缺血预处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

论著・•缺血预处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响潘伟，贾俊海［摘要］目的探讨缺血预处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响方法建立糖尿病大鼠模型，将只糖尿病大鼠随机分为183组，即心肌缺血再灌注组、心肌缺血预处理组及假手术组，每组6只硝酸还原酶法测定各组大鼠的血清和心肌组织中一氧化氮（NO）水平,免疫组织化学法测定大鼠的心肌基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的表达结果假手术组大鼠血清NO水平为（46±11）心肌缺血再灌注组为（66±18）心肌缺血|Jmol/L,预处理组为（45±11）Rmol/L,心肌缺血再灌注组的血清NO水平与假手术组间差异有统计学意义（P

0.05）,与心肌缺血预处理组间差异亦有统计学意义（P

0.05）假手术组大鼠心肌组织NO水平为（

21.4±

5.3）|Jmol/mg2prot,心肌缺血再灌注组为（

30.2±

3.3）gprol,心肌缺血预处理组为（

25.6±

2.9）o|Jmol/mgp rol,心肌缺血再灌注组的心肌组织NO水平与假手术组间差异有统计学意义（P

0.01）,与心肌缺血预处理组间差异亦有统计学意义（P

0.05）假手术组大鼠心肌组织中MMP.2阳性细胞百分比为（

30.4±

2.2）%,心肌缺血再灌注组为（

44.2土

6.3）%,心肌缺血预处理组为（

25.2±

4.5）%,心肌缺血再灌注组与假手术组间差异有统计学意义（P

0.05）,与心肌缺血预处理组间差异亦有统计学意义（P

0.05）结论缺血预处理可通过o减少生胡表达，降低糖尿病大鼠的心肌缺血再灌注损伤NO DMMP.2【关键词】糖尿病；再灌注损伤；缺血预处理【中图分类号】R541R

587.1【文献标识码】A【文章编号】1007-9572

（2009）04-0649-02E ffecto fIschem icPr econd itionn gon Myoca rdia1Isch emic/Reper fusionInjury nD iabe ticRat sPAN Wei,J IAJ un-h a；D epartm entof Labo ratory Med icine,Schoo1of Med ica1Science and Lab oratory Med icine,J iangs uU niversity,Zh enjian g212013,Ch ina【Ab stra ct]O bjective Tostudy the efect ofisch emic p reconditioningIP onmyoca rdialischem ic/rep erfusionIR injuryin diabeticra ts.M ethods Streptozotoc ininjectionw asused toestablish diabe tic rats,which were divided into three group s:IR,IP andsham.NO contentin serum andmyocardia1tissue swe rede term inated byn itratereductasem ethod.The expre ssionofMMP-2inmyocardial tissueswasmeasured byimm unohistochemistry.Re suitsNOcontent andMMP-2ex2pre ssiondecreasedsignificantlyinIP group,as compared w ith IRgroup.Con elusionIP candecrease m yoca rdialIR injuryby reducingNO productionand MMP-2expression.[K eywor d]D iabetes mellitus;Repe rfusion injury;Ischem icpreconditioning多次短暂的心肌缺血和再灌注可明显增强心肌对较长时间持维齐！J链服佐菌素（STZ,购自美国Sigma公司），一氧化氮（NO）测试血再灌注损伤的耐受能力，这种现象称为缺血预处理（ischem icp盒（购自南京建成公司），SABC免疫组化试剂盒、基质金属蛋白酶reconditioning,IP）111o有研究显示，缺血预处理对糖尿病大鼠的心肌不-2（MMP-2）抗体（购自武汉博士德公具有保护作用⑵o本研究探讨了缺血预处理对糖尿病大鼠心肌缺血司）

（3）主要仪器设备小型动物呼吸机、LEICA显微镜、超声匀再灌注损伤的影响，现报道如下浆仪、高速离心机等材料与方法模型制备和分组方法所有大鼠禁食腹腔注射（以

11.212h,STZ

0.

11.1材料

（1）实验动物雄性SD大鼠25只，体质量250〜300g,由mol/L柠檬酸缓冲液溶解）50mg/kg注射药物48h后，大鼠尾静脉采血测定血糖以血糖大于尿糖为+++++++持续周的

16.7mmol/L,〜1江苏大学实验动物中心提供

（2）主要药品和试大鼠为糖尿病大鼠⑶所有大鼠由专人饲养，自由进食、饮水，不予胰岛素治疗，最后造模成功的糖尿病大鼠共只周后行心肌184缺血再灌注模型制备，将大鼠麻醉后气管插管接动物呼吸机，在冠作者单位江苏省镇江市，江苏大学基础医学与医学技术212013状动脉左前降支是巨起始段处开胸以无创小圆针穿过左冠脉4mm，学院检验系（潘伟）；江苏大学基础医学与医学技术学院生理学教下方的心肌表层，穿丝线，垫置硅胶管以收紧结扎线后心电图5-0，研室（贾俊海）导联或左前导联融合的抬高，放松结通讯作者贾俊海,江苏省镇江市江苏大学基础医学与医I ST-T212013，学技术学院生理学教研室；E-ma il:junh ail970126@s ina.com才线后抬高的下降以上为心肌缺血再灌注造模成功将ST-T1/218只糖尿病大鼠采用单纯随机分组法分为组心肌缺血再灌注组31只缺血再灌注心肌缺血预处理组只，在左前降6，30m in,2h26支穿线后结扎再灌注反复次，然后缺血再灌注5min,5m in,330min,2假手术组只，穿线后不结扎，观察h;36150m in0心肌组织和血清中水平的测定方法采用硝酸还原酶法测定

1.3NONO水平实验结束后取大鼠静脉血3m1,离心后取血清测定NO水平；注图A:心肌缺血再灌注组；图B:心肌缺血预处理组；C:假手取大鼠心脏左室前壁肌组织剪碎匀浆后离心，取上清液测定术组100mg,水平图各组糖尿病大鼠心肌组织中的表达NO1MMP-2X400心肌组织中表达情况的观察方法实验结束后取大鼠心

1.4MMP-2F igure1The expression ofMM P-2in myocardia1tissue inth reegroup s脏左室前壁肌组织，石蜡包埋、切片，采用免疫组织化学法染色MMP构和功能具有很重要的影响的一抗采用鼠抗兔单克隆抗体,显微镜下观察的表达-2MM P-2氧自由基是一种造成心肌损伤的重要物质，在心肌缺血再灌注镜下显示心肌细胞中紧密排列的染成棕黑色的小颗粒与其一MMP-2过程中能够与迅速反应生成毒性很大的过氧亚硝基阴离子，该NO抗特异性表达后的产物即为阳性结果每张切片随机选取个高1物质可以导致细胞膜脂质过氧化及其他细胞成分的氧化损伤”在o倍视野，分别计数阳性心肌细胞数和心肌细胞总数计算阳MM P-2，糖尿病情况下，长期的高血糖状态导致体内自由基生成增多、组织性心肌细胞百分比缺氧、血管平滑肌对敏感性降｛氐，刺激了的释放导致糖NO NO，统计学处理采用统计软件进行统计学分析计量资

1.5SPSS

12.0尿病大鼠体内生成亢进进一步力嚏了缺血再灌注损伤、本研究NO，料以表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用检x±s q结果显示，心肌缺血再灌注大鼠的血清^口心肌组织中水平高于NO验以为差异有统计学意义P

0.05假手术大鼠,说明参与了糖尿病大鼠的心肌缺血再灌注损伤NO结果是一类含锌的可降解细胞外基质中多种蛋白成分的2MMPs ECM内肽酶家族在心脏中起着很重要的作用，主要由、、、ECM Im IV各组大鼠心肌组织和血清中水平比较组大鼠血清水平

2.1NO3NO、型胶原蛋白组成为明胶酶,主要降解、和型胶V VIMMP-2I IVV间差异有统计学意义心肌缺血再灌注组的血清F=

5.68,P

0.05;NO原以及基底膜成分⑺当发生缺血再灌注时血管内纤维细胞刺激，水平与假手术组间差异有统计学意义与心肌缺血预q=

3.35,P

0.05,产生并降解冠脉内胶原成分，使其通透性增加而进入心肌细MMP-2,处理组间差异亦有统计学意义组大鼠心肌组织q=

3.67,P

0.053NOo胞⑶；心肌缺血再灌注后可刺激大量炎性细胞产生并浸润心肌组织水平间差异有统计学意义心肌缺血再灌注组的心F=

4.84,P

0.05;而分泌另外，糖尿病也能通过降解血管壁使表达显著ECM MMP-2肌组织水平与假手术组间差异有统计学意义与心NO q=

4.63,P

0.01,提高“⑴，从而加重了心肌细胞的损伤本研究结果显示，心肌缺肌缺血预处理组间差异亦有统计学意义见表q=

3.22,P

0.05,1o血再灌注大鼠的心肌组织中阳性细胞百分比高于假手术大鼠MMP.2，各组大鼠心肌组织中的表达情况比较与心肌缺血再灌

2.2MMP-2说明参与了糖尿病大鼠的心肌缺血再灌注损伤MMP-2注组比较，心肌缺血预处理组的阳性心肌细胞数显著减少见MMP-2心肌缺血预处理是指在较长时间的缺血再灌注之前连续多次短图假手术组大鼠心肌组织中阳性细胞百分比为1MMP-

230.4暂的缺血再灌注有研究显示，缺血预处理能够有效降低心肌缺血再±

2.2%，心肌缺血再灌注组为

44.2±

6.3%,心肌缺血预处理组为

25.2灌注损伤，从而起到保护心肌的作用，在此过程中有一定的自由基参组大鼠心肌组织中阳性细胞百分比间差异有统计学与，使得心肌细胞中的氧自由基清除酶如〔超氧化物歧化酶〕±

4.5%o3MMP-2SOD意义心肌缺血再灌注组与假手术组间差异有统计学活性升高提高机体清除氧自由基的能力，缺血预处理能够抑制F=

5.38,P

0.05;，NO意义与心肌缺血预处理组间差异亦有统计学意义的释放心川，从而减轻高血糖引起的缺血再灌注损伤另外，经过q=

4.02,P

0.05,q缺血预处理后，缺血再灌注损伤中的心肌酶的释放量也可以减少⑴，=

4.24,P

0.05o的释放受到抑制，减轻了糖尿病者心肌和基底膜成分的讨论MMP.2ECM3损伤本研究结果显示，心肌缺血预处理大鼠的水平和心肌缺血再灌注是目前心血管研究的热点问题缺血再灌注往NO MMP-2B日性细胞百分比较心肌缺血再灌注大鼠降低，说明心肌缺血预处理往导致心肌损伤更加严重，出现缺血再灌；扫员伤141影响缺血再o可降低糖尿病大鼠的心肌缺血再灌注损伤，起到灌注损伤的因素很多，其中和基质金属蛋白酶对心肌结NO MMPs表各组糖尿病大鼠心肌组织和血清中水平比较1NO x±sTa bIe1The comparison ofNOin diabetic rats*myocard ia1tissue andser2um inthreegroups血清NO心肌组织NOpmol/L pmol/mgp rot假手术组646±

1121.4±

5.3心肌缺血再灌注组666±

1830.2±

3.3保护心肌的作用下转页心肌缺血预处理组O654645±

1125.6±

2.9CG^lliineM GeneralPracticeApril

2009.\olJ2IM平的炎症信息…,故本研究分析了名处于表脑梗死组和对照组、、、、和的比较611hs-CRP TG TC LDL-C HDL-C UAx±s临床稳定阶段的月醯死患者的水平h s-CRP，Table1Comparisonofhs-CRP,TG,TC,LDL-C,HDL-CandUAcontentsinpatientswithcer2ebralinfarctionand并与例健康者进行对照上俄，结果显示，tha tin people ofcon troI group55脑梗死患者的血清水平明显高于健康hs-CRP hs-CRP TGTC LDL-C HDL-C UA组§11例数mg/L mmol/Lmmol/Lmmol/Lmmol/L mmol/L者，提示脑梗死患者即使在临床稳定期体内的炎症反应仍处于较高水平,因此持续存在月幽超E组

614.6±

2.

31.6±

1.

04.8±

0.

83.1±

0.

71.01±

0.33362±86对照组的炎症反应可能是脑梗死高复发率的重要危

552.1±

1.

41.9±

1.

35.1±

1.

23.3±

1.

01.05±

0.23381±80险因素之一月幽更死患者的血清、、i值

3.

1251.

6071.

2531.

1120.

2571.512TGTC值LDL P

0.

0070.

1250.

2120.

3780.

8120.

187、和水平与对照者没有明显差-C HDL-C UA测定.中华实用中西医杂志，异，且各指标与h s-CRP之间也没有明显相3许红.脑梗死患者血清超敏C反应蛋白及相[J]2008,2114:关研究.神经疾病与精神卫生，1201-

1202.关性，一方面提示即使在其他代谢性指标控[J]2005,5李辉王兆宏.血清反应蛋白在急性脑梗9，C4:273-

274.制在正常水平内，患者体内仍处于较高的炎死患者临床评估中的价值.疑难病杂志[J]，4CaoJJ,ThachC,ManolioT,eta|C-re2activeprotein,症反应状态另一方面也提示可能是hs-CRP2006,52:

97.carotid intmi a-medi ath ick2ness andincidence of预测脑梗死的敏感指标之一必.王娟，鲁明.脑梗死患者血清超敏反应10C-ischcm icstroke intheeIderly:the Cardiovascular H因CRP不只是炎症反应的副产物，也是蛋白与同型半胱氨酸水平的相关性分析[J],ealth Study[J].C irculation,2003,1082:166-中国全科医学，炎症的参与者，通过促进活性因子释放、激2008,114:

562.

170.活补体和促凝等多种途径来共同参市脉粥样11郑秀霞.脑梗死患者血清C反应蛋白检测的汪春娟姜亚平反应蛋白与缺血性卒中5，.C临床意义.中国基层医药硬化损害的发生和发展、因此除了传统的治[J]，2005,1210:

1326..国外医学脑血管疾病分册,[J]2005,137:周志斌李小好牛建平等.急性脑梗死患疗方法控制血压、血糖及血脂水平外有效12，，，，533-

536.者血清基质金属蛋白酶-、反应蛋白9C-地降低血清水平野是预防脑梗死复发的华洁，牛国忠，李保华.急性脑血管病患者CRP6临床意义的研究.中国全科医学，[J]2006,又一重要目标w血清C反应蛋白测定的临床意义|J|.中华急917:

1414.诊医学杂志，参考文献2003,712:483-

484.收稿日期修回2008-11-14；1秦树，李健.急性脑梗死患者超敏C反应蛋7朱衡亚，王庄，王亚仙等血清超敏C反应日期本文编辑白动态变化与预后关系的研究.检验蛋白水平与急性脑梗死患者年龄及其2008-12-10[J1医学与临床，分型相关性研究.现代中西医结焦骞2006,34:145-

146.TOAST[J]高路南佳彦.急，性脑梗死患者内超敏合杂志，2，24h2008,1728:4377-4378,

4385.反应蛋白水平及相关研究.中华急诊C[J]靳彩虹，李宏科，吕少英.不同时期的糖尿8医学杂志，病肾病患者血清超敏反应蛋白含量的2004,133:175-

177.C上接页sioninjury[J].Circula tion,2003,10719:2487-

2492.6509L indseyM,Wend iK,Brown MD,eta IM atrix-dependent mecha2nism of参考文献Europh ile-m ediated releaseand activationofm atrixmeta Ilopro2te inase9in m1M urryCE,J enningsRB,Remi erKA.Precondition ingwithischem ia:a delayofyocardia1i schemia/rep erfusion[J].C irculation,2001,10317:2181-

2187.le tha1cell injuryin ischemic myocardium[J].C irculation,1986,745:1124-

1136.10潘优津，赵向彤，吴朝明，等.基质金属蛋白酶-2及其组织抑制因子与型糖尿病大血管病变的关系.现代预防医学刘畅，刘国良，任甫，等.缺血预处理对糖尿病大鼠缺血/再灌注损-22[J]，2007,3420:2伤性心肌超微结构的影响.解剖学杂志,3835-

3836.[J]2007,303:301-

312.3孙敬方动物实验方法学【M

1.北京人民卫生出版社,2001:477-

478.1I尤土杰，杨跃进，陈可冀.心肌缺血再灌注损伤及药物干预研究进展.疑难病杂志，赵慧娟龙明智.心肌缺血再灌注损伤机制的研究近况.中西医[J]2004,33:

186.4，[J]结合心脑血管病杂志，2005,33:240-

242.12陈晓光，吕黄伟，王俊科，等.肢体缺血预处理对缺血再灌注心肌一氧化氮及氧自由基的影响.中国医科大学学报，蔡建志,王永武在心肌缺血再灌注损伤中的双重作用和的[J]2006,356:577-5,NO SOD影响.同济大学学报医学版，

579.[J]2007,281:24-

33.李红辉，何涛，罗文炽，等.糖尿病大鼠血清、组织一氧化氮含量连亮华，陈德伟.〃缺血后适应〃减少心肌缺血再灌注损伤的研613的测定及其意义.泸州医学院学报，[J]1999,222:113究进展.中国误诊学杂志，[J]2007,77:

1441.-

115.李淑娟，吴艳娜，康毅，等.无创性肢体预适应对缺血再灌注损伤147韩珂，杨辰垣，肖诗亮，等.基质金属蛋白酶・2对鼠心肌缺血再灌注大鼠心肌的保护作用.中国全科医学，[J]2007,109:

707.间质损伤的影响.实用医学杂志，[J]2005,215:452吴伟，张锦.缺血预处理对糖尿病大鼠心肌梗死和细胞因子的影15-

455.响.中华老年医学杂志[J]，2001,205:358-

360.8Schu IzcCJ,Wa ngW,Sua rez-P inzonWL,et aI mlb alancc be wte cntissue收稿日期修回日期:本文编辑2008-09-25;2008-11-05inhibitor ofmeta Hoproteinase-4a ndmatrixmetallop roteinase sduringacute闫行敏myoc a rdia1[correction of inyocardia1]i schcm ia-repe rfu2。