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中国呈Bl医苧.论著.葛根素对型糖尿病大鼠脂代谢及脂肪分化相关蛋白2基因表达的影响孙卫，郑学芝，崔荣军，张承玉，徐秋玲【摘要】目的观察葛根素（Pue）对2型糖尿病（T2DM）大鼠脂代谢及脂肪分化相关蛋白（ADRP）基因mRNA表达的影响方法大鼠高糖高脂饮食伴尾静脉注射小剂量链腺佐菌素（STZ）25mg/kg复制T2DM大鼠模型，将造模大鼠随机分为模型组（腹腔注射丙二醇）和3个Pue治疗组（腹腔注射
40、
80、160mg/kg的Pue）,另选10只大鼠为正常对照组（腹腔注射丙二醇）持续腹腔注射6周后，测定各组大鼠空腹血糖（FBG）、血清胰岛素（FINS）和血脂水平，并计算胰岛素敏感指数（ISI）;同时以RT-PCR法检测脂肪组织ADRP基因mRNA水平结果模型组大鼠FBG、FINS、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白-胆固醇（HD-C）、低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）、游离脂肪酸（FFA）水平及ISI与对照组比较，差别有统计学意义（P
0.05）;Pue高、中剂量组大鼠FBG、FINS、TC、TG、LDL-C、FFA水平及ISI与模型组比较，差别有统计学意义（P
0.05）,Pue低剂量组大鼠FBG、TC、TG、FFA水平及ISA与模型组比较，差别有统计学意义（P
0.05）与对照组比较，模型组大鼠脂肪组织ADRP基因mRNA表达显著增高（P
0.01）,Pue高、中剂量组大鼠ADRP基因mRNA表达较模型组下降（P
0.05）o结论Pue可通过降低T2DM大鼠脂肪组织ADRP基因mRNA表达，改善糖脂代谢紊乱和胰岛素抵抗【关键词】葛根素；糖尿病，2型；脂肪分化相关蛋白；血脂；基因表达【中图分类号】R
587.1【文献标识码】A【文章编号】1007-9572
（2008）07AT161-03Eff ectof Puerarinon LipidMetabolism andAdipophilin GeneExpression ofType TwoDiabetes MellitusRats SUNWei,ZHENG Xue-zhi,CUI Rong-jun,et al.Department ofPhysiology,Mudanjiang MedicalCollege,Mudanjiang157011,ChinaAbstract]Objective Toobserve theeffects of puerarinPue onlipid metabolismand adiposedifferentiated-related proteinADRP gene mRNA expression inratswith type,2diabetes mellitusT2DM.Methods Ratswere fedwith highglucose andfat dietand injectedwith smalldose ofstreptozocinSTZ25mg/kg toset upT2DM model.The modelrats wererandomly dividedas modelcontrol groupand threePue groups40,80,160mg/kgwith10in each group,another10rats wereselectedas normalcontrol group.Six weekslater,the levelsof fastingblood glucoseFBG,fasting insulinFINSandblood lipidwere measured,and insulinsensitivity indexISIwascalculated.,ADRPgene mRNA in fatty tissuewas determinedby RT-PCR.Results Comparedwith modelcontrol group,the differencesin levelsof FBG,FINS,totalcholesterol TC,high densitylipoprotein-cholesterolHDL-C,lower densitylipoprotein-cholesterolLDL-Cfree fattyac idFFAand ISI in themodel group,had astatistic significanceP
0.05;the differencesin levelsof FBG,FINS,TC,TG,LDL-C,FFA andISI in the highand middle dosage ofpuerarin groupshad astatisticsignificanceP
0.05;the differencesin levelsof FBG,TC,TG,FFA andISIinthe lowerdosage ofpuerarin grouphad astatisticsignificanceP
0.05;Compared withmodelcontrol group,the ADRPgenemRNAexpression offatty tissueinthemodel groupobviously in-creasedP0,01,but theexpressions inthe highand middledosageofpueraringroups decreasedobviouslyP
0.
05.Conclusion Puerarincould improvelipid metabolismdisorders andinsulin resistanceby decreasingthe ADRPgenemRNAexpressionin T2DM.[Key word]Puerarin;Diabetes mellitus,type2;Adipophilin;Lipid metabolism;Gene expression2型糖尿病（T2DM）的主要特征是胰岛素抵抗现象，且燥根中提取的单体，其化学结构为8-B-D-毗喃葡萄糖-4,7-二羟基异黄酮背许多实验发现葛根素不仅能调节机体的糖脂代谢，基金项目黑龙江省卫生厅科研项目
（2006392）;牡丹江医学院同时对胰岛素抵抗有一定的改善3-4本实验科研项目（C200MJ3）作者单位157011黑龙江省牡丹江市，牡丹江医学院生理教研室（孙卫，郑学芝，张承玉，徐秋玲）;牡丹江医学院生物化学和分子生物学教研室（崔荣军）与肥胖密切相关脂肪分化相关蛋白（ADRP）是一种反映细胞内脂质积聚的灵敏而特异的指标，对脂肪组织的分化和功能非常重要，包括能量储存及其内分泌功能，特别是与肥胖、胰岛素抵抗的形成有关［2］葛根素（Pue）是从豆科植物野葛的干•1162•用（x±s）表示，多组间均数比较采用F检验，组间两两比较采用LSD检验P
0.05为差别有统计学意义通过复制T2DM模型，探讨葛根素降糖、降脂及改善胰岛素抵抗的2结果作用
2.1各组大鼠FBG、FINS水平和ISI比较模型组大鼠FBG、FINS1与方法水平和ISI与对照组比较，差别有统计学意义（P〈
0.01）;Pue
1.1实验动物选取健康Wistar大鼠60只，2月龄，雌雄各半，高、中、低剂量组大鼠FBG、ISI及Pue高、中剂量组大鼠FINS体质量180240g,由哈尔滨医科大学实验动物中心提供〜与模型组比较，差别有统计学意义（P
0.05,见表1）o
1.2药品与试剂葛根素注射液购自海南斯达制药有限公司（批
2.2各组大鼠血脂水平比较模型组大鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C.号1120023176）;链月尿佐菌素（STZ）购于美国Sigma公司，FFA水平与对照组比较，差别有统计学意义（P
0.05）;Pue高、临用时溶于pH
4.5的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲溶液，配成2%的STZ中、低剂量组大鼠TC、TG、FFA水平及Pue高、中剂量组LDL-C溶液；胰岛素放射免疫分析试剂盒为北京北方生物技术研究所产水平与模型组比较，差别有统计学意义（P
0.05,见表2）品；葡萄糖、游离脂肪酸（FFA）试剂盒购自南京建成生物工程研
2.3各组大鼠大网膜脂肪组织ADRP基因mRNA表达情况扩增后究所；总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白-胆固得到GAPDH280bp和ADRP523bp两个片段（见图Do图像分析结醇（HDL-C）、低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）试剂盒由北京果显示，与对照组比较，模型组大鼠大网膜脂肪组织ADRP基因mRNA中生生物技术有限公司提供；RNA表达增高（P
0.01）;Pue高、中剂抽提试剂盒、RT-PCR试剂盒来自上海生工生物工程公司量组ADRP基因mRNA表达较模型组下降（P
0.05）,而Pue低剂量
1.3方法组与模型组比较，差别无统计学意义（P
0.05）o
1.
3.1动物模型制备实验前将60只大鼠置安静、避强光、洁净、室温1828c的环境中适应性饲养3d随机留取10只大鼠〜作为正常对照组，给予基础饲料（糖类占60%蛋白质占22%,脂肪表1各组大鼠FBG、FINS水平和ISI比较x±s占10%（植物脂肪为主），其他成分占8凯由牡丹江医学院动物Table1Comparison of the levelof FBG,FINS andTSI ineach group实验中心提供）其余50只大鼠给予高糖高脂饲料（由基础饲料组别只数FBGmmol/L FINSmu/L ISI加炼猪油（25%）、蔗糖（20%）、鲜鸡蛋（3%）制成，其中糖类对照组
104.5±
1.
016.9±
3.1-
4.0±l.1占50%,蛋白质占13%,脂肪占30%（动物脂肪为主），其他成分占模型组
1013.8±
3.
44.1±
7.9*-
6.4±
1.7*1*7%）持续喂养4周后，尾静脉一次性注射STZ溶液25mg/kg,而Pue高剂量组
108.7±
1.
929.7±
5.-
4.3±
1.1A43A
6.3±
6.对照组大鼠注射相同体积的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液，72h后测空Pue中剂量组
109.4±
2.1-
4.8±
1.2A14Pue低剂量组
1010.9±
2.8A
39.8±
7.2-
4.9±
1.2A腹血糖，
11.1nmiol/L〈血糖值
33.3mmol/L为造模成功将造模成功的40只（筛选后，余者弃掉）糖尿病大鼠随机分为糖尿F值
22.
09529.
6774.841P值
0.
0000.
0000.002病模型组和Pue高、中、低剂量组，各10只大鼠，继续喂以高糖高脂饲料”注与对照组比较，P
0.01;与模型组比较，△P〈Q05,AP
0.
011.
3.2给药方法分别给予Pue高、中、低剂量组大鼠Pue
160、
80、40mg•kg1•d”,连续腹腔注射6周模型组和对照组大表2各组大鼠血脂水平比较（x±s,™ol/L）鼠同时注射等体积的丙二醇Table2The comparisonofthelevals ofrat blood-fat ineachgroup
1.
3.3指标检测方法以葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖组别只数TC TGHDL-C LDL-C FFA（FBG）;以放射免疫方法测定空腹胰岛素（FINS）;计算空腹胰岛对照组
101.3±
0.
10.6±
0.
21.7±
0.
20.6±
0.
21.4±
0.2素敏感指数（ISI）,ISI=ln（1/（FBGXFINS））;FFA测定按试模型组
102.1+
0.2°
1.7+
0.4°
1.4+
0.1°
1.1±
0.
301.7±
0.3*剂盒操作说明进行；IIOD-PAP法测TC,GPO-PAP法测TG,直接法Pue高剂量组
101.5±
0.
11.0±
0.
31.5±
0.
20.7+
0.2A
0.9±
0.1A测HDL-C和LDL-CoPue中剂量组
101.7±
0.
241.2±
0.
341.5±
0.
10.8±
0.2A
1.2±
0.
241.
1.4RT-PCR反应按RNA抽提试剂盒说明书提取大网膜脂肪组低剂量组织总RNA,以提取的总RNA为模板，用RT-PCR法检测ADRP基因表Pue
101.9±
0.
21.4±
0.3A
1.4±
0.
30.9+
0.
21.4±
0.2AF值
28.
93716.
5484.
2576.
38220.913达ADRP基因引物序列为上游Pl:5-CCAAGGATTCTGTAGCCAGCA;值P
0.
0000.
0000.
0050.
0000.000下游P2:5-ACAGTG-GAACTCATCGGTGTC;扩增产物长度约523注与对照组比较，P
0.05,°P
0.01;与模型组比较，APbp;以GAPDH基
0.05,AP
0.01因为内参照，扩增产物长度280bp,引物序列为；上游P3:5-GGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGA;下游P4:5-TTACTOCTTGGAGGCCATGTGGGPCR反应进行30个循环（94℃5min,50℃30s,72℃30s）和1个72C10min的循环设空白对照，GAPDH作为阳性对照PCR产物做
1.0%琼脂糖凝胶电泳，然后用凝胶分析软件TotalLab
2.0进行光密度分析ADRP和GAPDH基因PCR产物电泳条带光密度的比值作为ADRP基因表达水平的相对值，即ADRP基因mRNA表达相对值二ADRP mRNA光密度/GAPDHmRNA光密度
1.4统计学方法采用SPSS
10.0软件进行统计学分析计量资料•1163•疗后，高、中剂量组的表达显著降低说明葛根素通过抑ADRP制脂肪组织基因的表达，降低胰岛素抵抗水平，从而降低ADRP大鼠血糖和改善体内脂代谢紊乱，达到治疗糖尿病的目的，T2DM但其确切的作用机制尚待进一步实验研究ADRP参考文献—523bp王淑艳，李长贵，苗志敏.代谢综合征的研究进展中国全科医1[J].学,-280bp2005,84:330-
332.罗敏.型糖尿病相关基因的研究现状和展望国外医学内分泌22[J].M GAPDH学分册,2002,223:141-
145.图1各组大鼠脂肪组织中ADRPmRNA的表达1:对照组；2:模型组；于健，苏珂.葛根素对型糖尿病病人胰岛素抵抗的影响中国低剂量组;中剂量组;高剂量组3H[J].3:Pue4:Pue5:Pue Figure1The新药与临床杂志,2002,2110:585-
587.expression ofADRP mRNAinfattytissue1:control group;2:T2DM modelgroup;3;low dosageof Puegroups;孙卫，郑学芝，李丽，等.葛根素对糖尿病大鼠胰腺线粒体氧化应4激及酶的影响中国全科医学，4:middledosageof Puegroups;3:high dosageof Puegroups ATP[J].2007,1014:
1154.5Roden M,Stingl H,Chandramouli V,et al.Effects offree fatty acid elevationonpostabsoiptive endogenousglucose productionand gluconeogenesisin讨论3humans[J].Diabetes,2000,495:701-
707.近年来，脂毒性在发病中的作用逐渐受到重视肌肉T2DM中脂质的积聚可引起胰岛素抵抗，脂质在胰腺的积聚会损害胰岛6Serrero G,Frolov A,Schroeder F,et al.Adipose differentionrelatedB细胞胰岛素分泌功能糖尿病大鼠由于胰岛素生物活性不足，激protein:expression,purification ofrecombinant proteinin Escherichiacoliand characterizationof itsfattyacidbinding properties[J].Bio-chim Biophys素敏感性脂肪酶活性增加，产生葡萄糖利用障碍，抗脂解作用降Acta,2000,1488:245-
254.低，使得水平升高，血糖和、、FFA TC TG LDL7Buechler C,Ritter M,Duong CO,et al.Adipophilin isa sensitivemarker for水平也增高，对机体产生糖毒性和脂毒性，引起机体多功能受-Clipid loadingin humanblood monocytes[J].Biochem BiophysActa,损本实验结果显示，大鼠出现了明显的脂代谢紊乱，即
[5]T2DM2001,15321/2:97-
104.、、、水平升高，而水平TCTGLDL-C FFAHDL-C8Cupta RA,Brockman JA,SarafP,et al.Target genesof peroxisomeproliferator降低葛根素各剂量治疗组大鼠上述脂代谢紊乱明显减轻，、TC-activated receptorgamma incolorectal cancercells[J].J Biol水平显著降低TG.LDL-CChem,2001,27632:29681-
29687.脂肪组织是胰岛素敏感的重要靶组织，也是最早发生胰岛素9Chen JS,Greenberg AS,Tseng YZ,et al.Possible involvementof protein抵抗的部位是一种存在于灵长类脂肪细胞的相对分子量为ADRP kinaseC inthe inductionof adiposedifferrention-related proteinby Sterol的蛋白质在脂肪细胞分化的早期，就有表达早于脂53000ADRP esterin RAW
264.7macrophages[J].J CellBiocheni,2001,832:187-
199.肪酸结合蛋白和脂蛋白酯酶，高水平的表达出现在成熟的ADRP收稿日期:2008-05-23脂肪细胞是形成细胞内脂质小滴囊泡的主要成分，也是
[6]ADRP本文编辑刘莉巨噬细胞、脂肪细胞内脂质沉积的标志”可促进脂肪酸的ADRP吸收，最终导致细胞质内增多增多可造成细胞内长链FFA FFA脂肪酰辅酶堆积，浓度增加，可直接影响胰岛细胞对葡萄糖刺A激下的胰岛素释放反应基因表达受过氧化物酶增殖体激活ADRP受体、、调控，脂肪酸经由介导促进PPARy PPARaPPAR5PPAR ADRP的高表达还能通过增加胰岛细胞、肌肉和脂肪细胞内的
[8];ADRP B脂肪积聚，引起胰岛素分泌异常和胰岛素抵抗另外，还阻止蛋白激酶的活性，将导致基因的高表达和细胞内脂滴增多、C PPAR变大，使用药物使基因表达下降时，将使脂滴融解、消失PPAR9]本研究结果显示，大鼠、较正常大鼠显著升T2DM FBGFTNS高，显著下降，说明糖尿病大鼠胰岛素抵抗增加，血糖水平增1SI高而经过葛根素治疗后，大鼠血糖水平和胰岛素抵抗水平下降葛根素注射液作为一种纯中药制剂，很早就被应用于糖尿病的治疗，它可以降低血糖，改善胰岛素抵抗本实验还发现，大T2DM鼠大网膜脂肪组织基因的表达明显增加，葛根素治ADRP mRNA。
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