实验室室内质量控制程序

实验室室内质量控制程序

（一）目的保证ELISA检测结果准确可靠，充分发挥其方法学的优点

（二）该SOP变动程序本标准操作程序的变动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字专业主管、科主任

（三）方法

1、分析前质控

（1）人员培训

①实验是人操作的，因此检验人员需经过培训，熟练掌握本专业如下几方面的技术知识

②检验项目的基本原理（ELISA原理）；

③临床意义；1）熟悉检测技巧，了解易出差错的环节及难点；2）熟悉检测试剂性能（包括试剂盒组成，包被片段及其组成）；3）熟悉检测仪器的原理及性能；掌握数据处理的能力和质量控制知识4）某些特殊项目检测如抗HIV等需经有关部门组织的专门培训班，考试合格后持证上岗

（2）室内质控血清的制备在开始进行质控时，只需要有3个质控血清测定值即可进行质控当这组数据扩大到20次有效值时就可以计算RCV的X,So方法⑴先将测定值从小到大排列，XI最小，Xn最大；

（2）计算X和s；⑶计算SI上限值和下限值SI±=（X最小-X）/S,SI下二（X最大-X）/S⑷对照SI表，检查是否出控，SI上、下限《规定值，在控；SI上或下限〉规定值，失控

①质控血清每年列出计划报质控组采购，一般采用Cut Off值附近的阳性

②质控血清-2CTC冻存备用；

③使用前室温复熔

（3）试剂盒选择卫健委规定乙肝试剂，丙肝试剂，艾滋病试剂，梅毒试剂及血型试剂必须使用经卫健委生物制品检定所检定合格,并贴有防伪标签的产品

（4）试剂盒评价根据该试剂生物制品鉴定所的批批检定报告，了解其1质量水平，按照质量计划选择灵敏度高的或特异性高的试剂；通过询问试剂包被物的组成，如原料来源（基因工程2或合成多肽），片段的组合（按比例混合或化学合成），片段的长短等判断试剂的优劣；参考室间质评报告中对试剂的评价结果，了解不同试3剂的质控成绩临床实验室根据权威部门发布的试剂评价结果，了解4市场上试剂的质量优劣

（5）仪器质控为使仪器保持最佳工作状态应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP）,所要控制的仪器包括移液器（加样枪）,水浴箱（温箱）和酶标仪

①移液器ELISA加样量小（5-lOOul）,其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查吸取刻度指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±10%以内；

②水浴箱经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差；

③酶标仪经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能酶标仪的主要性能指标有测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等优良的酶标仪的读数一般可精确到

0.001,准确性为±1%,重复性达

0.5%

④酶标仪校正程序a）滤光片波长精度检查将不同波长的滤光片从酶标仪上卸下，用UV-2201型紫外-可见分光光度计（波长精度±

0.3nm）于可见光区对每个滤光片进行扫描，其检测值与标定值之差为滤光片波长精度一般酶标仪无585nm滤光片，可选用550nm或630nm滤光片450nm滤光片的检定选用普鲁兰溶液（校正波长为630nm）ob）通道差与孔间差检测通道差检测是取一只酶标板小孔杯（杯底须光滑，透明，无污染以酶标板架作载体，将其（内含200ul甲基橙溶液吸光度调至

0.500A左右）置于8个通道的相应位置，蒸储水调零，于490nm处连续测三次,观察其不同通道的检测器测量结果的一致性，可用极差值来表示孔间差的测量是选择同一厂家，同一批号酶标2板条（8条共96孔）分别加入200ul甲基橙溶液（吸光度调至

0.100A左右）先后置于同一通道，蒸镭水调零，于490nm处检测，其误差大小用±

1.96s衡量c）零点漂移（稳定性观察）取8只小孔杯分别置于8个通道的相应位置，均加入200ul蒸储水并调零，于490nm处每隔30分钟测一次，观察各个通道4小时内吸光度的变化d）精密度评价每个通道3只小杯分别加入200ul高中低3种不同浓度的甲基橙溶解，蒸镭水调零，于490nni作双份平行测定，每日测两次（上下午各一次），连续测定20天分别计算其批内精密度，日内批精密度，日间精密度和总精密度及相应的CV值e）线性测定用电子天平精确称取甲基橙配制5个系列的溶液，于490nm平行测8次，取其均值计算其回归方程，相关系数及标准估计误差s,并用土

1.96s表示样品测量的误差范围双波长测定评价取一分甲基橙溶液，分别加入3种不同浓度的溶血液（测定波长为490nm,校正波长为585nm）,先后于8个通道检测，每个通道测3次，比较各组之间是否具有统计学差异，以考察双波长消除干扰组分的效果6标本的米集和保存

①标本采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰立可读方法的结果，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本会增加非特异性显色造成假阳性临床实验室

②长菌的标本同样的道理也易产生假阳性，因菌体中可能含有内源型HRP也会产生假阳性反应临床实验室

③抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝剂尤其是不使用肝素抗凝剂

④标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合,使间接法的试剂本底加深，一般血清置42冰箱5天内完成测试如需保存一周以上则要-2TC冰冻保存，冻结血清溶解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，溶解时应上下颠倒充分混匀，同时避免起泡可上下颠倒混合，不要在混匀器上强烈振荡反复冻融会使抗体效价跌落，如需保存作多次检测,宜少量分装冰存

⑤ELISA的灵敏度〉Ing/ml水平上，标本间的污染要尽量避免，尤其不应与生化试验用同一管标本

2、分析中质控1临床实验室2ELISA实验的结果受操作影响很大，每个步骤包括加样，温育，洗涤，显色，酶标仪读数均应认真负责才能充分发挥ELISA的高灵敏，强特异的优点因此，应建立实验项目的标准操作程序（SOP）加样应用微量移液器（加样枪）按规定的量加入微孔1板底部，避免加在孔壁上部，不可溅出，不可产生气泡每次加样应更换吸嘴，做到一人一吸头，以免发生交2叉污染；干吸头预先在血清中抽吸三次

③样本稀释，目的是为了减少非特异性反应，所以一定要先加稀释液后加样本，特别注意加样后要在微量振荡器上振荡30秒钟，同时注意防止液体溢出如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀

④如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气泡的试剂后加样

（3）温育

①抗原抗体反应需要在一定温度下（37°C）,经过一定的时间才能达到反应的平衡点，ELISA边缘效应是由温育形成的所以温育一般采用能使反应液温度迅速达到平衡的水浴法水要浸至板条的1/3处

②反应板不宜叠放，注意温育的温度和时间应按规定控制，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定

③洗涤⑴手工洗涤一般采用浸泡方法1）甩去孔内反应液;2）用洗涤液过洗一遍（即注满孔后即甩去）；3）微孔重新注满洗液后浸泡23分钟，间歇摇动；4）甩去孔内液体,拍板，〜用纸吸干重复以上操作至少5次注意各种试剂盒的洗涤液尽量不要混用⑵洗板机洗板一定要预先把板架放平，使洗扳机上的每个放液和吸液孔都能一致地插入孔底，将孔内液体全部吸干，同时要设置一定的浸泡时间如出现机洗后拍板有较多残留液时应再用手工洗2次以上关机前要用蒸镭水冲洗管道，避免堵孔临床实验室

④显色⑴HRP催化底物的一步呈色反应，同样需要一定的时间和温度，一定要按照说明书规定的时间温度（一般为37°C,1015分钟）恒定反应后终止;〜⑵或根据临界值质控血清吸光度值达

0.2左右使的时间而恒定反应时间

3、酶标仪判读结果a）显色反应终止后应立刻比色（30分钟内）b）常见的显色系统有OPD和TMB两种，以后者最为常见，而TMB酸不易终止因此必须尽快比色以免影响结果OPD终止后显棕色，测定波长为490nm；TMB终止后显黄色，测定波长为450nm,两种底物的校正波长均用630nm c）使用双波长的优点o可以消除反应板条上的划痕手印的干扰同时要注意反应板应用纸吸干后才能置酶标仪中比色，否则吸光度易出现负值或损坏滤光片

3.3分析后质控

4、报告方式定性试验国内外为便于统一计算，一律按S/COV方式报告，S为标本A值，COV即Cut Off值或COV1夹心法和间接法以S/C0VZ1为阳性；竞争法与中和法以S/COV1为阳性2COV的计算公式以试剂盒说明书的为准常见的有a COV=

2.1XN当N不足

0.05时按

0.05计，此公式由P/N〉

2.1换算而来，常用于夹心法b COV=O.5XN,从抑止率公式换算而来，常用于竞争，中和法c C0V=N+C C为常数，用于间接法d COV=CXP+N C为常数，用于间接法此公式最客观，但对厂家要求很高，阴阳性对照测定值要基本恒定定量分析严禁用定性试剂盒做定量分析1用已知量的系列标准品，绘制标准曲线，结果以绝对量或单位表示ELISA的标准曲线每次都要和待测标本坐在同一块板上⑵现有的ELISA定量试剂盒标准曲线只有在较窄的浓度范围内成直线，要得到精确的结果实属不易⑴所有实验的原始资料均应存档；所有的记录均应规范登记在册；原始登记表应记录试剂来源、批号；质控血清的来源及测定值并注明是否在控；签上实验者姓名及审核者姓名⑵如试验结果对临床诊断有决定性意义，其样本应保留，至少与病历保存期一致a）定性试验ELISA定性试验的临床意义在于是否检出病原体，与检出量无关，因此QC要保证试验的灵敏度和特异性生化的质控图方法仅能观察灵敏度而无法监控特异性建议使用临界值血清界定法将试剂盒所设的阴阳性对照作为内对照指示反应；另设临界值、高值质控血清，正常人血清作为外对照，与标本同时检测,临界值S/C.021,高值质控血清S/C.0210,正常人血清A值在

0.05-

0.07之间阳性质控血清失控（临界值为灵敏度，高值为“HOOK”效应监控）应重做阴性标本；阴性对照失控应重做阳性标本以表格式记录每块板的外对照实验结果，作为QC资料存档b）定置试验ELISA定量试验常见于肿瘤因子（如AFP,CEA,CA系列系激素类，免疫球蛋白类，这些物质在体内有一定的量（正常范围），超出这个量才呈病理情况，故需定量测定定量试验的质控方法可参考生化方式c）“即刻性”质控。