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2型糖尿病大鼠胰岛B细胞PDX-1基因表达及GLP-1的干预作用吴美芬陈晓铭武革郑坤杰潘海燕方烁摘要目的观察胰高血糖素样肽-lglucagon-like peptide-1,GLP-1类似物利拉鲁肽对2型糖尿病大鼠胰腺十二指肠同源盒」pancreatic duodenalhomeobox-1,PDX-1基因表达水平的影响方法将60只雄性SD大鼠平均分为3组正常对照组、糖尿病未治疗组及GUM组，正常对照组给予普通饲料喂养，糖尿病未治疗组与GLP-1组给予高脂饲料喂养，于第8周末以链月尿佐菌素Streptozotocin,STZ30mg/kg.bw腹腔注射高脂饲料喂养组，成模后GLP-1组给予利拉鲁肽200%/kg皮下注射，每日2次共持续8周其余2组予等量的生理盐水皮下注射以实时荧光定量逆转录■聚合酶链反应Real-lune fluaisscentquantitative easetranscription-polymerase chain^action,Real-Time RT-PCR法检测大鼠胰腺胰岛细胞PDX-1基因的表达结果与正常对照组比较，GLP-1组及未治疗组PDX-1mRNA的表达量明显减低P
0.001,GLP-l治疗后2型糖尿病大鼠胰腺PDX-lmRNA的表达量可明显增高PvO.OOl结论GLP-1可上调2型糖尿病大鼠胰岛p细胞PDX-1基因的表达关键词糖尿病，2型；大鼠；PDX-1;GLP-1;利拉鲁肽Effect ofGLP-1on the expression of PDX-1gene inislet beta cells of type2diabetes ratsWU Mei-fen；Chen Xiao-ming,WUGe,ZHENG Kun-jie,PAN Hai-yan,FANG Shuo,*Department ofEndocrinology,Affiliated Hospitalof GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001,ChinaCorresponding author:WU GeE-mail:wuge427@aliyI Abstract]Objective Toobserve theeffect ofliraglutide,an analogueof glucagonlike peptide-1GLP-1,on theexpressionof PDX-1gene in the isletbeta cellsof type2diabetes rats.Methods Sixtymale SDrats weredivided into3groups:normal controlgroup,diabetic modelgroup andGLP-1group.Normal controlgroup wasgiven normaldiet anddiabetic modelgroup andGLP-1group weregiven highfat diet.After theeighth weekend,the highfat dietgroup wasintraperitoneally injectedwithstreptozotocinSTZ30mg/kg-bw,and the GLP-1group wassubcutaneously injectedwith liraglutide200gg/kg with2times perdayfor8weeks.The othergroups weretreated withnormal salineby subcutaneousinjection.Real-time fluorescentquantitativereverse transcriptionpolymerase chainreaction Real-Time RT-PCR wasused todetect theexpression ofPDX-1gene inratpancreatic isletcells.Results Theexpressions ofPDX-1mRNA intheGLP-1group anduntreated groupwere significantlylowerP
0.001than thatinthenormal controlgroup,but significantlyhigher thanthat afterGLP-1treatment P
0.
001.Conclusion GLP-1can upregulatetheexpression ofPDX-1gene inthe isletbetacellsoftype2diabetes rats.I Keywords]Diabetes mellitus,type2;Pancreatic duodenalhomeobox-1;Glucagon-like peptide-1;Liraglutide胰高血糖素样肽-1（glucagonTike peptide-1,GLP-1在糖尿病治疗领域最具有应用的潜力其改善GLPT）是一种肠肽类激素，广泛分布于各种组织，从糖脂代谢是主要效应，然而其促进胰岛B细胞的分化、而决定了其作用的多效性GLP-1可以促进胰岛素合再生、抑制B细胞凋亡已被学者认为是主要作用，而成和分泌、促进B细胞增殖和分化、抑制B细这一机制也一直在人们的探索中有研究显示，GLP-1的这一作用是依赖于胰十二指肠同源盒T（PDXT）基因的正常表达PDX-1是8细胞内重要的转录因子，（）（）doi:
10.3969/jissn.1X6-
5725.
2014.
11.X6参与B细胞胰岛素基因的转录调控，从而实现B细胞基金项目广东省科技H划资助项目（编号再生和修复本研究通过2型糖尿病大鼠模型，观察2011B031800231）;广东省医学科研基金资助项目（编号B2011243）;广东医学院青年基金项目（编号2010XQ112）GLP-1对2型糖尿病大鼠胰岛B细胞分泌胰岛素的传作者单位524001广东省湛江市，广东医学院附属医院内导通路中转录因子PDXT表达的影响，以期进一步探分泌科偎美芬，陈晓铭，武革，郑坤杰，方烁）;523808广东讨GLPT对胰岛B细胞作用及功能改变的可能机制省东莞市，广东医学院（潘海燕）材料与方法1通信作者武革E-mai1:wuge427蚓iyua can.cn
1.1实验动物及分组健康雄性SD大鼠60只SPF级,胞凋亡，减少胰高血糖素分泌及肝糖原输出，增加葡平均体质量180220g,适应性喂养1周后，随机分为萄糖的摄取和储存，降低食欲，减缓胃排空，因此，〜值
23.0893组正常对照组20只，糖尿病未治疗组及GLP-1-
2.215-
6.000组各20只正常对照组普通饲料喂养，糖尿病未治P值
0.
0620.
0000.000FINSmU/L疗组及GLP-1组给予高脂饲料喂养，8周后腹腔注射治疗前
15.14±
1.
3530.06±
1.
5030.14±
1.
48226.
1400.000STZ30mg/kg-bw,正常对照组注射同等体积的生理治疗后
15.40±
1.
2230.59±
1.
6426.39±
1.
23213.
4230.000盐水实验组72h后测随机尾静脉血糖，两次随机血t值-
2.049-
2.
57422.853糖
216.7mmol/L,稳定2周，如未达到标准追加1次P值
0.
0800.
0330.000ISI注射成模后GLP-1组给予利拉鲁肽200ug/kg皮下治疗前-
4.34±
0.21-
6.04±
0.09-
6.06±
0.
09412.
0820.000注射，每日2次共持续8周，其余2组予等量的生理治疗后-
4.39±
0.23-
6.21±
0.16-
5.43±
0.
23110.
9420.000盐水皮下注射t值
3.
1857.089-
15.
6301.2实验方法P值
0.
0150.
0000.000生化指标测定用全自动生化分析仪检测血清空腹血H0MA-1R治疗前糖FBG、总胆固醇TC、甘油三酯TG、低密度脂
3.49±
0.
7218.77±
1.
6719.
0811.
80188.
7470.000治疗后
3.68±
0.81蛋白胆固醇LDL-C、高密度脂蛋白胆固醇HDL-C,
22.42±
3.
4710.43±
2.
28102.
5420.000t值-
3.532-
5.
94147.720ELISA法检测血清胰岛素P值
0.
0100.
0000.000FINS ISI=Ln[l/FBG FINS],HOMA-IR=FBG-o TGmmol/L治疗前FINS/
22.
50.79±
0.
081.73±
0.
111.79±
0.
19106.
9510.000o治疗后
0.82±
0.
102.02±
0.
221.22±
0.
2649.
0780.
0001.
2.2反转录-聚合酶链反应RT-PCR法检测胰腺t值-
1.483-
3.
03120.13组织PDXT mRNA的表达用Trizol Kit提取胰P值
0.
1820.
0140.000腺组织RNA,RT-PCR扩增PDX-1[PDX-1引物序列5TCmmol/L-3:GCGAGATGCTGGCAGACCTCT,GGC治疗前
1.45±
0.
251.97±
0.
242.06±
0.
406.
4550.001AGACCTGGCGGTTCACAT]和B-actin mRNA,扩增产物治疗后
1.53±
0.
202.41±
0.
291.65±
0.
4013.
9670.000值经琼脂糖电泳、摄片和计算机图像扫描RT-PCR产-
1.312-
11.
2735.811P值
0.
2310.
0000.000物半定量因8-actin在组织中均匀表达，PDX-1基HDL-Cmniol/L因的表达水平用靶基因与B-actin的比值表示引物治疗前
0.82±
0.
090.54±
0.
080.55±
0.
1022.
0170.000由南京金斯瑞科技有限公司合成，RT-PCR反应结束后，治疗后
0.72±
0.
090.46±
0.
070.58±
0.
1017.
5590.000DNA扩增仪自动分析并计算结果t值
3.
4498.
5104.
7061.3统计学处理用SPSS
17.0统计软件分析数据P值
0.
0110.
0000.000LDL-Cmmol/L定量资料两组间数据比较采用t检验，定量资料多组治疗前
0.58±
0.
090.77±
0.
150.75±
0.
173.
5220.023间数据比较采用one-way ANOVA分析，相关分析采用治疗后
0.64±
0.
280.98±
0.
180.75±
0.
234.
5030.008Pearson直线相关分析以P
0.05为差异有统计学t值-
0.826-
3.
4920.000意义P值
0.
4360.
0071.000结果
22.1各组大鼠代谢相关指标情况治疗前与正常对照组
2.2Real-Time RT-PCR法检测PDX-lmRNA的表达治比较，糖尿病未治疗组及GLP-1组FBG、FINS、HOMA-IR.疗后，与正常对照组比较，糖尿病未治疗组PDX-1mRNATG、TC、LDL-C明显升高P
0.001,HDL-C及ISI的表达量明显减低P
0.001,GLP-1治疗后PDX-1明显降低PVO.OOlGLP-1组治疗后与治疗前及糖mRNA的表达量较未治疗组明显增高P
0.001,见表2尿病未治疗组比较，FBG、FINS、HOMA-IR TG、TC、
3.3PDX-lmRNA的表达量与各代谢指标的相关性LDL-C明显降低PG.001HDL-C及ISI明显升高Pearson直线相关分析显示，治疗后PDX-1mRNA的表P
0.001,但LDL-C无明显降低P
0.05;而未治疗达量与FBG、FINS、TG、TC、LDL-C、HOMA-IR及ISI组FBG、FINS、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C较前明显升呈负相关P0,05,与HDL-C成正相关P
0.05o见高P
0.001,HDL-C及ISI明显降低P0・001,表表31表1各组大鼠代谢相关指标比较x±s表2治疗后各组大鼠胰腺组织PDX-lmRNA的表达量比较正常对照组糖尿病未治疗组GLPT组F值P值X±SFBGimnol/L组别例数PDX-1mRNA治疗前
5.13±
0.
6414.17±
0.
7214.40±
0.
95265.
7950.000正常对照组
204.44±
0.15治疗后
5.32±
0.
7916.81±
2.
058.99±
1.
6181.
8290.000糖尿病未治疗组
201.06±
0.07表明胰岛素受体和胰岛素底物IRST数量，促进GLP-1组
203.09±
0.08注经one-way AN0VA分析，F=
1897.29,P=
0.000GLUT-4的表达，从而改善胰岛素抵抗本实验结果显示，利拉鲁肽治疗后可使大鼠TG、TC H0MA-IR明表3治疗后PDX.lmRNA的表达量与各代谢指标的相关显降低,HDL-C升高,糖脂代谢紊乱得到改善，可能与性增加了胰岛3细胞PDX-1mRNA的表达有关胰岛B细胞PDX-lmRNA的表达增多，PDX-1mRNAr值P值胰岛素抵抗得到改善，进而发挥了其降糖的作用表明PDX-1对GLP-1改善胰岛B细胞的增殖再生具有重FBG-
0.
8960.000FINS-
0.
7240.000要的作用但本实验的设计及结果尚不能表明GLP-1TG-
0.
7750.000对PDX-1的作用是通过何种途径或调节何种抗凋亡因TC-
0.
5810.000子实现的，这仍有待进一步深入对PDX-1表达增加和LDL-C-
0.
4760.001相关的信号通路进行研究HDL-C
0.
5820.000ISI
0.
8850.0004HOMA-IR-
0.
8420.000
[1]Shiraki N,Lai CJ,Hishikari Y,et al.TGF2B signalingpotentiatesdifferentiation ofembryonic stemcells toPdx-1expressing3讨论endodermal cells[J].Gene Cells,2005,106:503-PDX-1是胰岛内分泌细胞群发育的主要控制基因，
516.其主要功能是作为转录因子调控胰腺的分化发育、胰
[2]Yuan H,Liu H,Tian R,et al.Regulation ofmesenchymal stemcelldifferentiation andinsulin secretionby differentialexpressionof岛B细胞增殖与分化、胰岛素基因的转录、胰岛素颗Pdx-l[JJ.Mol BiolRep,2012,397:7777-
7783.粒成熟和分泌Yuan等［121利用表达载体将人PDX-1
[3]Drueker DJ,Nauek MA.The incretinsystem:glucagon-like peptide-1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞，发现PDX-1单独作recepter agonistsand dipeptidylpcptidase-4inhibitors intype2用足以诱导胰岛素基因的表达及胰岛素分泌，当进一diabetes[J].Lancet,2006,3689548:1696-
1705.步增加PDX-1的表达水平时，出现剂量依赖性的增加
[4]Yang M,Zhang L,Wang C,et al.Liraglutide increasesFGF-21胰岛素mRNA水平及胰岛素分泌量但长期高血糖、activity andinsulin sensitivityin highfat dietand adiponectinknockdowninduced insulinresistance[J].PLoS ONE,2012,7脂代谢紊乱可以损伤PDX-1基因，使PDXT表达下调，H:e
48392.导致胰岛素分泌减少、B细胞功能衰退加剧，从而又
[5]Chiquette E,Toth PP,Ramirez G,et al.Treatment withexenatide加重了糖脂代谢紊乱［3］Yang等4的研究表明，once weeklyor twicedaily fbr30weeks isassociated withchanges in高脂饮食联合脂联素基因敲除诱导INS抵抗小鼠模型，several cardiovascularrisk markers[J].Vase HealthRisk Manag,2012,8:621-
629.给予利拉鲁肽干预，可明显改善糖代谢及INS敏感性，
[6]Lee YS,Park MS,Choung JS,et al.Glucagon-like peptide-1inhibits降低INS抵抗本实验中观察到，糖尿病未治疗组大adipose issuemacrophage infiltrationand inflammationin anobese鼠FBG、FINS、TG、TC、LDL-C较正常对照组明显增mouse medelof diabetes[J].Diabetologia,2012,559:2456-
2468.高，HDL-C及ISI明显降低，PDX-1mRNA表达下降，收稿2013-12-16编辑张倩表明了糖脂代谢紊乱可能与PDX-1mRNA表达受损有关经8周高脂喂养后的大鼠还表现出胰岛素水平升高、出现胰岛素抵抗现象，表明血糖、脂代谢紊乱可能与胰腺PDX-1基因的表达之间有着极密切的相互牵制与影响GLP-1的降糖作用主要通过促进INS分泌和抑制胰高血糖素分泌两个方面来实现但在本实验中我们也看到GLP-1治疗后FBG较未治疗组降低，PDX-1的表达较未治疗组升高，这一现象可能也说明除了改善一定程度的糖脂毒性，GLP-1可能通过激活CREB信号通路，调节胰岛B细胞存活的关键信号传导通路的作用靶点，而PDX-1就是一个关键的因子临床在应用GLP-1类似物治疗2型糖尿病患者后，可观察到载脂蛋白B/载脂蛋白A1比值显著降低，从而改善高脂血症5但体外研究对GLP-1影响脂质代谢仍存有争议，认为其对脂质合成和脂质分解作用呈双重作用有研究6表明，GLP-1能够增加脂肪细胞。
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