《RNA建库流程》课件

建库流程RNA课绍库测数本件旨在介RNA建的完整流程，从样品制备到序据分析，并深入讨关键骤项探步和注意事课程大纲提取纯化RNA RNA杂质从生物样本中提取总RNA去除样本中的DNA和蛋白等质量检测去除RNA rRNA评纯估RNA的完整性和度去除样本中的rRNA，以富集mRNA建库流程示意图文库构建库骤将转为测库展示RNA建的各个步RNA片段化可序的DNA文高通量测序生物信息分析测对库进测对测数进读使用高通量序仪文行序序据行分析，解生物学意义提取RNA细胞裂解细释使用裂解液破坏胞膜，放RNARNA分离过术质细通离心或磁珠分离技，去除蛋白和其他胞成分RNA沉淀来加入异丙醇或乙醇，使RNA沉淀下RNA洗涤残杂质用75%乙醇洗涤RNA沉淀，去除留RNA溶解获终用RNase-free水溶解RNA，得最的RNA样本纯化RNA去除杂质1质杂质纯去除样品中的蛋白、脂类、多糖等，确保RNA的度和完整性浓缩RNA2将释浓缩续验浓稀的RNA溶液至适合后实的度，提高RNA的浓质度和量去除DNA3过残通DNase消化或其他方法去除留的DNA，确保RNA样品中不含有DNA污染质量检测RNA完整性RNA1评估RNA完整性，确保RNA未降解纯度RNA2检测纯RNA度，确保RNA不受污染浓度RNA3浓续验确定RNA度，用于后实完整性评估RNA完整性RNA1评断续验估RNA完整性，判是否适合后实电泳分析2检测使用琼脂糖凝胶电泳RNA完整性值RIN3检测计使用Bioanalyzer或Agilent2100RNA完整性并算RIN值定量分析RNA核酸浓度测浓使用NanoDrop或Qubit等仪器定RNA的度，确保样本量进续足够行后操作纯度RNA过断纯通OD260/280和OD260/230比值判RNA度，避免蛋白质续验或其他污染物干扰后实去除rRNA目的1测降低rRNA比例，提高mRNA比例，提高序效率方法2获RNase H降解rRNA，磁珠捕rRNA重要性3续测rRNA占总RNA的80%，去除rRNA可以提高后mRNA序的准确性富集mRNA去除rRNA1选择试剂进合适的盒，如Oligotex、RNase H、磁珠等行富集纯化mRNA2结纯使用oligodT磁珠或柱子合mRNA，并洗脱化定量分析3进浓使用NanoDrop或Qubit仪器行定量分析，确保mRNA度足够建库流程示意图提取质量检测文库构建高通量测序RNA RNA质评纯将测对库进测从样本中提取高量的总RNA估RNA完整性和度RNA片段化并添加接头利用序仪文行序文库构建文库质量检测1评库质测估文量，确保序效率扩增与纯化2扩库获测增文以得足够的序量接头连接3连测续测接序接头，方便后序碎片化与末端修复4将RNA片段化，并修复末端碎片化与末端修复123片段化末端修复添加尾RNA A将断对进饰为RNA打成特定长度的片段，便于RNA片段行修，使其具有平滑在RNA片段的3端添加一个A碱基，续库骤连连后建步的末端，有利于下一步接头接下一步接头接做准备接头连接连接酶1连使用T4DNA接酶温度2应16℃反15分钟目的3将连接头接到DNA片段两端扩增与纯化扩增1扩PCR增纯化2纯磁珠化文库质量检测片段大小分布检测库库使用生物分析仪或芯片文片段大小分布，确保文片段预围大小符合期范，并排除异常片段的影响文库浓度检测库浓库浓使用Qubit或Nanodrop等仪器文度，确保文度测现测数质达到序要求，避免出序据量下降的情况文库质量评估进库质使用Agilent Bioanalyzer或TapeStation等仪器行文评库纯库量估，分析文的完整性、度和片段大小分布，确保文质测量符合序要求测序准备文库质量控制1对库进质检测库质测文行必要的量，确保文量符合序要求测序平台选择2标数选择测根据研究目和据需求，合适的序平台测序参数设置3测读数满验设置序深度、长等参，足实需求样品准备4将库进释测进准备好的文行稀和混合，按照序平台要求行样品准备高通量测序文库制备1将测测库待DNA或RNA片段制备成可用于序的文上机测序2将库载测进测文加到序仪上，行高通量序数据分析3对测获数进获序得的原始据行分析，得生物学信息生物信息分析数据质控1质去除低量reads序列比对与注释2将对组reads比到参考基因差异表达分析3识别不同样本间的基因表达差异功能富集分析4分析差异表达基因的功能数据质控测序数据过滤质数去除低量reads，提高据可靠性碱基质量评估测质数分析序量，确保据准确性序列长度分布计评库统reads长度，估文构建效果序列比对与注释比对1将测组转录组数库进对序得到的RNA序列与参考基因或据行比注释2对结对应组转录根据比果，确定RNA序列于基因中的哪个基因或本功能分析3结转录合基因或本的功能信息，分析RNA序列的功能差异表达分析数据预处理对数进质归过滤原始据行量控制、一化、等处理，去除噪音和偏差差异表达基因筛选计筛选组显利用统学方法，出不同样本间表达差异著的基因结果可视化图热图结以火山、等形式展示差异表达基因的分析果功能富集分析基因集富集分析1确定差异表达基因集中富集的生物学通路或功能富集分析GO2数库分析差异表达基因集在基因本体（GO）据中富集的条目富集分析KEGG3数库谢分析差异表达基因集在KEGG据中富集的代通路或信号通路通路分析KEGG1Kyoto Encyclopediaof Genesand GenomesGO2Gene OntologyReactome3A curatedknowledgebase ofbiological pathwaysandreactions验证实验设计验证qRT-PCR1独验证立样本差异表达基因Western Blot2验证蛋白表达水平变化功能实验3验证基因功能影响验证qRT-PCR实验设计1选择内合适的参基因和目的基因提取RNA2试剂进质检测使用合适的盒提取总RNA，并行量合成cDNA3转录将转录为利用逆酶RNA逆cDNA反应qPCR4试剂应进使用qPCR盒，设置合适的反体系，行qPCR反应数据分析5软对数进使用合适的件qPCR据行分析，得出目的基因的表达量结果讨论差异表达基因分析功能富集分析通路分析结对组验组对进们分析果表明，与照相比，实差异表达基因行功能富集分析，可通路分析可以帮助我理解差异表达基显这这径中存在著差异表达的基因些基因以揭示些基因所参与的生物途和相因如何相互作用，并影响特定的生物途过状态关关径可能与特定生物程或疾病相联功能，提供更深入的生物学见解，从而揭示更完整的生物学机制注意事项严验时格控制实间，避免RNA降解试剂质储注意的量和存条件验记录验结做好实，确保实果的可重复性实验设备提取仪定量仪超声波破碎仪1RNA2PCR3检测浓将用于快速高效地从样品中提取RNA用于RNA的度和完整性用于RNA片段化成合适的长度常用试剂提取试剂纯化试剂RNA RNATrizol,TRIzol LS,RNeasy MiniDNase I,RNase-Free DNase,Kit,RNAzol RT等GlycoBlue等文库构建试剂测序试剂NEBNext UltraII RNALibrary IlluminaSequencing Kits,Prep Kitfor Illumina,TruSeq NovaSeq6000Reagent Kits等Stranded mRNALibrary PrepKit等参考文献RNA Sequencing:A PowerfulTool forTranscriptome ProfilingAComprehensive Guideto RNALibrary Preparationfor Next-Generation SequencingBestPractices forRNA SequencingData Analysis总结与展望库测关键骤库RNA建流程是高通量序研究中的步，从RNA提取到文构建，再测数环节关测术断到序和据分析，每个都至重要随着序技的不发展，RNA库断来将进建流程也在不优化，未一步提高其效率、准确性和可重复性。