罗格列酮对糖尿病大鼠肾脏IL-6、IL-8、TNF-α表达的影响

罗格列酮对糖尿病大鼠肾脏、、IL-6IL-8表达的影响*TNF-a王玉梅\黎慧清？△,李贞琼二罗长青’，刘建社I华中科技大学同济医学院附属协和医院肾内科，内分泌科，武汉2430022摘要目的观察罗格列酮对糖尿病大鼠肾脏炎症相关因子、和表达的影响方法雄性大鼠被IL-6IL-8TNF-a SD分为正常组、正常+罗格列酮组、糖尿病组、糖尿病+罗格列酮组所有大鼠均检测生化指标、尿白蛋白排泄率，及肾组织、、和蛋白水平结果罗格列酮干预的糖尿病大鼠和未干预组相比，肾组织、、表H-6IL-8TNF-a mRNAIL-6IL-8TNF-a达显著降低，尿白蛋白排泄减少，但血糖、肌酎无明显变化结论罗格列酮可能通过抑制炎症相关因子的表达，从而降低尿白蛋白的排泄以保护肾脏，并且其作用独立于降糖之外关键词糖尿病肾病；炎症因子；罗格列酮中图分类号:R

587.1D0I:

10.3870/j.issn.1672-

0741.

2010.

06.016Effects of Rosiglitazone onIL-6JL-8and TNF-a Expressioninthe Kidneyof DiabeticRatsWang Yumei,Li Huiqing2,Li Zhenqionget alDepartmentof Nephrology,department ofEndocrinology,Union Hospital,Tongji MedicalCollege,Huazhong Universityof Scienceand Technology,Wuhan430022,ChinaAbstract ObjectiveTo observethe effects ofRosiglitazone on inflammatory cytokines expression in the kidney of diabetic rats.Methods Fortymale SDrats wererandomly dividedinto fourgroups:normal controlgroup,normal control+Rosiglitazone group,diabetesgroup,diabetes+Rosiglitazone group.Diabetic nephropathy in ratswas inducedby intraperitonealinjection ofstreptozotocinSTZ,70mg/kgand therats werekilled aftertreatment for8weeks.Biochemical markersand urinary albumin excretionwere measured.Theexpression levelsof IL-6,IL-8and TNF-a mRNAand proteinwere detectedby real-time PCRand Western blot,respectively.Results Ascomparedwith untreateddiabetic rats,Rosiglitazone significantlyreduced theIL-6,IL-8and TNF-a expressionlevels,and urinary albuminexcretion inthe kidneyofdiabeticrats.Meanwhile,there wasno significantchange inblood glucoseand creatinine.ConclusionRosiglitazone mightimprove renalfunction partlythrough inhibitingthe inflammatorycytokine expressionand reducingurinaryalbuminexcretionin diabetic nephropathy.Furthermore,the protectiveeffectsofRosiglitazoneonthekidneywere independentfrom itshypoglycemiceffects.Key wordsdiabetic nephropathy;inflammatorycytokine;Rosiglitazone越来越多的研究证实糖尿病是一种慢性低度炎症过糖尿病肾病是糖尿病的严重并发症之一，是导程，炎症促进了糖尿病肾病的发生发展，我们设想罗致欧美国家终末期肾病的最主要病因糖尿病肾病在格列酮可能对于干扰糖尿病肾病中炎症过程，影响其疾病进展有一定作用本研究将观察糖尿病大鼠肾我国的发病率也逐年增加，成为影响我国糖尿病患小球细胞炎症相关因子IL-

6、IL-8,TNF-a的表达，者长期预后的重要因素微量蛋白尿是糖尿病肾病并应用罗格列酮干预，观察罗格列酮对上述炎症因子的表达和对微量蛋白尿的影响的早期诊断指标口，同时微量蛋白尿也是炎症标志及心血管疾病的独立危险因素［2］罗格列酮作为胰材料和方法1岛素增敏剂，主要被用于降糖治疗近年来研究发现罗格列酮在降糖之外也具有抗炎作用［3］鉴于材料

1.

11.

1.1实验动物40只雄性Sprague-Dawley SD大鼠，体重BW200220由华中科技大学同济医学院•国家自然科学基金资助项目〜No.30800523王玉梅，女，1974年生，主治医师，医学硕士，实验动物学部提供E-mail:wcingTjmei75@hotmail.com

1.

1.2实验试剂链胭佐菌素（STZ,Sigma公司产△通讯作者，Corresponding authorJE-mail:lhqing5@

126.com品）；兔抗大鼠IL-

6、IL-

8、TNF-a多克隆抗体（1:500GAGATCTTGG-3,下游引物5-TCCAGG-稀释，美国Santa Cruz）辣根过氧化物酶标记的TAGAAACGGAACTC-3;IL-8上游引物5-AA-羊抗兔二抗（1:3000稀释，北京中山公司）TrizokGATTGTCCAAAAGATGCTAA-3,,下游引物5-反转录试剂盒（美国Invitrogen）,引物由上海生工ATCGGTGCAATCTATCTTCTTT-3,;TNF-a上合成，罗格列酮（葛兰素史克公司赠送，由同济医游引物5-GTACCACCAGTTGGTTGTCT-3,,下学院药学系提纯）Enhanced Chemiluminescence（ECL）游引物5-CACGCTCTTCTGTCTACTGA-3;-plus发光试剂盒（美国Amer-sham）o GAPDH上游引物-GGTATCGTGGAAG-GACTCATGAC-3,,下方法游引物5-ATGCCAGT-GAGCTTCCCGTTCAGC-3PCR扩

1.2增反应参数如下95℃15min,然后95℃15s,60℃

1.

2.1动物模型的建立与分组40只雄性SD大鼠，60s,共40个循环反应完成后进行Melting Curve适应性饲养1周后随机分为糖尿病（DM）组24只和检测，未发现非特异扩增以及引物二聚体以GAPDH正常对照（NC）组16只禁食12h后，DM组按70mg/kg为内参引物，进行相对定量分析一次性腹腔内注射1%STZ溶液（溶于PH

4.2的枸椽酸

1.

2.5Westernblot检测取100mg冻存肾皮质，缓冲液中），NC组注射相当体积的柠檬酸缓冲液加入含有50mmol/L Tris.Cl（pH

8.0）,150mmol/L72h后测定血糖（blood glucose,BG）,BG

216.7mmol/L,NaCl,

0.02%叠氮钠，

0.1%SDS,100u g/确定为糖尿病模型建成糖尿病组共有20只大鼠符去氧胆酸合标准，并随机分为糖尿病组（DM组，n=10）、糖mL PMSFJ|ig/mL Aprotinin,I%NP-40,

0.5%尿病+罗格列酮组（DM+钠，

0.5mmol/L DTT和

0.1mmol/L EDTA的细胞裂解液中匀浆，4℃12000r/min离心15min,取上清，RSG组，n=10）正常对照组分为正常组（NC组，n二oBradford法测定总蛋白浓度待测样品按40ug蛋白8）、正常+罗格列酮组（NC+RSG组，n=8）成模后oDM+RGS组和NC+RGS组给予罗格列酮［5mg/（kg•d）］量上样，和预染的标准分子量蛋白一起行10%和生理盐水混悬液灌胃，DM和NC组给予等体积生理SDS-PAGE电泳分离蛋白，电泳lh后将蛋白转移到硝盐水灌胃酸纤维膜上，5%脱脂奶粉-TBST封闭lh,兔抗大鼠

1.

2.2血压监测采用鼠尾无创血压测量仪（普升科IL-

6、IL-8和TNF-a多克隆抗体4℃孵育过夜，羊抗技有限公司）每周定期监测大鼠尾动脉收缩压兔二抗室温孵育60minECL-plus发光试剂盒显影（systolic arterialpressure,SAP）,每次记录测血图像分析软件（GeIwork凝胶图像分析系统）对特异压3次，取均值，直至实验结束性条带进行灰度扫描，以吸光度值代表条带的信号

1.

2.3标本采集实验前及实验8周时，测定24h尿强弱，GAPDH作内参照白蛋白排泄率（urinaryalbuminexcretion,UAE）

1.3统计学分析实验8周结束时由腹腔静脉采血分离血清备用，处实验数据以x土s表示，采用SPSS

12.0统计软O死后迅速取肾组织标本冻于液氮保存血清肌酉千件处理，组间比较采用单因素方差分析以P

0.05（blood creatinine,Cr）,BG及糖化血红蛋白为差异有统计学意义（hemoglubinAlc,HbAlc）采用日本Hitachi7150自结果2动生物化学分析仪检测；UAE按照免疫比浊法试剂盒（美国德灵公司）说明书检测各组大鼠血压和生化指标改变

2.

11.

2.4实时荧光定量PCR检测用Trizol RNA抽提实验前NC、NC+RGS、DM和DM+RGS组之间BG、试剂盒（美国Invitrogen公司）提取肾皮质总RNA,SAP、BW、Cr和24h UAE差异无统计学意义（结果测定RNA浓度和纯度总RNA1u g行逆转录，取1未显示）实验8周时DM组和DM+RGS组BG、HbAlc、uL逆转录产物cDNA,稀释至10uL,采用SYBR GreenICr和24h UAE均显著高于NC组，DM+RGS组24h荧光标记，在Light CycleII实时定量PCR仪上进行实时定量PCR反应目的基因和内参三磷酸甘油UAE显著低于DM组NC醛脱氢酶（GAPDH）同等条件扩组和NC+RGS差异无统计学意义见表1增IL-6JL-8,TNF-a和GAPDH的寡核昔酸引物序列如下，IL-6上游引物5-TGTTCTCAGG-华中科技大学学报（医学版）年月第卷第期201012396表1实验8周时各组大鼠血糖、糖化血红蛋白、体重、血肌酎、血压和24h尿白蛋白排泄率结果（x土s）均见少量IL-

6、IL-8^P TNF-a mRNA的表达DM组、和的表达

2.2IL-6IL-8TNF-a mRNAIL-

6、IL-8和TNF-a mRNA的表达明显高于NC组，DM+RGS组表达显著低于DM组见图1实验8周时，NC组与NC+RGS组大鼠肾组织Table1Changes ofBG,HbAlc,BW,Cr,SAP andUAE indifferent groupsof rats（xis）Groups BGmmol/L HbAlc%BWg Cru mol/L SAPmmHgUAEmg/24hNC n=

86.7±

1.

24.32±

0.49412±

11.

84.92±

1.02157±

254.5±

1.1NC+RGSn=

86.3±

1.

74.05±

0.35401±

12.

65.13±

1.56155±

304.3±

0.9DMn=

1022.1+

4710.36±

0.89*389±

17.

230.20±

5.41**160±

278.5±L3*DM+RGSn=102L6±

5.1*

11.04+102399±

16.

127.90±

3.56*163±

325.6±L1*#•P

0.05*•P

0.01vs NCgroup;#P

0.05vs DMgroup-P0,01vs NCgroup;#P

0.05##P

0.01vs DMgroup图实时荧光定量检测各组大鼠肾皮质和的表达1PCR16,-8TNF-a mRNAFig.1Differential expressionof IL-6,IL-8and TNF-a mRNAin eachgroup、和蛋白的表达少量IL-

6、IL-8和TNF-a蛋白表达DM组IL-

6、

2.3IL-6IL-8TNF-aIL-8和TNF-a蛋白水平的表达明显高于NC组，实验8周时，NC组与NC+RGS组大鼠肾组织均见DM+RGS组表达显著低于DM组见图2Groups GroupsNCNC+RGS DMDM+RGSNC NC+RGS DMDM+RGS NCNC+RGS DMDM+RGSTNF-QIL-8GAPDHGAPDIIGroups*P

0.01vs NCgroup;#P

0.05##P

0.01vs DMgroup图各组大鼠肾皮质和蛋白的表达水平2I n-6,IL-8INRaFig.2Differential expressionof IL-6,IL-8and TNF-a proteinin eachgroup尿微量白蛋白排泄增加、血肌酎上升，提示持续高血讨论3糖导致肾损害发生同时实时荧光定量PCR及本研究发现糖尿病大鼠成模后8周出现24h Westernblot结果显示糖尿病大鼠肾小球炎症相关因子IL-

6、IL-

8、TNF-Q表达较正常大鼠明显升高与糖分泌状况，因此对本研究中的糖尿病大鼠血糖、血压、体重尿病大鼠比较，采用罗格列酮干预的糖尿病大鼠血糖、体重、影响较小然而罗格列酮明显减少了糖尿病大鼠尿白蛋白分肌酎及收缩压无明显变化，但上述炎症因子表达均降低，同泌，这一结果和国外的临床研究结果类似［］等［］8Bakris8时24h尿微量白蛋白排泄减少和Pistrosch等［9］在研究中均观察到罗格列酮可降低2型糖尿病患者的尿白蛋白排泄不过罗格列酮对于型糖尿病肾1糖尿病肾病（）是多因素引起的复杂性疾病既往DN病的影响还没有学者进行相应观察我们对型糖尿病动物1研究证明高糖、高脂、高血压、血液动力学改变等多种致病模型进行研究，结果发现罗格列酮可减少尿白蛋白排泄，综因素均参与了的发生、发展过程近年来研究发现，炎DN合罗格列酮对炎症因子的抑制作用，提示罗格列酮有可能症反应与的发生关系密切巨噬细胞、细胞等免疫细DN T通过抑制炎症而减轻肾损害，保护肾脏上述研究显示罗格胞在多种粘附因子、趋化因子和细胞因子的作用下在肾脏募列酮可能被作为一种新的有前途的治疗手段用于型糖尿病1集，引发局部炎症反应，加重血管损伤和基质纤维化［］45o肾病患者的治疗主要是由单核-巨噬细胞、细胞内皮细胞等多种细胞产IL-6生又在白细胞间发挥作用的一种细胞因子，具有调节免疫应总之，本研究提示罗格列酮可能通过抑制炎症细胞因答作用，并参与机体炎症反应是趋化因子超家IL-8CXC子、、在糖尿病大鼠肾脏的表达从而减轻肾IL-6IL-8TNF-族的典型代表许多细胞可分泌但单核细胞及巨噬细胞IL-8,损害，保护肾脏，其抗炎作用独立于降糖之外本研究为糖是的主要来源是一种多功能因子，其特异性趋IL-8IL-8尿病肾病的防治提供了新的途径化单核细胞及中性粒细胞进入炎性组织，促使其脱颗粒、产生超氧阴离子、引起呼吸爆发等，在炎性反应中起重要作用参考文献［］为单核巨噬细胞产生，作为主要促炎性反应因6TNF-a

[1]Remuzzi G,Ruggenenti P,Benigni A.Understanding thenature of子，可刺激免疫活性细胞产生白细胞介素等炎性反应因子，renal diseaseprogression!J].Kidney Int,1997,511:2-

15.也可诱导ICAMT的表达口-

6、

[2]Agewall S,Wikstrand J,Ljungman S,et al.Usefulness ofmicroalbuminuriain predictingcardiovascular mortalityin treated和均是炎性介质网络中的关键成分，已经有研IL-8TNF-Qhypertensive menwith andwithout diabetesmellitus.Risk Factor究证实上述炎性因子参与了急性肺损伤，感染性肠病、类风Intervention StudyGroupfJ].Am JCardiol,1997,802:164-

169.

[3]Ceriello A.Thiazolidincdiones asanti-inflammatory and湿性关节炎及动脉粥样硬化等多种炎症过程本研究发现antiatherogenic agents[J].Diabetes MetabRes Rev,2008,24l:14-

26.

[4]Ruster C,Wolf G.The roleof chemokinesand chemokinereceptors in诱导的糖尿病肾病大鼠模型肾小球、、STZ IL-6IL-8TNF-adiabetic nephropathy[J].Front Biosci,2008,131:944-

955.表达明显增高，与等口的研究一致，他们发现Navarro STZ

[5]Williams MD,Nadler JL.Inflammatory mechanismsof diabeticcomplications[J].Curr DiabRep,2007,73:242-

248.诱导的糖尿病大鼠肾皮质、表达明显增加，两者IL-6TNF-a

[6]Apostolakis S,Vogiatzi K,Amanatidou V,et al.Interleukin8and表达水平和肾重指数及尿白蛋白排泄有关我们的研究和其cardiovascular disease[J].Cardiovasc Res,2009,843:353-

360.他研究均提示炎症因子在糖尿病肾病发生发展中发挥重要

[7]Navarro JF,Milena FJ,Mora C,et al.Renal pro-inflammatory作用cytokine geneexpressionindiabeticnephropathy:effect ofangiotensin-converting enzymeinhibition andpentoxifyllineadministrationfJJ.Am JNephrol,2006,266:562-

570.罗格列酮作为ppar-Y选择性配体，主要通过与ppar-Y

[8]Bakris G,Viberti G,Weston WM,et al.Rosiglitazone reducesurinaryalbumin excretionin typeI diabetes[J].J HumHy-结合后从转录水平参与机体糖、脂肪代谢，增加外周组织对pertens,2003,171:7-

12.葡萄糖的摄取，降低游离脂肪酸，因而改善胰岛素抵抗，被

[9]Pistrosch F,Herbrig K,Kindel B,et al.Rosiglitazone improvesglomerularhyperfiltration,renal endothelialdysfunction,and视为胰岛素增敏剂研究发现罗格列酮具有抗炎作用，能抑microalbuminuria ofincipient diabeticnephropathyinpatients[J].Diabetes,2005,547:2206-

2211.制巨噬细胞活化，降低巨噬细胞和单核细胞中炎症因子的释收稿2010-05-15放和表达本研究观察了罗格列酮对糖尿病大鼠肾小球炎症因子表达的影响，结果发现在血糖没有明显变化的基础上，、、表达显著下降，提示罗格列酮对上述炎IL-6IL-8TNF-症因子的抑制效应不依赖于其降糖作用本研究中使用罗格列酮干预的糖尿病大鼠和未经干预的糖尿病大鼠相比，血糖、血压、体重没有明显变化由于大剂量诱导产生的糖尿病大鼠模型主要模拟人类STZ1型糖尿病，以胰岛细胞功能损伤为主要病理生理机制，而8罗格列酮并非直接针对细胞功能不足环节，不改善胰岛素B。