不同的冻存方法对I型糖尿病患者胰岛抗原特异性T细胞反应的影响

中南大学学报医学版不同的冻存方法对型糖尿病患者胰岛抗原特异性I细胞反应的影响T杨琳，超晨，唐维，王臻，俞海波，崔秋燕，周智广中南大学湘雅二医完内分泌科，中南大学糖尿病中心，中南大学代谢内分泌研究所，糖尿病免疫学教育部重点实验室，长沙410011［摘要］目的明确何种冻存方案更利于保持型糖尿病患者的外周血单个核细胞1peripheral blood mononuclear cells,PBMCs对胰岛抗原特异性的细胞反应，更接近于新鲜细胞的状态方法本研究系国际免疫学协会细胞工作组牵头T-T IDS-TCW的国际标准化研究中南大学糖尿病中心选取例新发的患者和年龄、性别相匹配的例正常对照所有对Freezing StudyL5TID5象新鲜分离的分为份，一份进行亚型细胞的流式细胞分析和酶联免疫斑点实验PBMCs3enzyme linked immunospot assay,ELISPOT,另两等份分别采用低温和室温冻存方案冻存；个月后分别按低温和室温方案复苏，以台盼蓝染色判定细胞活力；并行流1式细胞分析术和检测中种抗原［包括人、内对照、巴斯德五合一疫苗和均由ELISPOT ELISPOT4GAD65Pediacel PMA］中心化实验室盲法标记，盲法测定以新鲜IDS-TCW为参照，比较两种冻存方案下的复苏率和活力、各亚型细胞比例和检测结果结果室温冻存下PBMCs PBMCsELISPOT1的复苏率和细胞活力均略高于低温冻存方案，但二者差异无统计学意义分别为⑵PBMCs

61.2%vs

60.1%,

77.5%vs

74.9%;P

0.05相比新鲜细胞，两种冻存方案均会造成一定程度的单核细胞的损失低温和⑶室温新鲜；［

3.2±L1%0±

0.9%vs

7.0±Ll%而细胞,细胞和细胞比例均无明显变化检测结果显示对多克隆刺激物诱PV

0.05］;CD4T,CD8T,B NKNKT P

0.05;3ELISPOT PMA发的细胞分泌丫的反应，在新鲜和冻存复苏细胞间无明显差异；记忆性抗原和胰岛抗原刺激下的特异T IFN-Pediacel GAD65性细胞反应在冻存复苏细胞均明显差于新鲜细胞，患者新鲜细胞的特异性细胞反应的为均高于低温T TIDGAD T SI

5.1,

1.3和室温冻存复苏的刺激指数均而且仅新鲜细胞的反应性细胞的和斑点数均明显高于正常对照

1.4SI PV

0.05;GAD-TSI

5.Ivs

0.而两种方案下的冻存细胞的在患者和对照未发现差异结论需要开展更多的研究，在患者中鉴定9^

8.Ivs

0.l,P

0.05,SI TID出一种更接近于新鲜反应的冻存方案和细胞测定方法PBMCs T［关键词］型糖尿病；细胞；冻存方案；酶联免疫斑点法1TEffect of cryopreservation methodon isletsspecificT cell responses in type Idiabetic patientYANGLin,CHAO Chen,TANG Wei,WANG Zhen,YU Haibo,CUI Qiuyan,ZHOU ZhiguangDepartmentofEndocrinology,Second XiangyaHospital,Cential SouthUniversity;Diabetes Center,Central SouthUniversity;Institute ofMetabolismand Endocrinology,Central SouthUniversity;Key LaboratoryofDiabetes Immunology,Ministry ofEducation,Changsha410011,China收稿日期Date ofreception:2012-08-11作者简介杨琳，博士，副主任医师，主要从事自身免疫糖尿病发病机制和诊断研究Biogmphy:通信作者周智广，Correspondingauthor:Email:zhouzg@hotmailcom基金项目国家自然科学基金湖南省科技厅社会发展科技支撑计划重点项目中南大学前沿Foundationitems:30400217;2010SK20⑰;研究计^1201023100001o Thiswork wassupported bythe NationalNatural ScienceFoundation ofChina3M00217,Science andTechnology Departmentof SocialDevelopmentand ScientificandTechnological SupportKey ProjetofHunan Province,P.R.China2010SK2007,Frontierresearchproject ofCentral SouthUni versity

201023100004.ABSTRACT Objective:To explorethe betterfreezing protocolto preserveperipheral bloodmonuclear cellsPBMCs,islets antigen-specificT cellsresponses compared with freshly isolated samplesin type1diabeticTlD patientsMethods:The T cell WorkshopCommittee of the Immunology of Diabetes SocietyIDS-TCW organizedtheFreezing StudyI andwe wereone ofthe9centers in the worldto participatein thestudy.According tothe twostandardizedT cellfreezing protocolswarm andcold to freshlyisolatedPBMCs interms ofrecovery viability,cell subsetcomposition FACSand performancein Enzyme-linked immunospotELISPOT assays,we choseSnewly onsetT1D patientsand Sage andsex matchedhealthy controls.Besides theprotocols,all the freezingreagents andantigens werealso centralized.The antigensused inELISPOT werelabeled blindedly.Results:1Although warm frozen-thawed Wsamples hada slightlyhigher recoveryrate

61.2%vs

60.l%,P

0.05and viability

77.5%vs

74.9%,P

0.05as compared with thecold frozenones C,the differencewas notsignificant.2Both protocolsled toa relativeloss inmonocytes ascomparedwiththe fresh samples F[

3.2±l.1%Cand

3.0±

0.9%W vs

7.0±l.l%F,both P

0.05],while othersubsets includingCD4T;CD8T,B cells,NK cellsandNKT cellsdidnt.3Freezing andfreshsamplesshowed similarIFN-r secretionresponses topolystimuli inELISPOT.Irrespective ofthefreezingprotocol,recall antigenPediacel andislet antigen-reactive responseswereboth lowerinthefrozen cellscomparedwithfresh PBMCs.The stimuliindex SIof GAD-specific T cell responseinthe freshsamples fromT1D patientswas

5.1,higher thanthat offrozen sampleswith eithercold protocol

1.3orwarm one

1.4both P

0.0s.Only freshsamples fromT1D showedsignificantly higherGAD-specific T cellresponses thanthe healthy controls nomatterin SI

5.1vs

0.9,P0,05or spot forming cells

8.1vs

0.l,P

0.05,whereas thefrozen samplesdid notshow suchdifference.Conclusion:More studiesare neededto verifya freezing method tobring comparableislets antigenspecific T cellresponses inT1D patientstofresh PBMCs.KEY WORDStype1diabetes;Tcell;freezingmethod;enzyme-linked immunospot目前已公认，1型糖尿病是T细胞介导的自身免和室温冻存对于PBMCs活力和功能的保存更为有利，目疫性疾病［1-2近年人们对于1型糖尿病免疫标志物前尚无定论IDS-TCW在既往的六届标准化研究均是围研究的注意力逐步从胰岛自身抗体转移到T细胞；因此绕新鲜分离的细胞展开的；因此，IDS-TCW在全球6个不管是1型糖尿病的机制探讨也好，还是干预治疗中的实验室开展了Freezing Studyl的标准化研究，旨在比免疫监测也好，T细胞检测都成为学者们重要的观察指较低温Cold,C和常温Warm,W两种冻存方法对标然而，虽然迄今检测胰岛特异性T细胞反应的方法1型糖尿病患者和正常对照的PBMCs亚群分布、复苏率、很多，但由于变异系数大，干扰因素多，导致结果一致活力以及酶联免疫斑点enzyme-linkedimmunospot,性和重复性仍较差；迄今为止该领域T细胞研究仅少数ELISPOT下T细胞功能的情况，并与新鲜PBMCs进行几项被国际糖尿病免疫学会T细胞工作组IDS-TCW证比较笔者所在的研究组作为亚洲唯一的实验室首次参实为有效可行的［3-5］,而且其使用的都是新鲜分离的与了该项研究，而目前关外周血单个核细胞peripheral bloodmononuclear于这方面的研究尚未见报道cells,PBMCs然而，由于在临床试验中不但很难应用o新鲜分离的PBMCs,而且可能会在不同实验室和检测方法对象与方法1间导致较大的变异在临床研究中，应用患者的冻存细胞进行纵向研究将有可能最大程度地减少变异性

1.11A型糖尿病患者为2010年1月至3月在中南大学儿童艾滋病临床研究组早在1999年就对I1IV患者进行了优化PBMCs冻存方法的研究，并建立了冻存细湘雅二医院内分泌科住院患者共5例，其中男性4例，胞免疫学测定的质量控制的一系列参数，他们发现只要女性1例，年龄

28.6±

6.8（23~40）岁1A型糖尿病的正确的冻存，患者的PBMCs在很长时间里都具有较好的诊断标准为1）按1999年WHO标准诊断为糖尿病；2）稳定性，但其功能和T细胞亚群仍和新鲜标本存在某些急性起病，半年内无诱因发生酮症或酮症酸中毒；3）差异167依赖胰岛素治疗；4）谷氨酸脱竣酶抗体（GAD-Ab）和/据报道，自身免疫患者的PBMCs较正常对照在冻或蛋白酪氨酸磷酸酶抗体（IA-2A）阳性存过程中更容易受损，而冻存和复苏的温度是影响细胞正常对照为同期纳入的健康志愿者共5例，其中复苏后质量的关键因素之一；何种冻存方案即低温冻存男性4例,女性1例，年龄

28.0±

7.2

（2040）岁,口服葡萄糖耐量试验中空腹和2h血糖值均正常，无糖尿病细胞，同样计数前静置lh和自身免疫性疾病家族史，GAD-Ab和IA-2A均阴性本

1.

2.6PBMCs流式表型分析研究得到了中南大学湘雅二医院伦理委员会的批准取L2X106个pBMCs（新鲜的或解冻的），加入小鼠抗人CD4,CD3,CD8,CD19,CD14,CDS6荧光单克隆

1.2方法抗体，室温避光孵育30min后上机（BD FACSCanton）.参照IDS-TCW FreezingStudyI的标准操作方案获取细胞和分析均参照IDS-TCW中心提供的标准化操作

1.

2.1PBMCs的分离流程，分别获得CD4T细胞（CD4CD3）、CD8T细胞（CD8CD3）、单核细胞（CD14CD3）、NK细胞抽取抗凝血50mL,加入等量RPMI1640（美国（CD56CD3-）、NKT（CD56,CD3,）细胞和B细胞Invitrogen公司）混匀后小心铺在淋巴细胞分离液（挪（CD19*CD3-）在PBMCs中的分布情况威Axis Shield公司）上，室温下离心后由上至下可见4层血浆、PBMCs（白膜）、分离液、红细胞和粒细

1.

2.7ELISPOT刺激抗原胞层，小心吸取白膜，PBS吹打洗涤、离心、弃上清，包括胰岛特异性抗原、记忆性抗原和多克隆阳性RPMI1640洗涤、离心、弃上清，重复1次最后用AIM-V质控抗原，由IDS-TCW中心统一盲法标记提供其中胰无血清培养基（美国Invitrogen公司）重悬细胞，将岛抗原为重组人「cell GAD65和对照（瑞典Diamyd公细胞分为3等份1份马上用于ELISPOT实验（详见L

2.司），记忆性抗原是五合一疫苗（Pediacel疫苗白喉7）,剩下的2份细胞分别采用“C”或“e方案冻存（详-百日咳-破伤风-脊髓灰质炎-嗜血杆菌法国赛诺菲安万见和

1.

2.4）特公司），

0.2和

2.0g/mL两个浓度；多克隆阳性质

1.

2.2PBMCs计数和活力测定控抗原为PMA（美国Sigma公司）新鲜和冻存复苏PBMCs均采用台盼蓝染色后计数，

1.

2.8CD4+T细胞ELISPOT并根据细胞台盼蓝染色排除法测定细胞活力冻存-复操作方法如前述

[89],检测的细胞因子为IFN-Yo苏方案简述如下分离的新鲜和两种方案下分别复苏的PBMCs两种冻存方案的区别在于所使用的冻存液的温度计数后，调整浓度

3.0X106/种于预包被了IFN-y1nL不同（C和W）和是否为冰上操作冻存液为人AB型血capture抗体（荷兰U-Cytech公司）的96孔无菌PVDF膜清中加入DMSO（终浓度10%）,为IDS-TCW中心统一提板（Millipore,MATPS4510）,分别加入盲法标记的4供如果某批细胞的活力＜50%,则该冻存细胞连同其新种抗原（均按1:40浓度加入）共培养，每个样本均设鲜标本将被一同被剔除分析置3个平行孔；3640h后洗板，加入二抗，孵育后洗〜

1.

2.4低温冻存-复苏涤、显色，读板计数斑点计数和流式分析的结果均为所有操作均在冰上进行，所有的试剂和冻存管都盲法测定，汇总至IDS-TCW统一计算和统计，然后结果是预冷的细胞在冰的冻存液A（RPMI1640+10%人血清）反馈至全球各个实验室刺激指数（SI）二抗原孔斑点中以20X106/mL重悬；轻弹管壁使细胞柔和地混匀以/内对照孔确保形成单细胞悬液，逐滴地加入等体积的冻存液B（RPMI1640+20%DMS0）,使得细胞终浓度为lOXlO/mL;在冰上将PBMCs等体积分装至各冻存管；然后置入盛满异丙醇的冷冻盒（美国Nalgene公司），存放于-70℃冰箱，12h后转入液氮罐；所有标本在液氮罐里存放1个月；复苏时将冻存管取出放入37℃水浴，温柔地晃动管子直到细胞冰团几乎完全融化；马上将细胞转入15mL无菌离心管，逐滴加入1mL冰的含10%人AB血清的完全培养基；同样的培养基洗涤细胞1次后，以4X106/位重悬细胞，37c静置lh后予台盼蓝染色计数，随后行流式细胞分析和功能测定

1.

2.5室温冻存-复苏该操作方法和低温方案类似，只是冻存液A在使用前被平衡至室温，具体方案参考国际免疫耐受网络（http://www.imnunetolerance.org/sites/fles/ITN_Protocol_PBMC-CPTpdf）复苏时，冻存管被亶于o37C水浴在细胞临近溶解时，将其转入4倍于冻存细胞体积的、平衡至室温的完全培养基的离心管中；洗涤斑点阳性判定标准SI

3.0o复苏率

61.2%[

49.1%,

67.3%]

42.3%

86.1%和细胞活力

77.5%[

68.5%,

81.5%]

64.4%

93.活，但〜

1.3统计学处理二者之间差异均无统计学意义P

0.05oELISPOT读数结果表示为分泌IFN-丫的细胞数/3X105PBMCso计量资料用土s或中位数及四分位数间距

2.2FACS分别检测新鲜和两种冻存方案下复苏的PBMCs和范围表示两组间比较如符合正态分布的数据采用配各亚群细胞表型的比较对t检验和Wilcoxon配对检验根据样本量大小，如以FACS测定的新鲜PBMCs中各亚类细胞的比例为非正态分布的数据则采用非参数检验P〈

0.05为差异分母，冻存复苏后PBMCs中CD4T、CD8T、B细胞、NK有统计学意义细胞和NKT细胞比例为分子，分别计算两种冻存方案下各亚类细胞在复苏后比值的变化情况结果显示两种结果方案复苏的PBMCs中单核细胞的比例均降低[

3.2±L21%C和

3.0±

0.9%Wvs

7.0±l.1%F,PO.05],

2.1两种冻存方案下的细胞复苏率和活力比较但其余各亚类细胞包括CD4T、CD8T、B细胞、NK细5例1型糖尿病患者和5例正常对照间的细胞复苏胞和NKT细胞比例均无明显变化P

0.05止匕外，各率和活力均无差异，故将10例标本以低温和室温冻存亚群细胞表型在1型糖尿病患者和对照间亦未发现明显分组低温冻存PBMCs的复苏率为

60.1%[

49.1%,

61.差异图11%]

37.5%

79.2%,细胞活力为

74.9%[

66.9%,

80.〜正常对照低温冰存1型糖尿病室温冻存复苏复扁苏第新同一新鲜复复苏苏局后新新鲜一复苏后新一GNKTcells W-NKTcellsC-NKceilsKD56*CDFWMKCDD CD56℃D3*}CD56*CD3*图1流式细胞技术检测1型糖尿病患者和正常对照的低温和室温冻存复苏的PBMCs和新鲜PBMCs中各亚群细胞表型的比值『10CD4T细胞、CD8T细胞、单核细胞、NK细胞、NKT细胞和B细胞在低温和室温冻存复苏细胞间差异无统计学意义P〉

0.0soFigure1Fold changesin differentPBMCs subsetsbetween cold frozen-thawed,warm frozen-thawed andfreshPBMCs.Pooleddata fromT1D patientsand healthyconWols ispresented n=

10.No differenceswere observedin allthe PBMCsubsets CD4T,CD8T,monocytes,NK cells,NKT cellsand Bcells betweenthe twogroups P

0.

05.4%]

55.1%~

92.4%,均略低于室温冻存L1O

2211005050050.OO,50IX5DO

2.ZLl.d

508.

508502.3ELI SPOT测定GAD反应性CD4T细胞1型糖尿病患者新鲜细胞的GAD特异性T细胞反应的SI对多克隆刺激物PHA/PMA刺激T细胞分泌IFN-y为

5.1,均高于低温

1.3和室温

1.4冻存复苏的SI的反应在新鲜细胞和两种方案下冻存再复苏的PBMCs间P〈

0.05,图2A;而且仅新鲜细胞的GAD-反应性T细胞并无明显差异；然而，对于记忆性抗原Pediacel刺激的SI和斑点数均明显高于正常对照

5.1vs

0.9和

8.7下的特异性反应在冻存复苏细胞要明显差于新鲜细胞vs

0.1,P

0.05;图2B,而两种方案下的冻存细胞的SI数据未显示对胰岛特异性抗原GAD65的反应亦如此，在患者和正常对照均无统计学差异P

0.05oELISPOT检测1型糖尿病患者和正常对照在新鲜F，低温冻存复苏0和室温复苏w3种状态下的GAD-反应性T细胞的比较情况A:1型糖尿病和正常对照组在3^状态下GAD■反应性T细胞的刺激指数的比较与新鲜状态比较，*P

0.05;与对照组比较，P〈Q05;B:l型糖尿病患者和对照组在3种状态下GAEF反应性T细胞的中斑点形成细胞数的比较与对照组比较，*P

0.05oFigure2Comparisons of GAD-reactive Tcells amongfresh,coldfrozen-thawed andwarmfrozen-thawed PBMCsin type1diabeticpatients andhealthycontrols.A:Comparisons ofstimulating indexofGAD-reactive TcellsP

0.05vs Fresh;P

0.05vs Control;B:Compaiisons ofspotformingcells ofGAD-reactive Tcells*P

0.05vs Control.3讨论胞的免疫功能在冻存前后不发生改变因此，传统的冻存、复苏方法已经不能适应新的要求国外较早开展这冻存的PBMCs为临床研究提供了很多方便，最大方面研究，Maecker等［15］摸索了一套行之有效的适应ELISPOT功能检测要求的细胞冻存、复苏方法，可以的益处是使自身免疫性疾病的前瞻性研究免疫干预监保证较高的存活率90%,并且斑点形成细胞的频率保测成为可能Smith等［1］报道，应用冻存PBMCs检持不变，但尚未在各种疾病状态下验证目前研究显示，测的IFN-丫-ELISPOT适合监控患者的细胞免疫反应，冻存后复苏的细胞无论是活力还是细胞亚群较新鲜细冻存的PBMCs可以在很长时间里保存较高的复苏率、活胞仍存在不少差异［13-

14.16］o目前冻存方法包括力和CD4T细胞比例有研究发现虽然1型糖尿病患儿低温和室温冻存，低温冻存强调整个冻存和复苏过程均的冻存细胞在胰岛抗原GAD65和PHA诱导下释放的细胞为严格的冰上操作，理由为低温条件下，细胞的生命活因子和新鲜细胞略有差异，但绝大多数免疫标志物的情动偏弱，对DMS0的耐受程度相对高些而另一派学者况与新鲜的细胞类似，因此该文提出冻存的PBMCs可以则认为，为了保持细胞的代谢活力，让它们能很快适应作为1型糖尿病M儿童免疫标志物的评估［12］尽管复苏后渗透压的变化和细胞膜液体的流动性，所有相关如此，近年来研究显示，新鲜分离和冻存细胞的差异仍的试剂都应平衡到室温，而冷的试剂会使细胞膜的液体然姓许14］仍处于冰晶状态［1］两种冻存方法似乎各有千秋，因此，如何提高冻存细胞的质量也是近年来该领因此IDS-TCW决定探讨究竟哪种冻存方案能更接近于新域探讨的热点对于冻存复苏的细胞而言，冻存与解冻鲜细胞的状态，且在糖尿病科研中常用的一些T细胞检本身对细胞就是很大的伤害细胞冻存时会使用一些保测方法中也具有最高的重复性和最佳的反应9笔者所护剂如DMS0来减少冻存对细胞的伤害，但是DMS0本在实验室作为中国唯一参与该研究的实验室，整个操作身就具有生物毒性，也会伤害细胞，影响细胞的状态都严格参照IDS-TCW的标准化程序进行，而且ELISP0T因此ELISPOT等免疫检测技术对细胞的冻存与复苏提出检测所用胰岛抗原均为IDS-TCW统一盲法标记，读板结了更严格的要求，不单要求细胞的存活率高，还要求细果也为中心化实验室读取，因此实验的客观性较高本研究发现无论是1型糖尿病患者还是正常对照的研究中，不管是新鲜细胞还是冻存细胞，应该在研究的PBMCs,就细胞的复苏率和活力而言，似乎室温冻存中对不同对象和/或不同时点进行连续的、更彻底的比法较低温法稍具优势，但二者差异并无统计学意义较，以便为最终确定合适的冻存方案提供更有力的依据Disis等口研究显示随着复苏温度的升高，细胞的活力也呈平行增高趋势，4℃

69.7±

12.5%,25℃

92.55±

3.1%,37℃

95.11±

2.5%而就单核细胞部o参考文献分的保存而言，低温冻存法则损失较小，但亦未发现明显差异，有待扩大样本量验证其余各亚类细胞包括CD4T,CD8T,B细胞，NK细胞和NKT细胞比例在新

1.RoepBO,PeakmanM.DiabetogenicTlymphocytesinhumantype1diabetes[JJ.Curr OpinImmunol,2011,236:746-

753.鲜、冻存复苏细胞间均无明显差异；与Axelsson等］研究报道类似但亦有研究显示，冻存会影响初始T细

2.Lampeter EE,Homberg M,Quabeck K,et al.Transfer ofinsulindependentdiabetes betweenHLA-identical siblingsby bonemarrow transplantationf胞CD4S RA和记忆性T细胞CD45R0的表达，也会降低J].Lancet,1993,3418855:1243-

1244.记忆性抗原相关的T细胞反应和细胞因子的分泌冻存是否还会影响单核细胞的功能暂不清楚，因本研究的重

3.Seyfert-Margolis V,Gisler TD,Asare AL,et al.Analysis ofT-cell assaysto点为与1型糖尿病相关的CD4T细胞的检测，故并未围measure autoimmuneresponses insubjects withtype1diabetes:results ofa绕单核细胞展开研究blinded controlledstudy[JJ.Diabetes,2006,559:2588-

2594.

4.Herold KC,Brooks-Worrell B,Palmer J,et al.The type1diabetes TrialNet最后，冻存的质量如何最终要在后续的应用冻存Research Group.Validity andReproducibility ofmeasurement ofislet细胞进行的T细胞的功能实验中验证本研究中除PHAautoreactivity byTcellassays insubjects withearly type1diabeteslJ].Diabetes以外，无论是记忆性抗原Pediacel还是胰岛特异性抗Care,2009,5811:2588-

2595.原GAD65刺激的T细胞反应在冻存细胞均较低，而且从

5.James EA,Mallone R,Schloot NC,et aLImmunology ofDiabetes Society复苏活力来看，略有优势的室温冻存方案在ELSIP0T检T-Cell Workshop:HLA classII tetramer-directed epitopevalidation initiative.测方面较低温冻存法并无优势仅新鲜细胞可以探测到T-Cell WorkshopCommittee,Immunology ofDiabetes SocietyfJ].Diabetes1型糖尿病患者较正常人增多的GAD反应性T细胞，而Metab ResRey,2011,278:727-

736.两种冻存方案下的细胞均未检测到这种差异据研究

86.Weinberg A,Song LY,Wilkening C,et al.for thePediatric ACTG报道，新鲜和冻存的PBMCs之间的这些差异和刺激抗原Cryopreservation workinggroup.Optimization andlimitations ofuse of的种类、细胞因子的反应和选择的研究对象均存在密切cryopreserved peripheral blood mononudearcells forfunctional andphenotypic关联Mallone等⑴应用IFN-丫ELISPOT检测CD8T细Tcellcharacterization[J].Clin VaccImmunol,2009,168:1176-

1186.胞亦发现冻存的PBMCs较新鲜分离细胞分泌IFN-丫的

7.Weinberg A,Song LY,Wilkening CL,et alOptimization ofstorage and基值要高即背景略高，但抗原特异性T细胞反应的净shipment ofcryopreserved peripheralbloodmononuclear cells from值在二者是可比的，该研究采用的是低温冻存方法笔HIV-infected anduninfected individualsfor ELISPOT assays[J].J ImmunolMethods,2010,3631:42-

50.者的低温冻存方法未得到理想结果可能与检测的是CD4T细胞，其刺激物为全长蛋白，其敏感度比采用

8.Mallone R,Mannering SI,Brooks-WoiTell BM,et al.Isolation andpreservationHLA-A*0201限制性肽段作刺激物的CD8T-ELISPOT要低得多有关因此，值得进一步将两种冻存法在CD8ofperipheral bloodmononuclearcells foranalysisof isletantigen-reactive TcellT-ELISPOT实验中进行比较既往关于病毒疫苗和肿瘤免疫的研究提示，冻存细胞在很长时间后复苏，应用responses:position statementoftheT-Cell workshopCommitee oftheELISPOT检测其针对水痘带状疱疹病毒VZV的特异性Immunology ofDiabetesSociety[J].Clin Explmmunol,2011,1631:33-

49.CD4T细胞反应和新鲜细胞相比并无明显差异［10］这可能与1型糖尿病系器官特异性自身免疫疾病，其免

9.Mannering SI,Wong FS,Durinovic-Bello I,et al.ImmunologyofDiabetes疫反应强度较低，远低于病毒和肿瘤性疾病的免疫强度，society Tcell WorkshopCommittee.Current approachesto measuringhuman因此对于T细胞功能检测的方法的敏感度要求更高，对islet antigenspecific Tcell functionintype1diabetes[J].ClinExplmmunol,2010,1622:197-

209.于细胞的质量要求亦随之增高，因此在1型糖尿病领域应用冻存细胞进行研究的难度要更大

10.SmithJG,Liu X,Kaufhold RM,et al.Development andvalidation ofagammainterferon ELISPOTassay forquantitation ofcellular immuneresponses to由此看来，现有的两种冻存方案似乎暂时都不足varicella-zoster virusfJ].Clin DiagnLab Immunol,2001,85:871-

879.以维持目前开展的CD4T-ELISPOT检测中的T细胞反应

11.Axelsson S,Faresjo M,Hedman M,et al.Cryopreserved peripheralblood所以，如果在前瞻性糖尿病试验中需要应用冻存细胞的mononuclear cellsare suitablefor theassessment ofimmunological markersin话，势必还需要探讨一种新的冻存方案此外，在日后type1diabetic childrenlJ].Cryobiology,2008,573:201-

208.

12.Axelsson S,Hjorth M,Akerman L,et al.Early inductionofGAD65-reactive concentration[J].Transfusion,2011,514:799-

807.Th2response intype1diabetic childrentieated withalum-foimulated GAD

17.Zhang W,Caspell R,Karulin AY,et al.ELISPOTassaysprovide reproducibleresultsamong differentlaboratories forT-cell immunemonitoring evenin hands65[J].Diabetes MetabRes Rev,2010,267:559-

568.ofELISPOT-inexperienced investigatorslJJ.JImmunotoxicol,2009,64:227-

234.

13.Jeurink PV,Vissers Y,Rappard B,et al.Tcellresponses infresh andcryopreservedperipheralbloodmononuclearcells:Kinetics ofcell viability,

18.Disis ML,dela RosaC,Goodell V,et al.Maximizing theretention ofantigencellular subsets,proliferation,and cytokineproduclion[J].specific lymphocytefunction aftercryopreservation[J].J ImmunolCryobiology,2008,S72:91-

103.Methods,2006,3081/2:13-

18.

14.Heo YJ,Son CH,Chung J-S,et al.The cryopreservationof highconcentrated

19.Mallone R,Martinuzzi E,Blancou P,et al.CD8T-cellresponsesidentifyPBMC fordendritic cellDC-based cancerimmunotherapy[JJ.beta-cell autoimmunityin humantype1diabetesfJ].Diabetes,2007,Cryobiology,2009,582:203-

209.563:613-

621.

15.Maecker HT,Moon J,Bhatia S,et aLImpactofcryopreservation ontetramer,cytokine flowcytometry,and ELISPOTfJl.BMC Immunol,2005,186:17-

30.

16.Majado MJ,Salgado-Cecilia G,Blanquer M,et al.Cryopreservaton impacton（本文编辑郭征）blood progenitorcells:influence ofdiagnoses,mobilization treatments,and cell本文引用杨琳，超晨，唐维，王臻，俞海波，崔秋燕，周智广，不同的冻存方法对型糖尿病患者胰岛抗原特异性细胞反应的影1T响中南大学学报医学版，[J].2013,382:169-

175.DOI:10Cite thisarticle as:。