《PCR分子标记技术》课件

《分子标记技术》PCR本课件将深入探讨分子标记技术，从基本原理到应用领域，并展示PCR其在生物学、农业和医学等领域的巨大潜力分子标记技术概述简介分类分子标记技术是利用或的差异来识别个体或群体之分子标记技术主要包括限制性片段长度多态性、随DNA RNARFLP间遗传差异的技术它是现代分子生物学的重要工具，在遗机扩增多态性、扩增片段长度多态性、DNARAPD AFLP传分析、育种、疾病诊断、法医学等领域有着广泛的应用简单序列重复、单核苷酸多态性等SSR SNP分子结构DNA组成配对由脱氧核糖核酸组成，由两条反向平行的脱氧核苷酸链双螺旋结构中，两条链通过碱基配对连接在一起与DNA DNAA构成双螺旋结构每个脱氧核苷酸由一个脱氧核糖、一个磷配对，与配对碱基配对的原则被称为碱基互补配对原T CG酸基团和一个碱基组成碱基包括腺嘌呤、胸腺嘧啶则A、胞嘧啶和鸟嘌呤T CG复制过程DNA解旋1复制的第一步是双螺旋结构解开，形成两条单链模板DNA引物结合2引物是短的单链片段，与模板的特定序列结合DNA DNA链延伸3聚合酶沿着模板链移动，以引物为起点，将新的核DNA苷酸添加到模板链上，合成新的链DNA聚合酶链式反应原理PCR定义核心是一种体外扩增片段的技术，利用聚合酶在的核心在于使用引物，引导聚合酶在目标片PCR DNA DNA PCR DNA DNA体外模拟复制过程，将目标片段进行大量扩增段的特定区域进行复制，使目标片段的数量呈指数级增长DNA DNA的三个基本步骤PCR变性退火12将反应体系加热至将反应体系温度降低至94-45-℃，使双链解开，℃，使引物与模板98DNA65DNA形成单链模板的特定序列结合延伸3将反应体系温度升至℃，聚合酶以引物为起点，沿着模板链延伸新的链72DNA DNA反应体系组成PCR模板引物DNA待扩增的片段，可以是基因组、或质粒短的单链片段，与模板的特定序列结合，引导聚合酶进行复制DNA DNAcDNA DNA DNA DNA DNA聚合酶dNTPs DNA四种脱氧核苷酸三磷酸，作为合成的原料一种酶，可以催化新的链的合成DNA DNA缓冲液MgCl2维持反应体系的值和离子强度镁离子是聚合酶的辅因子，可以促进聚合酶的活性PCR pHDNA DNA引物设计原则PCR特异性长度Tm值引物必须与目标序列引物长度一般在个引物的值是指引物与DNA15-30Tm特异性结合，避免与其他碱基之间，长度过短特异模板完全结合时所需DNA序列发生非特异性结合性差，长度过长容易形成的温度，值应在Tm50-二级结构，影响扩增效℃之间，保证引物在65率退火温度下能够有效结合GC含量引物的含量一般在GC40-之间，含量过低60%GC或过高都会影响引物的特异性和稳定性引物设计实例PCR目标序列引物设计5-ATGCGTAGCTAGCATGCATGC-3正向引物5-ATGCGTAGCTAGCAT-3反向引物5-GCATGCATGCTAGCT-3仪器及其工作原理PCR仪器原理仪器也被称为热循环仪，是一种用于控制温度变化的仪仪器通过加热和冷却循环，将反应体系温度控制在不同PCR PCR器，可以精确地控制反应的各个步骤的温度和时间的温度区间，从而完成反应的变性、退火和延伸步骤PCR PCR反应过程温度控制PCR退火℃，时间一般为秒，使引物45-6530-60与模板的特定序列结合DNA变性延伸℃，时间一般为秒，使℃，时间一般为秒，聚合94-9830-60DNA7230-60DNA双链解开，形成单链模板酶以引物为起点，沿着模板链延伸新的链DNA213扩增产物检测方法PCR琼脂糖凝胶电泳分析其他方法将扩增产物在琼脂糖凝胶中进行电泳分离，根据片段的大除小了进琼行脂鉴糖定凝胶电泳分析，还有其他方法可以检测扩增PCRDNA PCR产物，例如荧光定量、基因芯片分析、测序分析等PCR琼脂糖凝胶电泳分析制胶将琼脂糖溶液倒入电泳槽中，冷却凝固成凝胶上样将扩增产物加入到凝胶的样品孔中PCR电泳在电场的作用下，片段向正极移动，根据大小进行分离DNA染色用溴化乙锭或其他染料对凝胶染色，使片段显色DNADNA玷污扩增的常见问题DNA模板污染DNA如果模板中存在其他片段，可能会导致非特异性扩增DNADNA引物污染引物污染会导致非特异性扩增，甚至出现假阳性结果试剂污染试剂的污染会导致非特异性扩增，影响实验结果的准确性PCR环境污染实验环境中存在其他片段，可能会污染反应体系，导致非特异性扩增DNA降低扩增失败的措施PCR优化反应条件1包括引物浓度、退火温度、浓度、循环次数等，以提高扩增效率和特异性MgCl2使用高质量试剂2选择高纯度的模板、引物、和聚合酶，降低污染风险DNA dNTPsDNA严格操作规范3严格遵循实验操作规范，避免污染，确保实验结果的准确性产物克隆连接策略PCR扩增PCR1使用特异性引物扩增目标基因片段，并添加酶切位点酶切2使用限制性内切酶将产物和载体进行酶切，产生相同的粘性末端PCR连接3使用连接酶将酶切后的产物和载体连接起来，形成重组载体DNA PCR转化4将重组载体导入感受态细胞，并进行筛选和鉴定测序验证扩增结果PCR测序原理结果分析测序是确定片段碱基序列的过程，可以用于验证扩将测序结果与目标基因序列进行比对，确定是否发生突变或其他变异DNA PCR增结果，确认目标基因片段是否正确扩增分子标记技术特点RAPD简单易行多态性丰富不需要预先知道目标基因序由于引物是随机的，因此可列，只需要设计随机引物即以检测到更多的多态性位可进行扩增点成本低廉与其他分子标记技术相比，技术的成本相对较低RAPD技术应用领域RAPD遗传多样性分析亲缘关系分析遗传图谱构建品种鉴定可以用于评估种群、品种可以用于确定不同种群或可以用于构建遗传图谱，定位基因可以用于品种鉴定，区分或物种的遗传多样性品种之间的亲缘关系不同品种或杂交品种分子标记技术原理RFLP限制性内切酶电泳分离多态性利用限制性内切酶对进行切割，将酶切后的片段进行电泳分离，不同个体或群体之间，由于序列DNADNADNA产生不同长度的片段根据片段大小进行鉴定的差异，导致酶切位点的差异，从而DNA产生不同的片段大小，形成多态DNA性技术应用优势RFLP12准确性稳定性技术基于酶切位点的差异，技术不受环境因素的影响，RFLP RFLP具有很高的准确性具有较好的稳定性3可重复性技术具有较好的可重复性，RFLP不同实验室之间可以获得相同的结果分子标记技术概述SSR定义特点标记是指在基因组中重复出现的短串联重复序列，由于标记具有高度多态性、共显性、数量丰富等特点，是目SSR SSR重复次数的差异，标记可以呈现多态性前广泛应用的分子标记技术之一SSR技术应用优势SSR多态性高1标记具有高度的多态性，可以有效地识别不同个体或群体之间的遗传差异SSR共显性遗传2标记可以检测到杂合子和纯合子，能够更准确地反映遗传信息SSR数量丰富3标记在基因组中分布广泛，数量丰富，可以为遗传分析提供更多的信息SSR易于自动化4标记的检测可以通过自动化仪器进行，提高了效率和准确性SSR分子标记技术步骤SCAR目标基因鉴定1首先需要确定目标基因序列，并设计特异性引物PCR扩增2使用特异性引物扩增目标基因片段，并进行琼脂糖凝胶电泳分析克隆测序3将扩增产物克隆到载体中，并进行测序，确认目标基因片段的序列PCR引物设计4根据目标基因序列设计特异性引物，用于标记的扩增SCARSCAR标记检测5使用特异性引物进行扩增，并进行琼脂糖凝胶电PCR泳分析，检测目标基因的存在技术在品种鉴定中的应用SCAR原理应用标记可以特异性地检测目标基因，用于区分不同品种或杂交品种标记可以应用于品种鉴定、真伪识别、亲子鉴定等领域SCAR SCAR分子标记技术原理AFLP限制性酶切接头连接选择性扩增电泳分离使用限制性内切酶对将接头连接到酶切片段的使用选择性引物进行将扩增产物进行电泳分DNAPCR进行酶切，产生不同的两端，为后续的扩增扩增，只扩增含有特定接离，根据片段大小进行鉴PCR片段提供模板头和限制性酶切位点的定DNA片段DNA技术应用特点AFLP高通量多态性丰富12技术可以同时检测大量的多态性位点，适用于高通量的遗传分析技术可以检测到各种类型的多态性，包括、和插入缺失等AFLP AFLPSNP SSR/可重复性高应用广泛34技术具有较高的可重复性，不同实验室之间可以获得相同的结果技术可以应用于遗传多样性分析、亲缘关系分AFLP AFLP析、遗传图谱构建、品种鉴定等领域分子标记技术特点SNP丰富性稳定性标记在基因组中分布广标记的变异率较低，具SNP SNP泛，数量丰富，可以提供更有较好的稳定性全面的遗传信息自动化标记的检测可以通过自动化仪器进行，提高了效率和准确性SNP技术在基因组研究中的应用SNP123疾病关联分析药物基因组学进化研究标记可以用于识别与疾病相关的基标记可以用于研究药物疗效和副作标记可以用于研究物种的进化历史和亲缘关系SNP SNP SNP因，帮助研究人员了解疾病的遗传基用的遗传差异，帮助医生选择最佳的药础物治疗方案微卫星标记技术分析SSR原理应用标记是指在基因组中重复出现的短串联重复序列，由于标记可以应用于遗传多样性分析、亲缘关系分析、遗传SSR SSR重复次数的差异，标记可以呈现多态性图谱构建、品种鉴定、基因定位等领域SSR单核苷酸多态性分析SNP原理应用标记是指基因组中单个碱基的差异，这种差异可以导致标记可以应用于疾病关联分析、药物基因组学、进化研SNPSNP个体之间在遗传性状上的差异究、亲缘关系分析、品种鉴定等领域扩增片段长度多态性分析AFLP原理应用标记是一种高通量的分子标记技术，可以检测到大量标记可以应用于遗传多样性分析、亲缘关系分析、遗AFLP AFLP的多态性位点，适用于高通量的遗传分析传图谱构建、品种鉴定、基因定位等领域随机扩增多态性分析DNARAPD原理应用标记是一种简单易行的分子标记技术，不需要预先知标记可以应用于遗传多样性分析、亲缘关系分析、遗RAPD RAPD道目标基因序列，只需要设计随机引物即可进行扩增传图谱构建、品种鉴定、基因定位等领域简单序列标记分析SCAR原理应用标记是一种特异性很高的分子标记技术，可以用于检测目标基因的标存记在可以应用于品种鉴定、真伪识别、亲子鉴定、基因定位等领域SCAR SCAR限制性片段长度多态性分析RFLP原理应用标记是一种基于限制性内切酶切割位点的差异进行的分子标记技术标记可以应用于遗传多样性分析、亲缘关系分析、遗RFLP RFLP传图谱构建、品种鉴定、基因定位等领域分子标记技术的应用前景PCR高通量技术1随着高通量测序技术的发展，分子标记技术可以更高效地检PCR测大量的多态性位点，为遗传研究提供更全面的信息个性化医疗2分子标记技术可以应用于个性化医疗，帮助医生根据患者的遗传信息制定最佳的治疗方案PCR食品安全3分子标记技术可以用于检测食品中的有害物质，保证食品安全PCR环境监测4分子标记技术可以用于检测环境中的污染物，监测环境质量PCR分子标记在育种中的应用PCR1品种鉴定使用特异性引物扩增目标基因片段，可以快速准确地鉴定品种，区分不同品种或杂交品种2亲缘关系分析通过分析不同品种或种群的基因型，可以确定它们之间的亲缘关系3基因定位利用分子标记与性状之间的连锁关系，可以定位控制特定性状的基因4标记辅助选择利用分子标记与目标性状之间的连锁关系，可以提前筛选出具有优良性状的个体，提高育种效率分子标记在细菌鉴定中的应用PCR细菌分类细菌鉴定使用特异性引物扩增细菌的基因片段，可以根据序列差异使进用行特细异菌性分引类物扩增细菌的特定基因片段，可以鉴定细菌种16S rRNA类，并检测细菌的抗生素耐药性分子标记在药用植物溯源中的应用PCR产地溯源品质鉴定通过分析药用植物的基因型，可以确定其产地，防止假冒伪劣产品可以检测药用植物中有效成分的含量，保证药材的质量分子标记技术在基因工程中的应用PCR基因克隆基因敲除12使用特异性引物扩增目标基使用特异性引物扩增目标基因片段，用于构建基因表达因片段，用于构建基因敲除载体载体，对目标基因进行敲除基因表达分析3使用特异性引物扩增目标基因的转录本，用于分析基因的表达水平分子标记在畜牧业中的应用PCR1品种鉴定使用特异性引物扩增目标基因片段，可以快速准确地鉴定品种，区分不同品种或杂交品种2亲缘关系分析通过分析不同品种或种群的基因型，可以确定它们之间的亲缘关系3疾病诊断可以检测动物体内的病原体，帮助诊断疾病4遗传改良利用分子标记与目标性状之间的连锁关系，可以进行标记辅助选择，加速遗传改良过程分子标记技术在遗传分析中的应用PCR基因型分析连锁分析群体遗传学分子标记技术可以用于确定个体可以分析不同基因之间的连锁关系，可以分析群体之间的遗传差异，帮助PCR的基因型，为遗传分析提供基础数帮助研究人员了解基因的遗传模式研究人员了解种群的进化历史和亲缘据关系分子标记在病毒检测中的应用PCR病毒检测病毒定量使用特异性引物扩增病毒的基因片段，可以检测病毒的存在，并判可断以病使毒用的实类时型荧光定量技术，对病毒进行定量分析，了解病毒的感染量PCR分子标记技术的未来发展趋势PCR高通量技术自动化技术12随着高通量测序技术的发分子标记技术的自动PCR展，分子标记技术将化程度将会不断提高，减少PCR会更加高效地检测大量的多人工操作，提高实验效率和态性位点，为遗传研究提供准确性更全面的信息新技术融合3分子标记技术将会与其他技术融合，例如纳米技术、芯片PCR技术等，开发出更先进的分子标记技术。