PPARγ激动剂对糖尿病大鼠载脂蛋白M分泌和表达的影响

激动剂对糖尿病大鼠载脂蛋白分泌和表达的影响PPAR MY屈晓冰’，赵水平高洁胡敏，董莉妮，张湘瑜2,3,1中南大学湘雅二医院老年病科，长沙中南大学湘雅二医院心内科，长沙L4100112410011;.第二军医大学附属长海医院，上海•中南大学湘雅二医院检验科，长沙3200433;4410011［摘要］目的研究高选择性过氧化物酶增殖体激活型受体丫PPARy激动剂罗格列酮rosiglitazone,RSG对糖尿病大鼠血清载脂蛋白水平和肝、肾、脂肪组织表达的影响方法雄性大鼠分为对照组组，、MapoM apoMniRNASD Conn=7高脂组组，、糖尿病组组，和糖尿病干预组组，组实验模型建立前采血检测各组大HF n=8DM n=7RSG RSGn=74鼠空腹血糖、空腹胰岛素、三酰甘油、总胆固醇糖尿病大鼠模型的建立参照周氏等方法，给予FBG FINSTG TC高脂高糖饲料喂养、腹腔注射链胭佐菌素应用对糖尿病大鼠干预治疗周全部动物于实验第周结束时集RSG815中处死，搜集血标本和肝、肾、脂肪组织标本检测各组大鼠的血浓FBG,FINS,TG,TC度检测各组大鼠的血水平，并与血水平进行相关分析测定各组大鼠肝、肾、ELISA apoMFBG,FINS,TG,TC RT-PCR脂肪组织apoM mRNA的表达结果与Con组和HF组比较，DM组大鼠血清apoM水平明显降低P〈

0.05,RSG组大鼠的血清水平较组明显升高各组大鼠以肝组织的表达最高，肾组织次之，脂肪组织的表达最apoM DM P0・05apoM mRNA低与组比较，组、组和组的大鼠肝、肾、脂肪组织的表达明显减少组大鼠肝、Con HFDM RSGapoM mRNAP

0.05,RSG肾、脂肪组织的表达较组均有明显增加大鼠血清水平与血清厂-apoM mRNADMP

0.05apoM TG

0.466,P=

0.011,TCr=-

0.水平均呈显著负相关结论在血糖和血脂的代谢中起568,P=

0.001,FBGr=-

0.371,P

0.001,FINSr=-

0.768,P=

0.048ApoM着重要作用并受激动剂调节的影响PPARy［关键词］载脂蛋白M;PPARy;糖尿病；SD大鼠DOI:1Reduced expression and secretionof apolipoprotein Min fat-fed,streptozotocin-diabetic ratsis partiallyreversedby an artificial ligand of PPARyQU Xiaobing,ZHAO Shuiping；GAO Jie,HU Min:DONG Lini,ZHANG Xiangyu

1.Department ofGeriatrics,Second XiangyaHospital,Central SouthUniversity,Changsha410011;

2.Department ofCardiology,SecondXiangya Hospital,Central SouthUniversity,Changsha410011;

3.Changhai Hospital,Second MilitaryMedical University,Shanghai200433;

4.Department ofClinical Laboratory,Second XiangyaHospital,Central SouthUniversity,Changsha410011,ChinaABSTRACT Objective:To investigatethe effectof administrationofrosiglitazone,anartificialligandofPPARy,on theexpressionandsecretion ofapolipoproteinapoM in fat-fed,streptozotocin-treated rats,an收稿日期Date tfreception:2011-06-27作者简介Biography:屈晓冰，主任医师，博士，主要从事老年L血管疾病的研究通信作者Corresponding author:屈晓冰，Email:quxiaobingi@

163.com基金项目Foundation item:湖南省科技厅项目2009FJ3076This workwas supportedby thefund fromthe Departmentof ScienceandTechnology ofHunan Province,PR.China2009FJ

3076.animal modelfor type2-like diabetes.Methods:Healthy maleSD rats were dividedinto4groups:a controlgroupn=7,a high-fat chowgroupHF group,n=8,a diabetes mellitus groupDMgroup,n=7,and adiabetesmellitusgroup withrosiglitazoneintervention groupRSG group,n=

7.Fasting bloodglucose FBG,fasting insulinFINS,triglyceride TG and totalcholesterolTC weremeasured atthe beginningof thestudy.Thediabetic ratsmodel wasestablished byfeeding highfat chowand intraperitonealinjection ofstreprozotocin.Then therandomly selectedtreatment groupwas givenrosiglitazone bydaily gavagefor8weeks.All theratswerekilled atthe fifteenthweek,at whichtime bloodand tissuesliver,kidney,adipose werecollected andprepared.The levels ofFBG,FINS,TGandTC wereassayed.The level ofapoM inserum wasmeasured byenzyme-linked immunosorbentassay ELISA.Reverse transcriptionpolymerasechain reactionRT-PCR wasused todetermine apoM mRNA expressionin liver,kidney,and adipose tissues.Results:Compared witheither controlgroup orHFgroup,serum apoM concentration in the DMgroupwas reducedsignificantly P

0.05;compared withthe DMgroup,however,serum apoMconcentrationsin RSGgroup wereincreased P

0.

05.The expression of apoM mRNA inliver washighest,in kidneymedium,and inadiposetissueextremely lowP

0.

05.ApoM mRNA expression inliverand kidneywas decreasedin bothDM andHF groupscompared tocontrol groupP

0.

05.But,aswith serum apoMconcentration,apoM mRNAintheliver,kidney andadipose tissues of theRSG groupwereall increasedmarkedly P

0.

05.The levelof serumapoM inSD ratscorrelated negativelywithTG r=-

0.466,P=

0.011,TCr=-

0.568,P=

0.001,FBSr=-

0.371,P

0.00l,and FINSr=-

0.768,P=

0.

048.Conclusion:These resultssuggest thatapoM mayparticipate inthe glucoseand lipidmetabolism bytheregulation ofPPARy.apolipoprotein M;PPARy;diabetic mellitus;SD ratsKEYWORDS载脂蛋白属于脂质转运蛋白超家族成员链月尿佐菌素为美国公司M apoMstreprozotocin,STZ Sigma动物实验发现的缺失会导致血清的消失和产品，由北京博爱公司代理罗格列酮钠原粉为太极集apoM pre8-HDL异常大的颗粒的出现；在受体缺陷小鼠，腺病团重庆涪陵制药有限公司产品抗单克隆抗体HDL LDLapoM1E2,毒致肝的过度表达可使动脉粥样硬化病变明显减标记的抗单克隆抗体为湖南远泰生apoM HRPapoM HRP-8F12少提示可调节代谢，并具有抗动脉粥样硬物技术有限公司馈赠总抽提试剂盒apoM HDLRNA RNAisoReagent化的作用罗格列酮属于曝唾烷二酮类药物，是一种人为宝生物工程大连有限公司产品Takara Taq DNA工合成的高选择性过氧化物酶增殖体激活型受体丫为加拿大公司产品，由深圳中晶生物Polymerase Fermentas的激动剂，可通过活化参与脂类代谢，维技术有限公司代理购自上海英骏生PPARy PPARyGeneRuler DNALadder持内环境脂质和能量代谢平衡，保护胰腺B细胞功能和物技术有限公司RT-PCR试剂盒为德国QIAGEN生物公改善胰岛素抵抗能增加载脂蛋白和司生产3o PPARyAlapoAl合成，促进胆固醇的逆转运，加速胆固醇转运至肝HDL进行代谢但是，与血糖、血脂的代谢究竟有无关apoM

1.2大鼠糖尿病模型的建立及药物干预联，其合成是否受调控知之甚少本研究探讨糖PPARy只月龄健康雄性大鼠，购自中南大学湘雅402SD尿病大鼠血清的分泌、肝肾脂肪组织的apoM apoM mRNA二医院动物实验中心湖南省实验动物管理委员会，合表达以及激动剂罗格列酮对表达的影响，PPARy apoM格证号号，环境设施合格证号，体质量0001028250±20g,旨在进一步揭示apoM的生理功能及其在相关疾病中的每笼8只喂养，普通级饲临床意义养环境，环境温度昼夜规律，自由进水，材料与方法20~25℃,12h/12h1于上午时及下午时各投食次大鼠适用环境周，8511禁食10h后记录体质量（WT）并抽血进行基线空腹血糖

1.1主要试剂（FBG）、空腹胰岛素（FINS）、划线部分Bam HI酶切位点），下游三酰甘油（TG）、胆固醇（TC）测定然后随机选8只大鼠5,-CCGCTCGAGGTTATTGGACAGCTCACAGG-3，（下作为对照组（Control,Con组，n=8）,予以普通饲料喂养；划线为Xhol酶切位点），PCR产物为25Obp片段内对其余32只给予高糖高脂饲料喂养，配方参考周氏等4的照基因（GAPDH）引物序列上游S，方法，高糖高脂饮食喂养周后，再随机选只大鼠作下游48-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3,,为高脂组（hightfat chow,HF组，n=8）,其余24只给以腹腔注产物为S-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3,PCR486射建立糖尿病动物模型，以连续次空腹血糖均STZ,310片段反应体系为缓冲液bp PCR10XPCR2uL,2mmol/LdNTP作为糖尿病模型制作成功的标准，注射后mmol/L STZ2混合液下游引物各反转2u L,25mmol/LMgCl2u L,±

0.5uL,周只大鼠血糖趋于稳定取罗格列酮钠原粉溶220100mg录产物聚合灭菌水补足至luL,TaqDNAB

0.5u L,20uL ApoM于蒸储水中，制成浓度为的溶液，置于100mL Img/mL4c反应条件为预变性扩增循环为变性94℃3min;94℃冰箱中备用将20只糖尿病大鼠随机分成糖尿病组（DM退火延伸循环次；最后延伸30s,60℃30s,72℃45s,3072℃组，n=10）和罗格列酮治疗组（RSG组，n=10）,RSG组每日结果通过图像分析系统进行半定量分析Smino PCR给予RSG溶液4mL/（kg・d）灌胃，Con组、HF组及DM组每日给予等体积蒸储水灌胃，成模后均未使用胰岛素及其他降糖药物，每周测定次及观察周后，将

1.6统计学处理21WT FBG,8各组大鼠统一处死经适应性喂养、高糖高脂饲料喂养、所有数据均输入统计软件包进行统计分SPSS

13.0注射，再到干预，周内完成所有动物实验析，对主要指标进行正态性检验，计量资料采用均数土STZ RSG15标准差（士s）表示组间的比较应用one-way ANOVA分析，组间两两比较采用法相关性检验采用直线相关分SNK

1.3标本的采集及生化指标的测定析检验水准双侧为差异有统计学意义a=

0.05,P

0.05动物实验结束时，集中处死动物，搜集血标本和主要实验数据来自次以上重复实验3肝、肾、脂肪组织标本检测各组大鼠的FBG,FINS,TG,TC和血清的水平即动物过夜禁食后，记录apoM10h WT,结果腹腔注射10%水合氯醛溶液（2mL/kg）麻醉后充分暴露手2术视野，经大鼠的腹主静脉取血留取血标本，3000r/min

2.1大鼠基线资料与糖尿病大鼠模型的建立离心留取上清液置于-冰箱中待测；留取肝、10min,70℃肾及肾周脂肪组织各lOOmg,放入

1.5点冻存管内，迅速40只SD大鼠进入实验，在实验过程中共死亡7只置于液氮中冰冻，然后转入-70°C超低温冰箱，以备RNA（Con组死亡1只，DM组和RSG组各死亡3只），有4只抽提大鼠糖尿病造模未成功退出实验，最后完成实验的29只大鼠，其中组只，组只，组只，Con7HF8DM7RSG组只各组大鼠之间基线等指7SD WT,FBG,FINS,TG,TC

1.4ELISA检测血清apoM水平标比较，差异无统计学意义（P

0.05）糖尿病大鼠造模成选择测定大鼠血清水平，具体步骤如ELISA apoM功后，逐渐出现毛发欠光泽、色黄，精神不振，反应迟下根据棋盘滴定结果，选择浓度包板，lE25mg/L150UL/钝，活动度差，抓持反抗的能力明显减弱，抓起时出现孔过夜；甩尽板内液体，用洗涤反应板（每4C pH

7.4TBST明显排便反应，尾部受压易出现受伤并感染，剪尾采血孔内加入的洗涤液），并去除水滴；反复洗涤350UL3测血糖后逐渐出现不同程度的溃烂、坏疽，而组的RSG次;每孔加入夏孔,下封闭洗板次；BSA300PL/37℃2h,3大鼠反抗能力较组稍有改善DM每孔加不同浓度的标准蛋白和血清标本（样本稀100UL释液倍稀释），孵育洗板次；每孔加1:5037℃lh;3100P LHRP标记的抗体，孵育洗板次；加入显色8F1237℃lh,3TMB液100UL,37℃避光显色15min;每孔加50uL硫酸（2mol/L）中止反应；读D（450nm）值并作出标准曲线，根据标准曲线计算血清标本浓度apoM

1.5RT-PCR检测组织apoM mRNA表达检测大鼠肝、肾、脂肪组织中的RT-PCR apoM mRNA表达，参照总提取试剂盒说明书提取肝、肾、TRIzol RNA脂肪组织总基因引物序列上游RNA,apoM5,（下-CGCGGATCCTTCCACCAAATTTGGGCAGC-3，799各组大鼠血糖、血脂和血清的水平

2.2apoM与Con组比较，HF组、DM组和RSG组在动物实验结束时的表达，其中肝组织apoM mRNA的表达量最高，的TG,TC,FINS水平明显升高（P

0.05）DM组和RSG组的o肾组织次之，而脂肪组织的表达量最低与Con组相比，HF组、FBG和apoM水平较Con组或HF组明显升高（P

0.05）DM组DM组和RSG组大鼠肝、肾、脂肪组织apoM mRNA的表达明显大鼠血清apoM水平较Con组下降

65.4%;RSG组与DM组的大鼠减少（P

0.05）;DM比较，apoM水平亦有明显升高（P

0.05;表1,图1）组大鼠肝组织中apoM mRNA表达较Con组下降

41.4乳肾组织中apoM mRNA表达较Con组下降

22.9%o而RSG组的大鼠肝、肾、

2.3各组大鼠肝、肾、脂肪组织apoMmRNA的表达脂肪组织apoM mRNA的表达较DM组均有明显增加（P

0.05;表2,各组大鼠的肝、肾、脂肪组织均有apoM mRNA图2）表组大鼠的血脂、血糖和胰岛素的水平土14x sTable1Level ofserum TG,TC,FBS andFINS in rats ofthe4groups±s指标n T/g TG/mmol/L TC/mmol/L FBG/nimol/L FINS/mmol/LCon组

7393.40±

36.

920.47±

0.

141.51+

0.

172.49+

0.

310.55±

0.18HF组

8465.18±

52.00L82±

0.73L93±

0.

586.86+

2.

311.59±

1.16D M组

7309.40±

26.81*

2.01±

0.

332.33±

0.30°

21.59±

7.6s*

1.99±

0.67RSG组

337.06±

59.71*

1.71±

0.

342.21±

0.

1820.7s±

4.97*

1.34±

0.34J7WT:体质量；FBG:空腹血糖;TG:三酰甘油;TC:总胆固醇;FINS:空腹胰岛素与Con组比较，P

0.05;与HF组比较,,P

0.05oCon组

71.43±

0.

090.54+

0.

040.19+

0.02HF组

80.82±

0.

060.39±

0.05，

0.16±

0.05DM组

70.89±

0.

040.38±

0.

040.12±

0.01RSG组

70.96±

0.05*A

0.44±

0.05*A

0.14±

0.02*A与Con组比较，P

0.05;与HF组比较，P

0.05;与DM组比较,P

0.05o血清水平与血脂、血糖和胰岛素水平的相关性

2.4apoM将大鼠的血清水平与和水平apoM TG,TC,FBG FINS图14组大鼠的血清水平比较x士so与Con组比较，apoM进行相关分析，结果显示与apoM TGr=-

0.466,P=

0.P

0.05;与HF组比较，PVO.OS;与DM组比较,下

0.05亦水011,TCr=-

0.568,P=

0.001,FBG r=-

0.768,P

0.001,FINSFigure1Comparison oflevels ofserumapoMin ratsamoi^the4groupsx±s.*P

0.05vs control;P

0.05vs HF;AP

0.05vs DM.GAPDHApoMCon组HF组DM组RSG组图示洲在组大鼠肝、肾、脂肪组织中的表达2RT-PCR apoWrfA4Figure2RT-PCR showingthe apoMmRNAexpressionin ratstissues ofthe4groups.表组大鼠组织的相对表达量24apoKhRNA x±s平厂-均呈显著负相关

0.371,P=0,048Table2Relative expressionlevelofapoMmRNAinratstissuesofthe4groups x±s组别n肝肾脂肪3讨论apoM可能为动脉粥样硬化的保护因子本研究的结果揭示在血糖和血脂的代谢中起着重要的作用并受apoM本实验发现各组大鼠肝组织的表达水激动剂调节的影响apoMmRNAPPARy平最高，肾组织次之，而脂肪组织最低有报道人与小鼠的有的同源性，与大鼠有的同源性；在apoM79%82%人类和小鼠，基因主要在肝中表达，其次是apoMmRNA参考文献肾,其他的组织表达很apoMmRNA低在肝和肾特异性表达于肝实质细胞和肾小56ApoM管上皮细胞，具有高度的组织特异性本实验还发现，

1.Nielsen LB.Christoffersen C,Ahnstrdm J,et al.ApoM:gene regulationandeffects onHDL metabolismfJ].Trends EndocrinolMetab,2009,202:组大鼠血清水平与肝、肾和脂肪组织DM apoM apoMmRNA66-

71.表达较组均明显下降等的动物实验也表明，Con Xu糖尿病小鼠血浆水平较对照小鼠下降肝和肾

2.Wolfrum C,Poy MN,Stoffel M.Apolipoprotein Mis requiredfor preP-HDLapoM70%,formation andcholesterol effuxto HDLand protectsagainst组织表达分别下降apoM mRNAatherosclerosis[JJ.Nat Med,2005,114:418-

422.和而外源性胰岛素注射可增加血浆水平及40%20%;apoM肝、肾apoMmRNA的表达，部分逆转apoM的

3.Rangwalla SM,Rhoades B,Shapiro JS,et al.Genetic modulationof PPARgammarphosphorylation regulatesinsulin sensitivitylJJ.Dev下调在人体实验中，等证实成年发病的青春晚Richer8Cell,2003,84:657-

663.期糖尿病病人与正常人和血糖控制良好M0DY3的糖尿病人相比，血浆水平下降，提示低水平周迎生，高妍，李斌，等.高糖喂养联合链胭佐菌素注射的糖尿apoMapoM

4.病大鼠模型特征中国实验动物学报，国可引起糖代谢的紊乱，增加患动脉粥样硬化的易感性[J],2005,133154-

159.本实验发现高选择性激动剂罗格列酮可上PPARyZHOU Yingsheng,GAO Yan,LI Bin,et al.A ratmodel oftype2diabetes调糖尿病大鼠血清水平和肝、肾、脂肪组织apoMmellitus inducedby highfiat chowand lowdose streptozotocin的表达，推测这一结果与的作用有关，apoMmRNA PPARyinjection[J].Acta LaboratoriumAnimalis ScientiaSinica,即合成受影响调控以往的研究发现apoM PPARyapoM2005,133:154^

159.的表达和分泌受多种生物因子的调节瘦素缺陷小鼠和瘦素受体缺陷小鼠表达减少，给

5.Faber K,Axler O,Dahlback B,Nielsen LB.Characterization ofapoM inob/ob db/db apoMob/ob小鼠注射瘦素可使表达增加其他与脂蛋白代谢有normal andgenetically modifiedmice[JJ.J LipidRes,2004,457:1272-apoM9;

1278.关的基因，如和肝脂酶基因也在apoAI,apoAII,apoAIV ob/ob小鼠中表现出类似的瘦素依赖性，用瘦素处理小鼠也可

6.Zhang XY,Jiao GQ,Hurtig M,et al.Expression patternof apolipoprotein M使他们的表达增加由此表明，瘦素在体内是合成during mouseand humanembryogenesislJ].Acta Histochem,2004,1062:apoM的调节因子在肝癌细胞系中，血小板活化因子123-

128.HepG2可刺激基因的表达，而受体拮抗剂PAF apoMPAF

7.Xu N,Nilsson-Ehle P,Ahren B.Suppression ofapolipoprotein M expression对表达和蛋白合成具有较lexipafant apoMmRNAapoM andsecretion inalloxan-diabetic mouse:Partial reversalby insulinfJl.强的抑制作用［10Xu等在研究中还发现与正常对照Biochem BiophysRes鼠相比，在四氧喀咤糖尿病鼠中的表达和分NMRI apoMCommun,2006,3424:l174-

1177.泌显著降低，注射胰岛素后，鼠血糖下降，血中NMRI apoM浓度和肝、肾组织中的表达水平升高因此，apoMmRNA

8.Richter S,Shih DQ,Pearson ER,et al.Regulation ofapolipoproteinMgene胰岛素也是体内合成和表达的生理调节因子此外，apoM expressionby MODY3gene hepatocytenuclear foctor-1alpha:还受胰岛素样生长因子的haploinsuffciency isassociated withreduced serumapolipoprotein MapoMinsulinTike growthfactor,IGF调节，而肿瘤坏死因子和白介素-对levels[J].Diabetes,2003,5212:2989-

2995.TNF-a1a ILTa表达无作用apoM

9.Xu N,Nilsson-Ehle P;Hurtig M,et al.Both leptin and leptin-receptor are在本研究中笔者观察到大鼠apoM水平与TG,TC,FBG essentialfor apolipoproteinMexpressionin vivo[J].Biochem BiophysRes和水平均呈显著负相关已有较多的研究发现，血Commun,2004,3214:916-

921.FINS浆的水平与血液中有关血脂水平存在相关性笔者apoM

10.Xu N,Zhang XY,Dong X,et al.Effects ofplatelet-activating factor,tumor也观察到冠心病患者血浆中与呈明显的正相apoM IIDL-C necrosisfactor;and interleukin-lalpha ontheexpressionofapolipoproteinM关，而与LDL-C和Lpa呈明显的负相关［12］,提示apoM参in HepG2cells[J].Biochem BiophysRes Commun,2002,2924:944-

950.与体内的胆固醇代谢另一项研究［3］发现在冠心病患者

11.Xu N,Hurtig M,Zhang XY,et al.Transforming growthfactor-beta中血浆水平明显低于对照组，血浆水平与冠apoM apoMdown-regulates apolipoproteinMinHepG2cells[J].Biochim Biophys状动脉病变数量、病变程度呈显著负相关，进一步支持Acta,2004,16831/3:33-

37.HU Zhigao,QU Xiaobing,HU Min.Relationship betweenconcentrations of胡志高，马琼珍，屈晓冰.冠心病患者载脂蛋白水平与瘦素

12.Mapolipoprotein mand coronaryartery lesions[J].Chinese Journalof和血脂的相关性中国热带医学，[J].2010,104:458-

459.Arteriosclerosis,2008,163:224-

226.HU Zhigao,MA Qiongzhen,QUXiaobing.Correlation oflevel ofapolipoproteinM withleptinandlipids incoronary heartdisease patientsfJ].China TropicalMedicine,2010,104:458-

459.（本文编辑郭征）胡志高，屈晓冰，胡敏.勃旨蛋白与冠状动脉病变的关系印.

13.M中国动脉硬化杂志，2008,163:224-

226.。