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册Chinese GeneralPractice•1514•.论著.洛沙坦对糖尿病肾病大鼠足细胞及表达的影响nephrin podocin陈立平，周巧玲，刘抗寒，吴晓英，尹红玲【摘要】目的探讨洛沙坦对糖尿病肾病大鼠足细胞超微结构及其相关分子、表达的影响方nephrin podocin法将只大鼠随机分为组正常对照组组、糖尿病肾病组组和洛沙坦干预组组组大30Wistar3N DL L鼠给予洛沙坦50mg-kg-•d-1灌胃,N组和D组大鼠给予等量饮用水灌胃于第4周和第8周检测3组大鼠24h尿蛋白Pro量、血清肌酊Scr、三酰甘油和胆固醇水平；用免疫组化、方法检测肾皮质TG CH0RT-PCR蛋白及二者表达水平；用透射电镜检测足细胞超微结构变化结果造模后第周和第周，nephr i n podocinmRNA48组大鼠、、、水平与组比较，差别有统计学意义造模后第周，组大鼠D24h ProScr TGCHO NP
0.01;4L24h与组比较，差别有统计学意义造模后第周，组大鼠和水平与组比较，差别有统计学意义第Pro D P
0.05,8L24h ProScr D P
0.014周和第周，组大鼠及蛋白表达水平与组比较，差别有统计学意义8D nephr in podocinN而且组大鼠及蛋白表达水平与组比较，差别亦有统计学意义第周和第周，组大鼠足细胞数、P
0.05;L nephrin podocinD P
0.0548Do足突平均宽度、足突融合率、基底膜厚度与组比较，差别有统计学意义组大鼠足细胞数、、足突融合率、基底FPW NP
0.01;L FPW膜厚度与组比较，差别亦有统计学意义第和第周，组大鼠和表达水平与组比较，差别DP
0.0148D nephrin mRNApodocin mRNAN有统计学意义组大鼠和表达水平与组大鼠比较，差别亦有统计学意义结论洛沙坦能通P
0.01;L nephrin mRNApodocin mRNADP
0.05o过上调和表达水平来改善足细胞超微结构，减少糖尿病肾病大鼠蛋白尿nephrinpodocin【关键词】糖尿病肾病；洛沙坦；nephrin;podocin【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】R
587.24A1007-95722008097544-03Eff ectsof Losartanto PodocyteExpression ofNephrin andPodocin inDiabetic NephropathyRats CHENLi-ping ZHOUQiao-ling,LIU Kang-han,et al.Departmentof Nephrology,Xiangya Hospital,Central SouthUniversity,Changha410008,China【Abstract]Objective Toinvestigate theeffects oflosananon theultrastructural changesof podocytesand the expression ofrelative moleculesnephrin and podocin indiabetic nephropathyDN rats.Methods Totally30Wistar ratswere dividedinto threesgroups:normal controlgroup groupN,DN modelgroup group D,treatment groupwith Iosaitangroup L.The ratsin group L wereby gavagegiven50mg-kg-I d-1,and forthe ratsin othertwo groinsthe sameamountof freshwater wasused.At the4th and8th weeks,quantification of24-hour proteinuria24h Pro,and the levels ofserum creatinineScr,triglycerideTGandcholesterolCHO weremeasured.The expressions ofnephrin and podocin,and theirmRNA in therenal cortexwere detectedby immunohistochemicaltechniqueand RT-PCR,and theultrastructures ofpodocyte wensmeasured byelectron microscope.Results At the4th and8th weeksafter themodels wereset up,corrpared to group N,the levelsof24h Pro,Scr,TG andCHO in group Dshowed significant differencesP
0.
01.At the4th week,thelevelof24h ingroup L showed asignificant differenceP
0.05,and at8thweek,the levelsof24h Proand ScringroupL showed significant differencesP
0.01,as comparedwith thosein thegroup D.At the4th and8th week,compared togroup N,the levelsof expressions of nephrin and podocingroup Dshowedsignificant differencesP
0.05,and comparedtogroup Dfhe levelsof expressionsof nephrin and podocingroupLshowedsignificant differencestooP0,
05.At the4th and8th week,there were significantdifferences in the number ofpodocytes waslower,the averagefoot processwidthFPW,foot processfusion rateand basilai*membrane thicknessbetween thegroupDand groupNP
0.01;and there weresignificantdifferencesin thenumberofpodocytes waslower,the averagefoot processwidthFPW,foot processfusion rateand basilarmembrane thicknessbetween thegroupLand groupDP
0.
01.Atthe4th and8th week,thereweresignificantdifferencesinthe expressionsof nephrinandpodocin mRNAbetween thegroupDand groupNP
0.01;and therewere significantdifferencesintheexpressionsof nephrinandpodocin mRNAbetween thegroupLand groupDP
0.
05.Conclusion Losartancan improvethepodoeyte ultrastructureandreduce theproteinuria inDNratsthrougli down-regulation oftheexpressionof nephrinandpodocin.【Key word]Diabetic nephropathies;Losartan;Nephrin;Podocin血管紧张素受体阻滞剂antiotensin-receptor blocker,作者单位；410008湖南省长沙市，中南大学湘雅医院肾内科ARB可以缓解糖尿病肾病diabetic nephropathy,DN患者的肾病进展，减少蛋白尿，其作用机制除改善血流动力学外，基金项目湖南省自然科学基金项目05JJ30177还与其足细胞的保护作用有关本研究通过建立糖尿病肾病大鼠模型，观察洛沙坦对肾小球足细胞超微结构及其分子nephrin podocin表达的影响，探讨洛沙坦对糖尿病肾病的肾脏保护机制材料与方法
11.1实验动物选择雄性清洁级健康Wistar大鼠30只（由中南大学湘雅医学院动物学部提供），体重（220±20）g,生长良好，•1545•普食喂养；饲养环境为每笼5只，温度（22±2）°C,相对湿度平上足突两侧膜间的距离，取其平均值
（3）足突融合率首先（55±2）%将大鼠随机分为正常对照组（N组）、糖尿病肾病组量出基底膜总长度，设为X,然后量出基底膜上足突融合的总长度，0（D组）和洛沙坦干预组（L组），每组10只设为Y,Y/X即得融合率
（4）基底膜平均厚度以1cm为单位，把基底膜分成若干个点，然后测定每点基底膜的厚度，再把所有
1.2动物模型制备利用链腺佐菌素（STZ,购自Sigma公司）60各点基底膜的厚度相加，设为X,计算其测定的点数设为Y,X/Y即mg/kg腹腔注射制备糖尿病大鼠模型4872h后从大鼠尾静脉〜得各组基底膜的平均厚度采血测血糖，血糖N
16.7mmol/L为糖尿病大鼠3周后收集糖尿病大鼠24h尿标本测定其尿蛋白量，24h尿蛋白N30mg认为糖
1.
3.4RT-PCR肾皮质总RNA提取按Trizol（美国MRC公尿病肾病大鼠模型制备成功司）说明书进行取211g RNA进行逆转录合成cDNA取2ul cDNA作模板,用nephrin、podocin和GAPDH引物行PCR扩增引物
1.3方法D组和L组大鼠进行糖尿病肾病模型制备，L组糖尿病由瑞晶生物技术有限公司合成
（1）nephrin:上游5,肾病大鼠模型成功后第2天给予洛沙坦50mg-kg-1•d-灌胃，NTACCACCAGCATTTCCACG3,,下游5,GGGCTCGGCTG-TATGTATT3,,产组与D组大鼠给予等量饮用水灌胃实验期间每3d测量1次尾静物299bp;
（2）podocin:上游5TCAAGC-CCTCTGGATTTAG3,,下脉血糖，血糖
226.0mmol/L的大鼠皮下注射适量长效胰岛素（
0.4游5CTTCATGGTGGTTTGCAT3,,产物392b o反应条件为94℃预
3.2U）,使随机血糖维持在
16.7mmol/L以上分别于第4周〜P变性2min,94℃变性30s,退火（nephrin55℃,podocin52℃,和第8周每组各处死5只大鼠处死前收集24h尿液，心脏采血GAPDH53℃）30s,72℃延伸40s,72℃终末延伸5min,共3010ml,于-70°保存待用处死后将大鼠左肾称重，于肾皮质区取1mm3的肾组织数块，以
2.5%戊二醛固定，以备电镜检测其个循环取上述PCR产物行
1.0%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描系统进行阳性条带吸光度积分扫描，以GAPDH条带作为内参照，分余左肾组织以10%甲醛固定，以备光镜检测取右肾，分离皮髓别计算nephrin和podocin基因吸光度/GAPDH吸光度质后速冻于液氮中，冻透后转入-70℃冰箱，用于RT-PCR检测
1.4统计学方法采用SPSS
11.0软件包进行统计分析计量资
1.
4.1观察指标采用双缩月尿法测定24h尿蛋白（Pro）定量；料用（x±s）表示，多组间均数比较采用方差分析，组间两两比采用全自动生化分析仪检测血清胆固醇（C110）.三酰甘油（TG）较采用SNK-q检验以P〈
0.05为差别有统计学意义和肌酉千（Scr）o
1.
3.2免疫组化检测采用SABC法（试剂盒购于福州迈新生物结果2技术开发有限公司），以PBS代替一抗作阴性对照染色石蜡包
2.1观察指标造模后第4周和第8周，D组大鼠24h Pro、Sen埋的切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢甲醇灭活内源性过氧化物酶，TG、CHO水平与N组比较，差别有统计学意义（P
0.01）；造模微波修复抗原后，正常山羊血清封闭非特异性抗原，分别滴加羊后第4周，L组大鼠24h Pro与D组比较，差别有统计学意义抗大鼠nephrin抗体（1:100,美国Santa Cruz公司）、兔抗大鼠（P
0.05）,造模后第8周，L组大鼠24h Pro和Scrpodocin抗体（1:100,美国Santa Cruz公司），4℃孵育过夜水平与D组比较，差别有统计学意义（PV
0.01,见表1）滴加二抗、三抗，最后显微镜下控制DAB显色，苏木素复染
3.2肾组织免疫组化半定量分析造模后第4周和第8周，D组大nephrin podocin蛋白表达采用半定量分析，即随机选取10个鼠nephrin及podocin蛋白表达水平（PI值）与N组比较，差别连续不重复的视野（X400）,根据肾小球足细胞着色情况计算阳性有统计学意义（P
0.05）;L组大鼠nephrin及podocin蛋白表指数（positive index,PI）,PI邛日性信号面积X阳性强度，达水平与D组比较，差别亦有统计学意义（P
0.05,见表2）求和，取平均数形态学分析用育法减少误差阳性信号面积计
4.3透射电镜检测结果在透射电镜下可见N组大鼠足细胞结构完算方法阴性无着色0分，25%着色1分，25%50%着色2分，〜整，足突排列整齐清晰；D组大鼠足突增宽、融合，甚至消失，51%75%着色3分，75%着色4分；阳性强度计算方法阴性无〜足细胞减少，基底膜增厚；L组大鼠上述病变不同程度得到改善着色0分，弱阳性1分,中等阳性2分，强阳性3分［2］造模后第4周和第8周，D组大鼠足细胞数、FPM足突融合率、
1.
3.3足细胞计数、足突平均宽度（FPW）、足突触合率及基基底膜厚度与N组比较，差别有统计学意义（P
0.01）;L组大鼠底膜厚度［3-4
（1）足细胞计数每只大鼠观察3个肾小足细胞数、FPW.足突融合率、基底膜厚度与D组比较，差别亦有球，随机取10个视野，计数足细胞数
（2）FPW:测定裂孔膜水统计学意义（P
0.01,见表3）表13组大鼠造模成功后第4周和第8周各观察指标比较（x±s）Table1The resultsof24h proteinuria,Scr,TG andCHO in rats of three groups in4and8weeks第4周n=5第8周n=5组别Promg/24h SerPmol/L TGmmol/L CHOmmol/L Pomg/24h Serymol/L TGmmol/L CHOmmol/LN组
6.3±
1.
943.1±
6.
60.39±
0.
060.82±
0.
046.7±
1.
641.4±
4.
40.41±
0.
030.80±
0.05I）组
78.9±
8.6*
66.2±
9.0*
0.55±
0.04*
1.17±
0.07*
111.9+
11.7*
88.2±
7.1*
1.10±
0.05*
1.54±
0.04*L组
63.2±
4.8-
60.3+
2.
60.57+
0.
051.15±
0.
0751.9±
4.4A
53.6±
6.
140.53±
0.
041.17±
0.04F值
218.
8316.
4518.
9650.
83263.
0582.
64407.
70360.26P值
0.
010.
010.
010.
010.
010.
10.
10.01注与N组比较，P
0.01;与D组比较，AP
0.05,AP
0.01
⑥[PChinese GeneralPractice•1546•表33组大鼠造模成功后第4周和第8周透射电镜观察结果（x±s）Table3The resultsof e1ectron microscopein ratsof threegroups in4and8weeks第4周（n=5）第8周（n=5）组别足细胞数（个）FPW（mm）足突融合率
（5）基底膜厚度（mm足细胞数（个）FPW（mm）足突融合率（为）基底膜厚度（mm）N组
5.32±
0.37264±140240±
265.41±
0.70261±180241±28D组
3.50±
0.09*488±17*
52.5±
4.3*312±25*
3.31±
0.09*524±18*
58.7±
3.7*936±99*L组
5.51±
0.09368±
16431.6±
5.04252±27A
5.39±
0.06289±
10413.8±
3.6242±22F值
120.
65254.
36240.
9511.
0043.
54418.
38530.
22217.87P值
0.
010.
010.
010.
010.
010.
010.
010.01与N组比较，P
0.注与D组比较,
0.0101；表23组大鼠造模成功后第4周和第8周nephrin及podocin蛋相关蛋白、FAT和Z0-1等多种蛋白质分子相连接，从而阻止大分白表达的PI值（士s）子物质通过，使得肾小球滤过膜具有高度选择性5-6o nephrin和podocin均为跨膜蛋白并特异性表达在裂孔膜上，podocin通T able2The PIof nephrinandpodocinin ratsof threegroups in4and8weeks过其C末端与nephrin及CD相关蛋白的胞内段相互作用，可促第4周（n=5）第8周（n=5）进nephrin诱导的信号传导研究表明，nephrin-podocin信号nephrin Podocinnephrin Podocin传导异常可引起足细胞功能异常并导致蛋白尿的发生］本实验组N
7.85±
0.
505.83±
0.
337.54±
0.
505.93±
0.60组结果显示，糖尿病肾病大鼠模型制备成功后，不仅尿蛋白逐渐增D
2.08±
0.32*
1.60±
0.10*
1.43±
0.11*
1.22±
0.06*组多，同时足细胞数减少，足突增宽、融合，甚至消失，而且足突L
2.58±
0.18A
2.14±
0.
272.14±
0.
274.69±
0.31值F
398.
36414.
50499.
97194.49间裂孔膜分子nephrin、podo-cin的表达水平及二者mRNA表达值
0.01P
0.
010.
050.01水平均下调，其可能原因是糖尿病肾病发生时，高糖导致的注与N组比较，*P〈
0.05,*P
0.01;与D组比较，APnephrin及podocin表达下调，一方面引起裂孔膜分子的组成发
0.05,4P
0.01生改变，足突间的分子连接减少或中断，导致足突形态改变和产生蛋白尿；也有可能是高糖使足突融合甚至消失后，nephrin及
5.4RT-PCR检测结果造模后第4周和第8周，D组大鼠podocin在足细胞表面的分布减少，导致蛋白尿排泄增多；另一nephrin mRNA和podocin mRNA表达水平与N组比较，差别有统方面，nephrin及podocin在肾组织表达均下调，使得细胞外到计学意义（P
0.01）;L组大鼠nephrin mRNA和podocin mRNA细胞内CD2相关蛋白及细胞骨架蛋白的信号传递发生障碍，足细胞结构进一步破坏，同时足细胞与基底膜相互作用减弱钾钉于表达水平与D组大鼠比较，差别亦有统计学意义（P
0.05,见表肾小球基底膜的足细胞松动，甚至从基底膜剥离、脱落，滤过膜4）的完整性遭到破坏，导致蛋白尿产生；而且足细胞脱落后，基底膜裸露，毛细血管祥由于静水压的作用向包曼氏囊腔侧凸出、粘表43组大鼠造模成功后第4和第8周nephrin及podocin mRNA连，甚至肾小球局灶节段硬化形成［众所周知，洛沙坦作为ARB,表达水平（土s）除了能够改善糖尿病肾病血流动力学外，还可通过多种途径保护Table4The levelsofnephrin mRNA andpodocin mRNAinratsofthreegroupsin4and肾功能8-9）本研究结果显示，洛沙坦治疗的糖尿病肾病大鼠8weeks较未治疗的糖尿病肾病大鼠24h尿蛋白排泄减少，同时足突宽第4周（n=5第8周（n=5度变小、足突融合率降低，基底膜厚度降低，足细胞数基本恢复组别nephrin mRNApodocin mRNAnephrinmRNApodocin mRNA正常；结合洛沙坦干预治疗后大鼠Scr水平下降，提示洛沙坦可N组
0.939±
0.
0170.913±
0.
0100.937±
0.
0220.910±
0.029以通过改善足细胞的结构而减少尿蛋白排泄，减轻高血糖所致的D组
0.680±
0.Oil*
0.706±
0.015*
0.568±
0.016*
0.511±
0.032*肾脏损害进一步观察还发现洛沙坦能使肾组织中nephrin、
0.715±
0.
02240.783±
0.
0150.811±
0.013L组
0.706±
0.016podocin蛋白表达及二者mRNA水平表达上调，并且随着足突和基F值
331.
33298.
54386.
71366.93底膜改善更明显，24h尿蛋白排泄量也明显减少；提示洛沙坦可P值
0.
010.
010.（）
10.01能通过诱导nephrin及podocin表达增加，使肾小球滤过膜的完注与N组比较，P
3.01;与D组比较，W05,
0.01整性得到一定程度的恢复而减轻蛋白尿；至于洛沙坦如何使足细胞分子表达增加、nephrin或podocin分子结构上是否存在血管3讨论紧张素H受体有待进一步研究蛋白尿的产生与肾小球滤过屏障结构和功能损伤密切相关正如其他文献报道10］,本实验结果还显示糖尿病肾病大鼠肾小球滤过膜由脏层上皮细胞、基底膜和内皮细胞组成；脏层上Scr、TG及CHO水平均增高，说明糖尿病肾病发生时，在糖代谢皮细胞又称足细胞，位于基底膜的外侧，构成防止蛋白丢失的最异常的基础上，出现脂质代谢紊乱和肾功能损害后一道屏障［相邻足突之间的裂孔，由nephrin.podocin.CD2（下转页）1549・1549•in olderIowa women|JJ.Diabetes Care,2001,249:1528-
1535.高收入地区中却是最低，仅为也有力地支持这一推测
1.60%
[0],4Hunter D.Biochemical indicatorsof dielaryintake[A].In:Willett等[认为对有保护作用，其机制可能为阻止Delarue n-3PLFA IR1W,ed.Nutritional Epidemioy[M].New York:Oxford UniversityPress磷脂酰肌醇3激酶P13激酶活性下降和肌肉中葡萄糖转运体4Inc,1990:143-
203.的衰竭；阻止脂肪组织中表达的下降相关分析GLUT42GLUT45Manzato E,Roselli dellaRovere G,Avogaro A,et al.The fatty acid compositiono还发现对于调节血糖，改善胰岛素敏感性也有一定的作n-6PUFA fpl asma ph ospholipids andthe insulinsensitivily inelderly diabeticpatients.用，但机制还不明确The Pro.V.A.study[J].Aging ClinExp Res,2002,14:474-
478.此外与的平衡也一直是医学营养学n-6PUFA n-3PUFA6Riboli E,Ronnbolm H,Saracci R.Biological markerof diet[JJ.Cancer Surv.界关注的问题西方国家为左右，且有逐年上升的趋势1987,6:685-
718.n-6/n-310日本在年鉴于退行性疾病模式已与西方国家相似，建议膳食7Stein DT,Stevenson BE,Chester MW,et al.The insulinotropicpotency offatty1995acids isinfluenced profoundlyby heirchain lengthand degreeof saturation[J].J为我国营养学会推荐为本研究患者n-6/n-34
[12],6[]o T2DM n-6/n-3Clin Invest,1997,100:398-
403.为比值较为理想
4.6,8Lichtenstein AH,Schwab US.Relationshipof dietaiyfat toglucosemetabolism[J].等[给予印度健康人高饮食和Minihane n-6/n-3n-6nAtherosclerosis,2000,1502:227-
243.分别为和周后发现和比干预前显著-328g/d2g/d6FINS HOMA-TR9Hunnicutt JW,Hardy RW,Williford J,et al.Saturated fattyacid-induced insulin升高，说明高有降低胰岛素敏感性的趋n-6/n-3resistance inrat adipocytes[J].Diabetes,1994,43:540-
545.势，本研究患者与呈正相关，有升高T2DM n-6/n-3FINS全国糖尿病防治协作组.年中国糖尿病患病率及其危险因素101994的趋势，结果与等的结果较一致HOMA-IR Minihane中华内科杂志[J].，1997,366:384-
389.总之，本研究结果显示浙江地区患者血浆磷脂中T2DM11Delarue J,Lefoll C,Corporeau C,et al.N-3long chainpolyunsaturated fattyacids;a含量较高，比值较为理想，相关性分析0-3PUFA n-6/n-3nutritional txlto preventinsulin resistanceassociated totype2diabetes and提示升高患者血浆磷脂、降低特别是T2DM n-3PUFA SFAobesity[J].Reprod NutrDev,2004,443:289-
299.水平有可能在一定程度上可改善其胰岛素敏感性鉴于中国C16:0中国居民膳食指南专家委员会，中国居民膳食指南北京中12M.各地区经济发展不平衡和饮食习惯存在较大差异，不同地区不同国检查出版社，1999:182-
202.膳食结构对的影响及具体机制还有待进一步研究T2DM张爱珍，吴妍.消瘦型糖尿病的饮食营养治疗病案分析中国13[J].参考文献全科医学，2007,1019:
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978.PUFA ratioon plasmalipids andmarkers ofinsulin responsesin IndianAsians2Li D.Omega-3fattyacidand non-communicable diseases[J].Chin Medicalliving inthe UK[J].Eur JNutr,2004,10:1-
7.Joumal,2003,l163:
453458.收稿日期2008-05-18本文编辑焦骞3Meyer KA,Kushi LH,Jacobs DR,et al.Dietary fatand incidenceof type2diabetes上接页251-
259.1546参考文献6Schmid H,Henger A,Cohen ClemensD,et al.Gene expressionprofiles ofpxiocyte1Bonnet F,Cooper ME,Kawachi H,et al.Irbesartan normalizesthe deficiencyin-associated moleculesas diagnosticmarkers inacquired proteinuricdieases[J].Jglomerular nephrinexpression ina modelof diabetesand hypertension[J].Am SocNephrol,2003,1411:2958-
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877.7Aaltonen P,Luimula P,Astrom E,et al.Changes intheexpressionofnephringene杨念生，武庆庆，姜宗培，等.维甲酸抑制大鼠单侧输尿管梗阻模2and proteinin experimentaldiabetic nephropathy[J].Lab Invest,型肾间质纤维化中华肾脏病杂志,2001,819:1185-
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223.5Barisoni L,Kopp BJ.Update inpodocyte biology:putting onesbest footforward收稿日期:本文2008-05-23[J].Current Opinionin Nephrologyand Hypertension,2003,123:编辑刘莉。
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