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,论著.启动子基因多态性与型糖尿病下肢血管病变的关系IL-62汤绍芳，卫红艳，张鹏，高志红，邱明才【摘要】目的探讨启动子和基因多态性与型糖尿病下肢血管病变IL.6-572C/G-597G/A2T2DM的关系方法选择例中国北方地区汉族患者，根据超声检查结果分为组组和下肢血管正常组例，VDLE280T2DM VDLE141NOR/39另选例正常人群作为对照组组采用法测定启动子区和基因多态性采用法测定血清70CON PCR-RFLP IL-6-572C/G-597G/A ELISA、受体和水平结果IL-6IL-6IL-6R hs-CRP启动子和具有多态性分布特点°组启动子的基因型和及等位基因的分布频率显著lIL-6-572C/G-597G/A VDLEIL-6-572C/G GG CG G高于NOR组和CON组，差异有统计学意义P
0.05o VDLE组和NOR组1-6启动子・597G/A的基因型GA及等位基因A的分布频率均高于组，差异有统计学意义而组和组间差异无统计学意义组和组血清、和CON Pv
0.05,VDLE NOR P
0.052VDLE NOR1-6IL-6R hs-CRP水平均显著高于CON组，差异有统计学意义P
0.05;VDLE组又显著高于NOR组，差异有统计学意义P
0.053IL-6启动子・572位点型GG及等位基因与血清和高水平有关；位点等位基因与血清高水平有关结论启动子和G IL-6I-6R-597A IL-6P
0.05IL-6-572C/G-597G/A的基因多态性是的易感基因之一，且启动子基因多态性与合并有关血清、和水平T2DM IL-6-572C/G T2DM VDLEIL-6IL-6R hs-CRP可能与及合并有关T2DM VDLE【关键词】糖尿病，型；糖尿病血管病变；白介素多态性，单核昔酸26;【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】R
587.1A-1007-95722010147531-04Relationship ofInterleukin-6Promoter Polymorphismto T2DM Complicatedby LowExtremity VascularDiseases TANGShao-fang,WEI Hong-yan,ZHANG Peng,et al.Department ofEndocrinology,General Hospiualof TianjinMedical University,Tianjin300052,ChinaI Abstract]Objective Toinvestigate thepolymorphism of IL-6promoter-572C/G and-597G/A intype2diabetes mellitusT2DM patientsand itsrelationshipto lowerextremity vascular diseases.Methods Basedon ultrasound,280T2DM patientswere dividedinto groupsVDLElow extremityvasculardisease groupandNORnormal group.The polymorphism of humanIL-6gene-572C/G and-597G/A in70health controlsCON group and280T2DMpatients wasevaluated byPCR-RFLP,the concentrationof serum IL-6,IL-6receptor andhs-CRP byELISA.Results IL-6promoter-572C/G and-597G/Ahad featuresof polymorphismdistribution.The distributionfrequency ofgenotype GG,CG and allele G ofIL-6promoter-572C/G werehigher inVDLEgroup than in groupsNOR andCON,and higherin T2DM patientsthaninCON group,but therewas notsignificant differencebetween groupsVDLE andNOR.Conclusion The genotype GG,CGand alleleGofIL-6promoter-572C/G maybe geneticfactors susceptibleto T2DM withVDLE,and genotypeGAand alleleA ofIL-6promoter-597G/A maybe geneticfactors susceptibleto T2DM butnot toT2DM withVDLE.[Key words]Diabetes mellitus,type2;Diabetic angiopathies;Interleukin-6;Polymorphism,single nucleotide以糖尿病足为主要代表的下肢血管病变重要的影响，可能也是并发的危险因素故本研究拟vasculardiseaseof T2W VDLElowerextremities,VDLE是2型糖尿病T2DM常见并发症之一，常观察IL-6启动子-572C/G和-597G/A基因多态性分布特点，探讨其可造成肢端坏疽，严重影响患者的生存质量T2DM合并VDLE与T2DM并发VDLE的关系的发病机制仍不十分清楚，有研究认为可能与免疫异常有关，由资料与方法1免疫紊乱诱发的炎症反应引起炎症因子如的表达和活性I],IL-6一般资料根据中国型糖尿病防治指南版的诊断标准，
1.122007增加，造成血管损伤是介导免疫反应和急性反应的重要递IL-6非随机选取年月一年月在天津医科大学总医院住院2008220091质，可促进多种细胞的增殖和分化，是反映炎症病变严重程度的的患者例，均为中国北方地区汉族人，相互间无血缘T2DM280重要指标之一而遗传因素如启动子基因的多态性对在体
[3]IL-6o关系其中男例，女例；年龄岁；体质指数内的表达和活性有着
13015058.3±
0.6bodymass index,BMI为
24.8±
0.2kg/m2根据血管彩色多普勒超声检查结果，动脉内膜增厚血管管壁毛糙、欠光滑，有粥样2L0mm,作者单位天津市，天津医科大学总医院内分泌科300052斑块及管腔狭窄和闭塞，可诊断为将患者分为VDLEo VDLE通讯作者邱明才，天津市，天津医科大学总医院内分300052组例和下肢血管正常组组，例另选取泌科；141N0R139E-mail:mingcaiqiu@sina.com.enC OIPChinese GeneralPractice•1532•-黑唠燎吟皴瞬瞬«年月一年月社区健康查体正常的人群例作为膜病变病史者所占比例均显著高于组，差异有统计学意义2008122009170NOR对照组（CON组）VDLE组、NOR组和CON组受检者的性别、（P
0.05,见表1）年龄间有均衡性组吸烟率及有冠心病、脑血管病、视网VDLE表组、组和组受检者的一般情况1VDLE NORCONTable1The generalconditions ofsubjects inVDLE,NOR andCON group组另IJ例数性别（男/体质指数吸烟冠心病病史脑血管病病史（n视网膜病变病史（n女）年龄（岁）病程（年）（kg/m2）（%））（%））VDLE组14170/
7159.8±
1.
29.7±
0.
924.8±
0.
54431.
27956.0*
2517.
75841.D，NOR组13967/
7257.4±
1.
39.4±
0.
824.7±
0.
42719.
43525.
2128.
62115.1CON组7034/
3659.7±
1.
3024.2±
0.
41724.3000注与组比较，NORP
0.
051.2试剂及仪器DNA提取试剂盒、PCR反应试剂均由大连宝生为193bp和128bp两个片段；杂合突变型（GA型）酶切产物为321物工程有限公司生产；低温高速离心机为日本日立公司生产；PCRbp、193bp和128bp3个片段（见图2）扩增仪为美国公司生产；紫外分光光度计为美国Perkin-Elmer
1.
3.3测定血清IL-
6、IL-6R和高敏C反应蛋白（hs-Beckman公司生产；紫外凝胶分析系统为北京华电计量开发公司CRP）水平从3组受检者中随机选取90例患者和对照者，包括生产；IL-6和IL-6受体（IL-6R）的ELISA检测试剂盒为美国TPI公VDLE组38例，NOR组32例，CON组20例分离血清，采用ELISA司生产法测定、和水平IL-6IL-6R hs-CRP方法
1.
31.4统计学方法正态分布的计量资料以（土s）表示，均数比较应提取组受检者均取空腹静脉血抗凝，
1.
3.1DNA33ml,EDTA-80℃用单因素方差分析或检验（两组间比较）率的比较采Students t保存，提取外周血基因组用分光光度计分别测和DNA,260nm280用x2检验对各研究的基因型分布进行Hardy-Weinberg（H-W）遗nm的吸光度值（0D值），并计算DNA纯度和浓度传平衡检验基因型与等位基因频率采用频率计数法计算，组间
1.
3.2基因分析采用PCR-RFLP法测定IL-6启动子区-572C/G基因型和等位基因频率比较采用x2检验所有数据采用SPSS
11.5和-597G/A基因多态性IL-6启动子-572C/G上游引物统计软件包进行处理，双侧检验，PV
0.05为差异有统计学意义5-AGAGAGCAAAGTCCTCACTG-3;下游引物52结果-ATGTTCTGAACTGAGTTTCC-3,;-597G/A上游引物5,
2.1IL-6启动子-572C/G及-597G/A的基因型及等位基因频率分布3-AAGTAACTGCACGAAATTTGAGGG-3;下游引物5-组受检者IL-6启动子-572C/G的基因型及等位基因分布频率间差异有统计学意义（P«.05）;VDLE组和NOR组的基因型CG和GG及AAGTAACTGCACGAAATTTGAGGA-3,引物均由大连宝生物工程o等位基因分布频率显著高于组，差异有统计学意义G CON有限公司合成（P
0.05）;VDLE组又显著的反应体系缓冲液-572C/G PCR10XPCR
2.5P1,10高于NOR组（P
0.05,见表2）上下游引物各模板mmol/LdNTP
4.0n1,lul,DNA1n1,组受检者启动子的基因型及等位基因分布频率31-6-597G/ATaq DNA酶（5U/ul）
0.2ul,加水至25ulo PCR反应条件为94℃预间差异亦有统计学意义（P
0.05）;VDLE组及NOR组的基因型GA变性变性退火次循环后延伸5min,94℃40s,58℃1min,3572℃5及等位基因A分布频率与CON组比较，差异有统计学意义（P
0.05）,mine而组基因型及等位基因分布频率与组比较，差VDLE GA A NOR的反应体系缓冲液〜597G/A PCR10X PCR
2.5u1,10异无统计学意义lx值分别为
0.084和
0.805,P
0.05,见表2）上下游引物各模板酶mmol/LdNTP
4.0n1,1u1,DNA1u1,Taq DNA血清、和水平比较组和组血清、
2.2L-6L-6R hs-CRP VDLENOR IL-6（5U/ul）
0.2ul,加水至25ulo PCR反应条件为95℃预变性5min,95℃和水平均显著高于组，差异有统计学意义L-6R hs-CRP CON变性退火℃延伸次循环后延伸30s,50℃30s,7250s,3572c7min（P
0.05）;VDLE组上述指标亦显著高于NOR组，差异有统计学意启动子区-和-的产物用的琼脂IL-6572C/G597G/A PCR
1.5%义（P
0.05,见表3）糖凝胶电泳鉴定后,分别用限制性内切酶和于消化BsrBI FoKI37c启动子和-不同基因型和等位基因频率的
2.3IL-6-572C/G597G/A左右，用的琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外凝胶成像分2h2%TBE血清、和水平比较IL-6IL-6R hs-CRP IL-6析仪上观察扩增结果，拍片存档启动子的扩增IL-6-572C/G PCR启动子-基因型组血清和水平显著高于基因572C/G GGTL-6L-6R目的片段大小为321bp,酶切后应产生2个等位基因（C与G）及3型组，等位基因组血清和水平显著高于等位基CC GIL-61L-6R种基因型野生型（CC型）是321bp;纯合突变型（GG型）是207bp因组，基因型组血清水平显著高于基因型组，差C GGIL-6R CG和114bp;杂合突变型（CG型）是321bp、207bp和114bp（见图Do异均有统计学意义（P
0.05）而血清hs-CRP水平在不同基因型及IL-6启动子-597G/A的PCR扩增目的片段大小为321bp,野生型（GG等位基因组间差异无统计学意义型）酶切产物为321bp一个片段；纯合突变型（AA型）酶切产物・1533•启动子等位基因组血清水平显著高于等位基因组，差异有统计学意义P
0.05o IL-6-597G/AAL-6G P
0.05,见表4o表组受检者启动子-和-的基因型和等位基因频率分布23IL-6572C/G597G/A n%Table2Thegenotypeandalleleof TL-6promoter-572C/G and-597G/A inVDLE,NOR andCON group基因型I，启动子-572C/G L-6启动子-597G/A组另IJ例数等位基因基因型等位基因CC CG GGCGGGGA AAG AVDLE组
1413323.
47653.9*A
3222.7*A
14250.
414049.6*A
10172.
33323.47⑸
023583.
34716.7NOR组
1395136.
76647.5*
2215.8*
16860.
411039.6*
9870.
53525.2*
64.
323183.
14716.9*CON组
703854.
32637.
168.
610272.
93827.
16288.668,
622.
813092.
9107.Dx2值
19.
04817.
79612.
15215.001P值
0.
050.
050.
050.05注与组比较，与组比较，CON*P
0.05;NOR4P
6.os表组受检者血清「和及水平的比较33I6IL-6R hs-CRP Z±sTable3The serumIL-6JL-6R andhs-CRP inVDLE,NOR andCONgroup
2.000bp_____1IL-6IL-6R组别例数hs-CRPu mol/L umol/L mmol/L1000bp750bp-VDLE组
3827.7±
1.6*A
224.4+
10.2*
45.8±
0.4*ANOR组
3213.2±
1.1*
157.3±
10.5*
4.3±
0.5*500bp―CON组
20118.0±
5.
77.4±
0.
93.2±
0.4F值
31.
11220.
3417.134250bp------P值
0.
050.
050.05注与组比较,与组比较，CON P
0.05;NOR T
0.05lOObp-表启动子-和-不同基因型和等位基因频率的血清4IL-6572C/G597G/A、和水平比较IL-6IL-6R hs-CRP x±sTable4The relationshipof thelevel ofserumIL-
6、II-6R andhs-CRP胶电泳结果with thepolymorphismofIL-6promoter-572C/G and-597G/AFigure1The agarosegel electrophoresisof thePCR amplificationoutputIL-6IL-6R hs-CRPof IL-6promoter-572C/G weredigested byBsrB IHmol/L umol/L mmol/LIL-6启动子-572C/G讨论3基因型CC
2917.6±
1.
6183.4+
10.
44.4±
0.4患者发生的原因仍不十分清楚，其病变特点主CG41198±
15199.3±
10.0T2DM VDLD4l±03要是动脉粥样硬化和中膜钙化动脉粥样硬化起病早、进展快，CC
2023.9±
1.7*
241.5±
10.7*A
4.3±
0.4易累及远端动脉，尤其是下肢胫腓动脉口，其主要原因目前认为等位基因C
9918.5±
0.
9190.0±
6.
04.3±
0.2G
8121.8±
1.0*
220.1±
6.7*
4.2±
0.2与胰岛素抵抗及非酶糖基化有关动脉中膜钙化以踝部常见，6TL-6启动子-597G/A可能与钙磷代谢异常、血脂代谢紊乱、神经病变、吸烟、饮酒等基因型GG
7516.5±
1.
0178.5±
7.
24.l±
0.2因素有关，肾功能受损的患者也易发生7-8］血管钙化也是炎性GAll
20.9±
3.
6193.6±
15.
44.8±
0.6因子启动的一种程序性成骨过程是一种多功能的细胞因9o IL-6AA
424.8±
1.
8202.5±
41.
55.6±
0.5子，在免疫、造血、神经等系统和肝脏中均起重要作用作为IL-6等位基因G
16116.8±
0.
74.2±
0.
2179.6±
4.8代表性的炎性因子，也是发生糖尿病的独立危险因素，与下肢动A
1922.5±
2.
2197.4±
14.
15.l±
0.4脉粥样硬化和中膜钙化也密切相关口合并患者、T2DM VDLDIL-6注与基因型组比较，〈与基因型组比较，00*P
0.05;CG AP与等位基因组比较，与等位基因组比较，
0.05;C*P«.05;G
0.05注道为恒心改,道为基因型/；道为基1DL2000DNA23因型道为基因型G/C,4G/G图启动子的扩增产物酶切产物琼脂糖凝1IL-6-572C/G PCRBsrBI
2.000bp-在传统治疗基础上，还应进行必要的抗炎和抗免疫治疗当然，IL-6在T2DM并发VDLE中的致病机制非常复杂，还需要更深入、长1000bp期和多学科的联合研究750bp500bp参考文献1Deshpande AD,Haris-Hayes M,Schootman M.Epidemiology of250bp diabetes and diabetes-related eomplications[J].Phys Ther,2008,88注1道为DL2000DNA\匕心2心2道为基因型6/6,3道为基因11:1254-
1264.2邱明才，孟春梅，糖尿病并发症发病过程中的补体活化作用[J].型G/A,4道为基因型A/A中华内分泌代谢杂志，2006,223:303-
305.图21-6启动子-597G/APCR扩增产物FoKI酶切产物琼脂糖凝胶电3Kristiansen OP,Mandrup-Poulsen T.Interleukin-6and diabetes:thegood,the bad,or theindifferent[JJ.Diabetes,2005,5412:S114-
124.4Duval M,Altman JJ.When shouldultrasonography beused todetect a-100bpsymptomatic carotidatheroma indiabetic patients[J].DiabetesMetab,2006,326:638-
642.5Mostaza JM,Suarez C,Manzano L,et al.Sub-clinical vasculardiseasein type2diabetic subjects:relationship withchronic complicationsof泳结果diabetesandthe presenceof cardiovasculardisease riskfactors[J].Eur JIntermMed,2008,194:255-
260.Figure2The agarosegel electrophoresisof thePCR amplificationoutput6Rahman S,Rahman T,Ismail AA,et al.Diabetes-associatedof IL-6promoter-597G/A weredigested byFoK Imacrovasculopathy:pathophysiology andpathogenesis[J].DiabetesObes Metab,2007,96:767-
780.CRP等均大量表达IL-6还在胰岛素抵抗、脂代谢紊乱、肥胖、7Belovici MI,Pandele GI.Arterial mediacalcification inpatients withtype2diabetes mellitus[J].Rev MedChir SocMed NatIasi,2008,痛风、高血压中起着重要作用10T2］这些疾病也都是T2DM发生1121:21-
34.VDLE的促进因素IL-6启动子区的基因多态性可影响基因转录和8Jayalath RW,Mangan SH,Golledge J.Aortic calcification[J].Eur J翻译，改变IL-6的表达，导致与其相关疾病的发生，使其成为一Vase EndovaseSurg,2005,305:476-
488.9郑少雄，杨小清，杨正强.动脉钙化及其调节机制与骨代谢的关些疾病的易感因子同时Z IL-6水平受许多病理学和生理学条件系二一一炎症、氧化应激和内分泌激素的作用[J].国际内分的影响，所以单纯检测血清1-6水平不能预测个体的疾病而从泌代谢杂志，2006,265:303-
311.遗传学角度如检测启动子区的基因多态性，可避免多种外界因素10Eder K,Baffy N,Fai usA,et al.The majorinflammatory mediator的干扰和影响，对于预测疾病可能更有意义interleukin-6and obesity[J].Inflamm Res,2009,5811:727-
736.11吴伟华，于江波，智红.肿瘤坏死因子-Q和白介素-6在2型糖目前\关于16与糖尿病大血管病变的研究主要集中在心脑血尿病大血管病变中的预测价值[J].中国全科医学，2007,1020:管病变，而对IL-6与T2DM并发VDLE关系的研究相对较少本研
1678.究结果显示，血清1-
6、IL-6R和hs-CRP水12Kampoli AM,Tousoulis D,Antoniades C,et al.Biomarkers ofprematureatherosclerosis[J].Trends MolMed,2009,157:323-
332.平与T2DM有关，尤其与T2DM并发VDLE关系更密切有研究发现13Tso AR,Merino JG,Warach S.Interleukin-6174G/C polymorphismandIL-6启动子-572C/G和-597G/A基因多态性与动脉阻塞性疾病显ischemic stroke;a systematicreview[J].Stroke,2007,著相关本研究结果发现，IL-6启动子-572C/G基因型GG和CG以及3811:3070-
3075.14付海霞，李庚山，李艳，等.白细胞介素6基因-572C/G多态性等位基因G可能是T2DM合并VDLE的易感基因而IL-6启动子-与心肌梗塞关联性的研究[J].中华医学遗传学杂志，2006,233:597G/A的基因型GA和等位基因A是T2DM的易感基因，但可能与245-
249.T2DM并发VDLE无关收稿日期2010-02-13;修回日期2010-04-18本文编辑刘莉T2DM慢性并发症的发生也是一个多因素、多步骤的慢性过程，是内因和外因综合作用的结果基因缺陷是内因，而内分泌免疫网络调节失控是外因糖代谢紊乱造成大量代谢产物累积可导致机体免疫功能异常，由此导致代谢性炎症的发生因此免疫和炎症可能是T2DM慢性并发症发病机制之一研究T2DM并发VDLE的发病机制，对于早期诊断和治疗糖尿病足，预防和延缓病变的发生和发展具有重要的意义长期以来，对T2DM的治疗均是以降低血糖为主要目标随着对T2DM认识的不断深入，人们发现血糖控制良好并不能延缓T2DM并发症的发生，尤其是大血管并发症的发生迫使人们将关注的重点转向免疫和炎症本研究结果还发现，1-6启动子-572位点GG型和等位基因G与血清IL-6和IL-6R高水平有关；-597位点等位基因A与血清IL-6高水平有关，可以认为IL-6作为一个炎症因子，其在基因水平的单核甘酸多态性与T2DM并发VDLE有密切关系这也为临床治疗T2DM及并发的VDLE提供新的治疗策略提示。
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