Toexplore theeffect ofoxidative stress in peripherallymphocytes onthe cellfunction.MethodsPeripheral bloodlymphocytes wereseparated from29diabetic patientsgroup Aand31healthy peoplegroup B.Intracellular GSHandGSSH weredetected.Lymphocyte smearswere madeand thentreated withSchiff staining.The positiverate ofperipherallymphoeytes wascalculated usingPAS.The proliferation activity ofthe lymphocytescultured inRI640medium withphytohemagglutinwas detected.Results GSSH/GSH wassignificantly higherin groupA thanin groupB

1.69±

0.73vs.

1.14±

0.63,P

0.

05.The positiverate ofPAS differedsignificantly betweengroupAand groupB[31±9%vs.25±7%,P0,05].There wasasignificant differencein the proliferationactivity of lymphocytesbetween thetwo groups

0.61±

0.21vs.

0.37±

0.10,P

0.

01.Conclusions Anincreased GSSH/GSH anda higherrate ofPAS areassociated withintracellular oxidative stressintype2diabeticpatients.Detection ofHbAlc mayindirectly reflecttheproliferationactivityoflymphocytes.[Key words1Diabetes mellitus,type2;Lymphocytes;Oxidative stress;Proliferation test现有文献［1-2］显示由于高糖环境、晚期糖基化赖氨酸、Ne竣乙基-赖氨酸等，还可引起细胞多糖代产物和炎症因子等刺激，糖尿病患者体内出现活性氧谢紊乱淋巴细胞作为机体主要的免疫细胞，目前尚增多，可造成多种细胞损伤，包括血管内皮细胞、胰没有对淋巴细胞内多糖物质积累、氧化应激与细胞功能的研究，本实验利用糖原染色PAS、活性氧荧光、岛B细胞和外周血单核细胞损伤等活性氧又可激活细胞增殖实验等初步观察了淋巴细胞内活性氧、多糖NF-kB、p

38、MAPK等产生多种炎症因子，加快糖尿病蓄积对增殖功能的影响并发症的发展［3］长期的高血糖状态和胰岛素抵抗，不仅使体内生成过多的糖基化终末产物，如糖化1对象与方法血红蛋白、果糖胺、Ne-竣甲基-

1.1研究对象2型糖尿病诊断标准符合1999年WHO发布的诊断标准，选取无合并感染的糖尿病患者29例A组；选取与A组年龄相仿、性别比例相似的健doi:

10.3969/j.issn.1006-

5725.

2011.

09.023康人31例作为对照B组；抽取外周血，标本以EDTA-作者单位510260广州医学院第二附属医院朱秀坤，曾令七抗凝奋;510260广州医学院第二附属医院内分泌科陈渤

1.2材料人淋巴细胞分离液Shanghai Canspec通信作者陈谕E-mail;zenglfmail@

163.comSICo.Ltd.）;氧化型谷胱甘肽（GSSH）和还原型谷GSSH还原成GSH,而GSH可以和生色底物DTNB反应产胱甘肽（GSH）检测试剂盒、细胞增殖检测试剂盒和生黄色的TNB和GSSH细胞增殖检测，利用一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可活性氧检测试剂盒（江苏海门碧云天生物技术有限公以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的产物司）；Hanks平衡盐、R1640细胞培养液（吉诺医药细胞增殖越多越快，则颜色越深生物技术有限公司），胎牛血清（四季青）;Img植物

1.4统计学方法数据以x土s表示，统计方法有独立血凝素（PHA）粉剂（广州医药工业研究所）;PAS试样本t检验、Pearson相关分析等，数据均使用SPSS剂、蛋白甘油和磷酸盐缓冲液为实验室自备；96孔细

13.0软件包进行分析胞培养板（美国）；臼本东曹糖化血红蛋白分析仪；分光光度计（华鑫科技有限公司），Olympus荧光显2结果微镜（广州医学院第二附属医院临床分子实验室）

1.11两组各项实验结果比较见表1两组GSSH/GSH

1.3方法利用Ficoll液进行密度梯度分离淋巴细胞；比较有统计学差异（P

0.05）两者淋巴细胞PAS使用自配含PHA与胎牛血清的淋巴细胞培养液进行细阳性率比较有统计学差异（P

0.05）o在PHA刺激下胞培养活性氧检测则利用商品化荧光探针DCFH-DA淋巴细胞的增殖活性A组为

0.61±

0.21,B组为

0.进行检测PAS染色采用传统的糖原染色方法淋巴37±

0.10,两组比较有统计学差异（P

0.01）o细胞内GSSH/GSH含量检测，通过谷胱甘肽还原酶把x±s表1两组各项实验结果比较GSSH/GS组别例数年龄（岁）总谷胱甘肽GSS1I GSH增殖指数PAS阳性率（%）糖化血红蛋白（%）HA组2947±

91.40±

0.

850.83±

0.

500.57±

0.

401.69±

0.

730.61±

0.2131±

99.3±

2.4B组3146±

111.19±

0.

450.58±0,

260.61±

0.

311.14±

0.

630.37±

0.1025±

75.6±

0.4t值

0.615-

1.23-

2.

440.341-

3.12-

5.42-

2.44-

8.835P值

0.

5400.

2220.

0180.

7340.

030.

0000.

0180.

0001.2淋巴细胞增殖实验结果结果显示随着糖化血红蛋白增高，淋巴细胞有更高的增殖活性Pearson相关分析显示两者相关系数厂

0.6见图

11.3活性氧荧光定性检测结果分离淋巴细胞后作细胞涂片，糜首先进行活性氧荧光检测，在荧光显微镜观察后再行PAS染色建嵌结果显示活性氧荧光弱的淋巴细胞，PAS强阳性；反之亦然曾见图23讨论2型糖尿病患者体内由于长期的高糖环境容易造成氧化应激损伤淋巴细胞作为主要的免疫细胞，在外周血循环有不同的半衰期，半衰期长的糖化血红蛋日1淋巴细胞活性随着糖化血红蛋白增加而增强注A,糖化血红蛋白

5.设的标本淋巴细胞显示弱荧光（X100）;B,A图标本经PAS后示高阳性率（X100）;C,糖化血红蛋白

10.4%的标本淋巴细胞显强荧光（X100）;D,C图标本经PAS后示低阳性率（X400）图2氧化荧光染色与PAS的关系淋巴细胞更容易受高糖环境的影响GSH是反映氧化胞增殖则增强淋巴细胞增殖实验是衡量淋巴细胞功应激的敏感指标本实验中，2型糖尿病患者外周血能的重要实验，反映了淋巴细胞免疫状态糖尿病患淋巴细胞GSSH含量较正常对照组高，总谷胱甘肽含量者中淋巴细胞表现出高的增殖活性，且与糖化血红蛋虽有所增高但不明显，GSH含量有所下降，但GSSH/GSH白有一定的相关性厂

0.6,这与文献[9-10]报道糖尿比值改变更显著，说明存在氧化应激的淋巴细胞抗氧病患者血浆中有过高的炎症因子，如TNF-a、IL-

6、化物质消耗增加，对抗胞内的氧化应激能力下降，类IL-

1、CRP等一致因此，通过检测2型糖尿病患者似于红细胞有研究⑷显示，检测红细胞中GSSH/GSH糖化血红蛋白可间接反映患者淋巴细胞的免疫状态，比值是筛查糖尿病的一个好方法，但尚无对淋巴细胞糖化血红蛋白高，淋巴细胞处于易激活状态，但这种内GSSH/GSH用于预测糖尿病的报道PAS染色是评估状态会影响细胞功能，致使糖尿病患者容易发生感染多糖类物质含量的传统方法，淋巴细胞PAS在正常人4参考文献阳性率在29%以下糖尿病组淋巴细胞PAS染色阳性率

[1]Wei W,Liu Q,Tan Y,et al.Oxidative stress,diabetes,and diabeticcomplications[J].Hemoglobin,2009,335:370-比正常对照组高，在研究2型糖尿病患者的肝细胞时

377.发现胰高血糖素与胰岛素比例失衡是导致2型糖尿病

[2]Hagiwara S,Iwasaka H,Hasegawa A,et aLHyperglycemia contributesto患者高血糖的一个重要因素［5］,因此推测对于同样cardiac dysfunctionin alipopolysaccharide-induced systemic存在胰岛素受体的淋巴细胞，其PAS阳性率增加可能inflammation model[J].Crit CareMed,2009,377:2223-

2227.并不是糖原增加所致，而是细胞长期处于高血糖环境

[3]Negrean M,Stitban A,Stratmann B,et al.Effects oflow-and使胞内糖蛋白增加的结果此外，淋巴细胞PAS阳性high-advanced glycationendproduct mealson macro-andmicrovascular endothelialfunction andoxidativestressin patientswith率并不随着糖化血红蛋白升高而升高，提示淋巴细胞type2diabetes mellitus[J].Am JClin Nutr,2007,855:1236-

1243.胞内糖基化产物形成的周期有异于红细胞，并且在淋

[4]Whillier S,Raftos JE,Kuchel PW.Glutathione synthesisby redblood巴细胞内可能存在能反映糖尿病患者免疫情况的糖基cells intype2diabetes mellitus[J].Redox Rep,2008,136:277-

282.化产物，有待以后实验的探索活性氧荧光检测是反

[5]Basu A,Shah P,Nielsen M,et al.Effects oftype2diabetes onthe映细胞内活性氧含量的半定量方法在PAS染色强阳regulation ofhepatic glucosemetabolism[J].J InvestigMed,2004,526:366-

374.性的标本，其活性氧荧光强度反而不高，推测PAS强

[6]Bouraijaj M,Stehouwer CD,van HinsberghV W,et al.Role of阳性的淋巴细胞，使游离的糖基化中间物如甲基乙二methylglyoxal adductsin thedevelopment ofvascular complicationsin醛methyIglyoxal,MG0减少，其与蛋白质发生糖基diabetes mellitus[J].Biochem SocTrans,2003,31Pt6:1400-

1402.化的机会减少，对活性氧有一定的抵抗作用，但细胞

[7]Ho C,Lee PH,Huang WJ,et al.Methylglyoxal-induced fibronectingene结构已发生不可逆的改变MG0是葡萄糖通过糖酵解expression throughRas-mediated NADPHoxidase activationin renalmesangialcells[J].Nephrology Carlton,2007,124:348-

356.中间产物生成的主要糖基化中间产物，已经证明糖尿

[8]Thornalley PJ.Protein andnucleotide damageby glyoxaland病患者血液中有大量的MG0,且与糖尿病肾病、糖尿病methylglyoxal inphysiological systems----------role inageing and视网膜病变有密切关系［6-7］同时，无论是MGOdisease[J].Drug MetabolDrug Interact,2008,231-2:125-

150.的代谢，还是活性氧的消除，都与GSH有关［8］,这

[9]Ndisang JF.Role ofheme oxygenasein inflammation,insulinsignalling,与实验中糖尿病患者淋巴细胞内GSSH/GSH比值较正diabetes andobesity[J].Mediators Inflamm,2010:

359732.常人高一致现有文献报道，在一些免疫缺陷疾病中，

[10]张逸，张木坤，刘露,血清C反应蛋白与2型糖尿病的关系[J].检验淋巴细胞增殖降低；而自身免疫性疾病患者的淋巴细医学与临床，2009,617:1422-

1423.收稿2010-09-25编辑袁宁欢迎钉W《实用眼考春志》。