血糖波动和降钙素基因相关肽对糖尿病大鼠肾脏病变的影响

Mt®•他•.论著.血糖波动和降钙素基因相关肽对糖尿病大鼠肾脏病变的影响王亚娇，苏珂，龙艳，康省，于健，胡璟，黄漓莉，江仁美【摘要】目的观察血糖波动和降钙素基因相关肽（CGRP）对糖尿病大鼠肾脏病变的影响方法将SPF级健康雄性SD大鼠40只，采用随机数字表法分为正常对照组（A组）、正常血糖波动组（B组）、糖尿病稳定高血糖组（C组）和糖尿病血糖波动组（0组），每组8只C组、D组大鼠采用链胭佐菌素60mg/kg腹腔注射建立糖尿病模型，糖尿病造模成功后D组每天8:30和14:30腹部皮下注射普通胰岛素

1、2U,B组和D组每日8:00和14:00灌葡萄糖2g/kg,

2.0ml/次，造成血糖波动模型实验9周后测定体质量、肾指数（KI）、平均血糖（MBG）、每日血糖水平标准差（SDBG）、最大血糖波动幅度（LAGE）、24h尿微量清蛋白、尿素氮（BUN）、肌酎（Cr）、糖化血红蛋白（HbA;o）、CGRP水平，通过光镜观察肾脏结构改变结果C组和D组较A组和B组KI、MBG、SDBG、LAGE、24h尿微量清蛋白、BUN、Cr、HbA水平升高，体质量、CGRP水平降低（P

0.05）;D组较C组KI、SDBG、LAGE、24h尿微量清蛋白、BUN、Cr水平升高，MBG、CGRP水平降低（P〈

0.05）Pearson相关性分析结果显示，SDBG与24h尿微量清蛋白（厂

0.927,P

0.01）、BUN（r=

0.883,P

0.01）Cr（r=

0.825,P

0.01）呈正相关，与CGRP呈负相关（r=-

0.823,P

0.01相CGRP与24h尿微量清蛋白（r=-

0.878,P

0.01）.BUN（r=-

0.792,P

0.01）.Cr（r=-

0.796,P

0.01）呈负相关结论血糖波动和CGRP水平的降低与糖尿病肾病的发生发展有关【关键词】血糖；降钙素基因相关肽；大鼠；糖尿病肾病【中图分类号】R

587.1【文献标识码】A doi:

10.3969/j.issn.1007-

9572.

2014.

06.010王亚娇，苏珂，龙艳，等.血糖波动和降钙素基因相关肽对糖尿病大鼠肾脏病变的影响[J].中国全科医学,2014,17

（6）:641-

644.[www.chinagp.net]Effe ctsof BloodGlucose Fluctuationand CalcitoninGene-related Peptideon KidneyDiseases inDiabetic RatsWANG Ya-jiao,SU Ke,LONG Yan,et al.Department ofEndocrinology,Hospial Afiliated toGuilin MedicalCollege,Guilin541X4,China[Abstract]Objective Toexplore theeffects of blood glucose fluctuation andcalcitonin gene-related peptide CGRP onkidneydiseases indiabetic rats.Methods40Sprague-DawleySD ratswere randomlydivided intocontrol group group A,normal bloodglucosefluctuation groupgroup B,stable highblood glucosegroupgroup C andfluctuant blood glucose groupgroup D.Diabetes ratsin group C and groupD wereinduced byintraperitoneal injectionof STZby60mg/kg.Group Dwas givenabdominal subcutaneousinjectionof insulinby1-2U at8:30and14:30,while groupB and groupDwas givenintragastric administrationof glucoseby2g/kg at8:00and14:00,

2.0ml oncefor thebloodglucosefluctuation model.Nine weekslater,weight,kidney indexKI,mean bloodglucoseMBG,standard deviationofbloodglucose SDBG,largest amplitudeof glycemicexcursionsLAGE,24h urinaryalbumin,blood ureanitrogenBUN,serum cre-atinineCr,HbA„blood CGRP were determinedand thechange ofkidney microstructurewas observedbymicroscope.Results Compared with groupA andgroupB,the KI,MBG,SDBG,LAGE,24h urinaryalbumin,BUN,Cr andHbA wereincreased,while theweight and CGRPwere decreased ingroup CandgroupDP

0.

05.ComparedwithgroupC,the KI,SDBG,LAGE,24h urinaryalbumin,BUN and Cr wereincreased,and MBGand CGRPweredecreasedingroupDP

0.

05.Pearson correlationanalysisshowed thatSDBG waspositively correlatedwith24h urinaryalbumin r=

0.927,P

0.01,BUNr=

0.883,P0,01andCrr=

0.825,P

0.01,but wasnegatively correlatedwith CGRPr=-

0.823,P

0.

01.CGRP wasnegatively correlatedwith24h urinaryalbumin r=-

0.878,P

0.01,BUN r=-

0.792,P

0.01andCr r=-

0.796,P

0.

01.Conclusion Blood glucosefluctuationand thedecrease of the levelsofCGRP areassociated withthe developmentof diabeticnephropathy.【Key words]Bloodglucose;Calcitonin gene-related petide;Rats;Diabetic nephropathies基金项目广西自然科学基金项目（2012GXNSFAA053085）;广西教育厅科研课题（2012LX245）作者单位541004广西桂林市，桂林医学院附属医院内分泌科通信作者苏珂，541004广西桂林市，桂林医学院附属医院内分泌科；E-mail:sul3978316336@

163.com本研究重点大血糖波动幅度LAGE即日内血糖最高值与最低值之差由于饮食控制、服药依从性差、用药不合理等多种因素的造模9周后，留24h尿测24h尿微量清蛋白，禁食12h,影响，临床上糖尿病患者血糖波动较大，降钙素基因相关肽是已以10%水合氯醛腹腔麻醉，心内取血测血尿素氮BUN、肌知舒血管作用最强的多肽本研究通过建立糖尿病血糖波动模型，酎Cr、糖化血红蛋白HbA,o水平从病理、分子方面分析血糖波动和降钙素基因相关肽对糖尿病肾

1.

3.3血清CGRP测定心内取血离心后得血清，采用酶病的影响，为揭示糖尿病肾病的病因等提供理论依据联免疫吸附法ELISA检测血清CGRP水平,・°aA•a，P/病理标本取材取左肾，滤纸吸干血迹后电子天平称重得肾糖尿病的主要危害在于长期慢性的高血糖以及其他代湿质量，肾湿质量与体质量的比为肾指数KI,KIg/kg=谢紊乱导致全身多种组织器官的损伤和功能异常慢性高左肾质量/体质量，部分肾脏组织血糖主要表现为慢性持续性高血糖和慢性波动性高血糖，用4%多聚甲醛液固定，石蜡包埋，常规切片苏木素-伊红HE由于受饮食控制不佳、用药不合理、胰岛素抵抗等多种因染色，显微镜观察肾脏形态学的改变并拍照素的影响，临床上糖尿病患者的血糖波动较大，研究发现

1.4统计学方法所有资料经SPSS

17.0统计软件进行处理波动性高血糖比持续性高血糖危害更大［2］降钙素基因计量资料以x±s表示，多组间比较采用方差分析，组间相关肽CGRP是一种目前已知的最强的内源性舒血管多肽，两两比较采用q检验；相关性分析采用Pearson相关分析通过抑制肾血管细胞收缩，增加肾小球毛细血管超滤系数，以P〈

0.05为差异有统计学意义改善肾脏微循环，对肾脏有保护作用3］本研究通过建立波动性高血糖糖尿病大鼠模型，观察比较血糖波动、CGRP2结果与肾功能、肾脏病理之间的关系，探讨其与糖尿病肾病DN

1.114组大鼠体质量、KI、MBG、SDBG、LAGE比较实验之间的关系结束后C组和D组与A组比较，大鼠出现精神状态萎靡，毛发竖起粗糙无光泽，动作反应迟钝，弓背蜷缩，饮水量、1材料与方法饮食量、尿量增加C组和D组大鼠体质量、KI、MBG、SDBG、

1.1材料SPF级健康雄性SD大鼠40只，体质量150200g,〜LAGE与A组和B组比较，差异均有统计学意义P

0.05;D68周龄桂林医学院SPF级实验动物中心提供，许可证〜组大鼠KI、MBG SDBG、LAGE与C组比较，差异均有统计学号SCXK桂2007-0001;链服佐菌素STZ及枸椽酸钠分意义P

0.05,见表1o析纯Sigma公司；普通胰岛素10ml:400U通化东宝药业股份有限公司；罗氏卓越型血糖仪及配套试纸瑞士罗

1.24组大鼠24h尿微量清蛋白、BUN、Cr、HbA、CGRPo氏公司；CGRP试剂盒武汉华美生物工程有限公司；其比较C组和D组大鼠24h尿微量清蛋白、BUN、Cr、HbA,他试剂及材料均购自南京建成生物工程研究所、CGRP与A组和B组比较，差异均有统计学意义P

0.o05;D组大鼠24h尿微量清蛋白、

1.2方法40只大鼠按照随机数字表法各取8只作为正常BUN、Cr、CGRP与C组比较，差异均有统计学意义P

0.05,对照组A组和正常血糖波动组B组，其余大鼠按见表260mg/kg剂量左下腹腔注射STZ,72h后取尾血测血糖，凡血糖

16.7mmol/L的大鼠定为糖尿病模型符合糖尿病

1.3相关性分析Pearson相关性分析结果显示，SDBG与条件的大鼠按照随机数字表法分为糖尿病稳定高血糖组C24h尿微量清蛋白r=

0.927,P

0.

01、BUNr组和糖尿病血糖波动组D组，每组各8只糖尿病造模=

0.883,P

0.

01、Crr=

0.825,P

0.01呈正相关，成功后D组每天8:30和14:30腹部皮下注射普通胰岛素1与CGRP呈负相关r=-

0.823,P

0.01;2U,B组和D组每日8:00和14:00灌葡萄糖2g/kg,

2.0CGRP与24h尿微量清蛋白r=-

0.878,P

0.01〜ml/次，造成血糖波动模型，A组和C组按以上的时间和方BUNr=-

0.792,P

0.01Crr=-

0.796,P法灌

0.9%氯化钠溶液

2.0ml,连续9周所有大鼠自由饮水，

0.01呈负相关喂食正常饲料

2.4光镜下大鼠肾脏结构的改变光镜下见A组和B组的

1.3观察指标肾小球和肾小管结构未见明显改变C组和D组

1.

3.1一般情况精神、活动、毛发、饮食等

1.

3.2生化指标检测采用罗氏卓越型血糖仪及配套试纸连续9周每周进行一次全天7个时间点的血糖检测，时间分别是8:

00、8:

30、10:

00、14:

00、14:

30、16:

00、20:00o计算每组大鼠平均血糖MBG水平，每日血糖水平标准差SDBG反映血糖的稳定性，最较A组出现肾小球囊腔扩张，肾小球细胞减少，炎性细胞明糖尿病大鼠血糖波动模型造模成功本研究显示D组浸润，肾小管结构紊乱，上述变化D组较C组严重（见和C组24h尿微量清蛋白、BUN、Cr明显高于A组，D组图1）高于C组光镜下肾结构见D组较C组出现明显的肾小3讨论球囊腔扩张，肾小球细胞减少，炎性细胞浸润，肾小管DN是糖尿病最常见的慢性并发症之一，其发生是由结构紊乱相关分析显示SDBG与24h尿微量清蛋白、于遗传、环境、糖代谢紊乱等多种因素长期共同作用的BUN、Cr呈正相关，以上研究结果说明血糖波动对糖尿结果，超过3%发展为终末期肾病Muggeo等对2型糖病肾脏的损害比持续性高血糖更明显，提示血糖波动可尿病患者进行了10年的随访，发现血糖变异〉

18.7%能是DN的独立危险因素，本研究结果与相关报道

④相和〈

11.7%者累计病死率分别为

39.6%和

23.7%,校正后似国内外相关的研究认为波动性高血糖可能易通过不血糖变异幅度大者发生死亡的相对危险度为

1.68,说明同的代谢途径激活如核因子kB、谷胱甘肽过氧血糖波动大的患者病死率比单纯性高血糖高一项临床研究显示HbA,控制在

6.5%情况下，血糖波动大的2表组大鼠体质量、、比较14KK MBG.SDBG LAGEx±s型糖尿病患者更易于诱发糖尿病微量蛋白尿的发生4Table1Comparison ofweight,KI,MBG,SDBG andLAGE in the four groups体外基础研究及血糖波动动物模型研究均表明，波动性姐兄伤的体质ll llKIMBG SDBCLAGE高血糖比持续性高血糖更易促进肾小管上皮细胞凋亡，量组别例双（g）g/kg nmiol/L niniol/L nunol/L氧化应激水平增高5;使肾小球系膜细胞胶原IV合成增组A8435±

343.45±

0.

316.37±

0.

640.55±

0.

281.45±

0.67加6,加速内皮细胞依赖性舒张损伤］,加速肾小管间质组B8428±

413.56±

0.

296.41±

0.

790.68±

0.

361.88±

1.15纤维化的进程⑻等，以上研究说明血糖波动比单纯性高C组8336±

354.67+

0.

2324.45+

4.

133.56±

1.16A

9.89±

2.69A组血糖危害性更大本研究显示实验结束后D组大鼠的体D8320±

345.26±

0.

2220.91±

8.

678.98±

1.

1522.17±

2.69值质量、HbA,o与C组无差异，通过量化分析血糖稳定性F

21.

92088.

3261956.

7331558.

1551137.459值P

0.

0000.

0000.

0000.

0000.000显示D组的SDBG、LAGE均高于C组，而MBG低于C组，注肾指数，二平均血糖，二每日血糖水平标准差，KI=MBG SDBG说明D组的日间血糖稳定性差，日间血糖波动幅度大，二最大血糖波动幅度；与组比较，与组比较，.LAGE AP

0.05;B/MX而C组基本处于相对稳定的高水平状态，A组和B组则与组比较，05;C4P

0.05在参考范围以上结果说表组大鼠尿微量清蛋白、、、、比较2424h BUN Cr HbA,eCGRPx±s〔Tabie2Comparison of24h urinaryalbumin,BUN,Cr,HbA eandCGRinthe fourgroups组别例数24h尿微量清蛋白（ug/24hBUNmmol/L Cru mol/LHbA%CGRPpg/ml1o组A

858.03±

20.

607.24+

1.

3865.76±

13.

465.44±

0.

2637.25±

9.30组B

867.36±

50.

748.20±

1.

3289.67±

18.

365.59±

0.

2835.79±

7.12组C

8389.87+

35.

4611.78+

2.47・△

136.42+

17.46•△

11.32+035•A

17.50±

1.73*A组D

8542.50±

46.30*A

17.55±

2.91*AA

176.70±

44.85*AA

10.81±

0.44*A

11.32±

1.75*A4值F

290.

80338.

25927.

522707.

90937.910值P

0.

0000.

0000.

0000.

0000.000注二尿素氮，肌酢，二糖化血红蛋白，二降钙素基因相关肽；与组比较，与组比较，与BUNCr=HbA,CGRP A*P

0.05;B AP

0.05;C组比较，▲P

0.05图组大鼠肾脏形态学变化染色，14HE X400Figure1Morphology changeof ratkidney inthefourgroups10-year survivalof type2diabetic patients:the VeronaDiabetes Study[J].化物酶、自由基、线粒体超氧阴离子等多种氧化应激敏感Diabetes Care,2000,231:45-

5.细胞因子，产生过多的活性氧诱导细胞线粒体内氧化应激3El hawary AM,Poon JS,Pang CC.Receptor subtypesmediating renalactions of反应，同时形成晚期糖基化终产物并沉积，进而启动或调calcitonin gene-related peptide[J].European Journalof Pharmacology,1995,286节一些炎性因子、黏附分子等转录，直接或通过一系列的3:255-

263.氧化链式反应引起血管内皮损伤，血管收缩，最终造成血周健，贾伟平，马晓静，等.糖化血红蛋白控制理想型糖尿病患者血糖42管炎症、血栓形成、血管基底膜增厚、血管硬化等，加速波动特征及其与微量白蛋白尿的关系中华医学杂志，[J].2008,了DN的发生发展5-79-8842:2977-

2981.许益笑，王德选，李素娟，等.血糖波动对糖尿病大鼠肾脏氧化应激与凋肾脏的血管床有丰富的CGRP受体分布，CGRP通过与5亡的影响中华内分泌代谢杂志，[J].2012,284:325-

329.这些受体结合使肾血管舒张、拮抗内皮素对血管收缩、抑周冬梅，李伟,血糖波动对型糖尿病大鼠肾组织基质金属蛋白前和金619制血管平滑肌细胞的增殖等，从而增加肾小球滤过率和有属蛋白酶组织抑制剂表达的影响中华肾脏病杂志，1[J].2011,272:效血容量，参与肾脏血流动力学的变化，对肾脏有很好的130-

131.保护作用本研究结果显示D组和C组的CGRP水平低于A叩7Horvath EM,Benko R,Kiss L,et al.R idglyeaemicswings inducenitrosative组，相关分析显示CGRP和24h尿微量清蛋白、BUN、Crstress,activate polyADP-ribosepolymerase andimpair endothelialfunction ina之间呈负相关，说明CGRP与DN相关，同时提示CGRP可能rat modelof diabetesmellitus[J],Dia-betologia,2009,525:952-

961.作为DN的早期预测因素，与相关报道［2］相似本研究曹罗元，黄宝英，富显果，等，波动性高糖对肾小管上皮细胞8Wnt/0-catenin显示D组的CGRP水平较C组降低，SDBG与CGRP呈负相关，信号途径的影响中国细胞生物学学报,[J].2012,347:690-

694.提示血糖波动可能是CGRP的影响因素已有研究报道体外9Quagliaro L,Piconi L,Assaloni R,et al.Intemmittent highglueose enhances培养人脐静脉内皮细胞，波动性高血糖组内皮素合成明显ICAM-1,VCAM-1and E-selectin expressionin humanumbilical veinendothelial高于持续高血糖组，内皮素增多可使血管内皮细胞损伤，导cells inculture:the distinctrole ofprotein kinaseCandmitochondrial superoxide致组织缺血缺氧，使CGRP免疫反应纤维减少，CGRP释放随production[J].Atherosclerosis,2005,1832:259-

267.之减少，这可能是血糖波动组比持续高血糖组CGRP水平降10El-Osta A,Brasacchio D,Yao D,et al.Transient highglueose causespersistent低明显的原因之一［13］CGRP降低使其对肾脏的保护功epigenetie changesand alteredgene expressionduring subsequentnormoglycemia[J],The Jourmnalof ExperimentalMedi-cine,2008,20510:2409-

2417.能减弱，当循环中的CGRP显著减少时内皮素的作用也相应11Forbes JM,Coughlan MT,Cooper ME.Oxidative stressas amajor culpritin kidney增强，内皮素可引起周围的血管长时间收缩，加重组织缺disease indiabetes|J].Diabetes,2008,576:1446-

1454.血缺氧和血管内皮损伤等一系列病理过程，而缺血缺氧又孟德欣，贾秀月，李晶.糖尿病肾病大鼠血浆中含量及尿12CGRP,ET24h可促进内皮素的合成，进一步拮抗了CGRP的作用，形成了微量白蛋白变化的相关性研究中国老年学杂志，[J].2008,恶性循环，引起微血栓形成、血管平滑肌细胞增殖、血管2821:2110-

2111.内皮细胞损伤等，最终导致肾功能受损，促进了DN的发生史丽，苏胜偶，赵占胜，等.波动性葡萄糖对内皮细胞凋亡及一氧化氮，13发展3］内皮素合成的影响河北医科大学学报，[J],2009,305:439-

441.综上所述，血糖波动与CGRP的降低可能共同参与了DN收稿日期2Q13-05-26;修回日期:2013-12-05本文编辑陈素芳发生发展过程，临床上应减少血糖波动范围，平稳降糖，动态观察CGRP的变化，对DN的防治有重要的意义本课题人员贡献苏珂负责课题设计、组织实施、质控；龙艳、于健、胡璟负责分子生物学实验操作；王亚娇、康省、黄满莉、江仁美负责动物模型构建、统计分析参考文献1PKC-DRS StudyGroup.The effectof ruboxistaurinon visualloss inpatients withmoderatelysevere toveiy severenonproliferative diabeticretinopathy:initial resultsoftheProtein KinaseC betaInhibitor DiabetieRetinopathyStudyPKC-DRSmulticenter randomizedclinical trial[J].Diabetes,2005,547:2188-

2197.2Muggeo M,Zoppini G,Bonora E,et al.Fasting plasmaglucose variabilitypredicts。