《外源基因表达》课件

外源基因表达课程大纲外源基因概述外源基因的克隆包括基因表达的基本原理、外源介绍限制性内切酶、重组DNA技基因的特点和来源术和克隆载体的选择外源基因的导入外源基因的表达调控重点讲解细胞转化技术，以及转讨论启动子选择、信号肽的作用化方法和效率影响因素和表达水平的优化外源基因概述外源基因是指来自其他生物体，并被引入到另一种生物体中的基因来源功能外源基因可以来自细菌、病毒、真外源基因可以编码蛋白质、酶、激菌、植物或动物等素、抗体等，在生物体内发挥特定的生物学功能基因表达的基本原理转录翻译DNA序列信息转录成RNA mRNA序列翻译成蛋白质蛋白质折叠蛋白质折叠成具有特定功能的三维结构外源基因的特点异源性可控性特异性来自不同物种的基因可通过基因工程技术进行改造能表达特定蛋白质外源基因的来源天然来源人工合成从生物体中提取的基因，如抗根据已知基因序列，人工合成生素抗性基因、酶基因等基因，例如治疗性基因基因库从基因库中获取已知的基因序列，用于克隆和表达外源基因的克隆克隆是指将外源基因插入到载体中，并利用宿主细胞进行复制和扩增的过程目的基因克隆载体宿主细胞需要克隆的目标基因能够复制并携带目的能够接受外源基因并，通常经过PCR扩增基因的载体，例如质进行表达的细胞，例或酶切获得粒或病毒载体如大肠杆菌或酵母菌限制性内切酶的作用识别特定序列切割DNA片段限制性内切酶识别并切割DNA分子中特定的核苷酸序列，就像它们在识别位点切割DNA链，产生具有粘性末端的片段，便于一把“分子剪刀”后续的基因重组重组技术DNADNA片段切割1限制性内切酶识别特定序列连接2连接酶将目标基因连接到载体转化3将重组DNA导入宿主细胞克隆载体的选择载体的类型载体的特征克隆载体通常是质粒或病毒，它们可以将外源基因导入宿主细胞选择克隆载体时，要考虑其大小、复制起始点、选择标记、多克隆位点等特征外源基因的导入

3.将外源基因导入宿主细胞是基因表达的关键步骤，也是基因工程的核心技术之一细胞转化技术转化效率是指将外源基因导入宿主细胞，使是指成功导入外源基因的细胞占总宿主细胞获得新的遗传特性细胞数的比例细胞转化技术导入外源基因转化效率将外源基因导入宿主细胞，使其转化效率指的是被成功导入外源能够表达并发挥作用，是基因工基因的细胞数量占总细胞数量的程技术的重要环节比例转化方法根据宿主细胞类型和外源基因的特点，选择合适的转化方法常见的转化方法细菌转化病毒介导转化利用感受态细菌，将外源基因导入细利用病毒载体，将外源基因导入目标菌细胞细胞显微注射法将外源基因直接注射到细胞核中转化效率的影响因素细胞类型转化方法12不同细胞的转化效率存在差异不同的转化方法具有不同的效，例如细菌细胞一般比真核细率，例如电穿孔法比化学转化胞更容易转化法效率更高载体类型培养条件34载体的结构、复制效率和基因温度、pH值、培养基成分等表达水平等因素也会影响转化培养条件会影响细胞生长和转效率化效率外源基因的表达调控外源基因的表达调控是指通过对基因表达过程进行控制，以实现特定目的的基因表达模式基因表达调控是一个复杂的过程，涉及多个环节，包括启动子的选择、信号肽的作用、表达水平的优化等启动子的选择信号肽的作用启动子是位于基因上游的调控信号肽是一种短肽序列，引导元件，负责启动基因的转录蛋白质进入特定的细胞器或分泌到细胞外表达水平的优化优化基因的表达水平，以获得更高的蛋白质产量或更稳定的表达效果启动子的选择强启动子弱启动子组织特异性启动子可以驱动高水平的基因表达，适合生产大基因表达水平较低，适用于需要精确控制仅在特定细胞或组织中启动基因表达，提量蛋白质表达量的场合高基因表达的靶向性信号肽的作用引导蛋白分泌提高表达效率保护蛋白质信号肽引导蛋白质通过内质网膜，进信号肽可以加速蛋白质的翻译和分泌信号肽可以保护蛋白质免受细胞内降入内质网腔进行折叠和修饰，最终分，提高外源基因的表达效率解酶的破坏，提高蛋白质的稳定性泌到细胞外表达水平的优化选择合适的启动子，例如强启动子，优化基因序列，例如去除不必要的序可以提高基因表达水平列，可以提高基因表达效率使用合适的培养条件，例如温度、pH值和营养成分，可以提高基因表达水平外源基因的鉴定PCR技术Southern/Northern印迹PCR技术可以特异性扩增目的基因Southern印迹用于检测外源基因是片段，从而验证外源基因是否成功否整合到宿主基因组中，Northern整合到宿主基因组中印迹用于检测外源基因是否成功转录技术PCR原理应用PCR技术利用DNA聚合酶在体外复制特定DNA片段，将目标基因•基因诊断扩增到可检测的水平•基因克隆•亲子鉴定印迹Southern/NorthernSouthern印迹Northern印迹Southern印迹是一种用于检测特定DNA序列的技术它利用Northern印迹是一种用于检测特定RNA序列的技术它利用限制性内切酶切割DNA，然后将片段分离，转移到膜上，并用RNA电泳分离RNA，然后将片段转移到膜上，并用与目标序列与目标序列互补的探针杂交互补的探针杂交印迹Western抗体识别蛋白分离12Western印迹使用特异性抗蛋白质通过凝胶电泳按分子量体识别目标蛋白大小进行分离膜转移3分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上进行检测外源基因的应用基因工程药物基因治疗通过基因工程技术生产的药物，如利用基因工程技术治疗遗传性疾病胰岛素、生长激素等，具有更高的，如囊性纤维化、血友病等效力和安全性基因工程药物安全有效针对性强降低副作用，提高疗效针对特定疾病，精准治疗产量高降低生产成本，惠及更多患者基因治疗遗传疾病癌症治疗基因治疗可以帮助患者克服遗传性疾病，如囊性纤维化、血友病基因治疗可以增强免疫系统，攻击肿瘤细胞，或直接修复受损的和亨廷顿氏病等基因，抑制癌细胞生长克隆动物定义优势应用克隆动物是指通过无性繁殖技术，复制克隆动物可以保留优良性状，提高生产克隆技术已应用于畜牧业、医学和科研出与原体基因型完全相同的个体效率，并为生物医学研究提供模型领域，例如克隆优质种畜、培育疾病模型总结与展望外源基因表达技术是生物技术领域的一项重要工具，它在医疗、农业、环境等领域都有着广泛的应用随着技术的不断发展，外源基因表达技术的应用范围将更加广泛课后思考题

1.请解释外源基因表达的基本流程，并举例说明其在不同领域的应用

2.如何选择合适的克隆载体和导入方法？

3.外源基因表达水平的影响因素有哪些？如何提高表达效率？

4.外源基因表达技术面临哪些挑战？未来发展方向有哪些？参考文献生物化学基因工程郑集.生物化学.北京:高等教育王建华.基因工程.北京:科学出出版社,

2018.版社,

2020.分子生物学翟中和.分子生物学.北京:高等教育出版社,

2019.。