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试验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析试验日期年月号试验地点生化试验室20231025合作者指导老师总分教师签名批改日期碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和镒离子为激活剂具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转AKP I移到另一种具有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解最适AKP范围为动物中重要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织欧（细PH
8.6—10,AKP胞膜上血清重要来自肝，小部分来自骨骼AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程体现的方式获得将碱性磷酸酶基因克隆到重AKP组载体，转入宿主菌中进行重组体现，并从体现菌提取，并进行酶动力学分析一试验原理、碱性磷酸酶的分离纯化1分离纯化的措施与一般蛋白质的分离纯化措施相似，常用中性盐盐析法、电泳法、AKP I色谱法、有机溶剂沉淀法等措施分离纯化有时需要多种措施配合使用，才能得到高纯度日勺酶蛋白本试验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离正丁醇能使部分杂蛋白变性，AKPo过滤除去杂蛋白即为具有日勺滤液，能溶于终浓度为日勺丙酮或欧乙醇中，AKP AKP33%30%I而不溶于终浓度为的丙酮或的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的50%60%IAKP、碱性磷酸酶的比活性测定2根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表达，单位（）来表达因此，测定样品的比活性必须测定每毫升样品中的蛋白质毫克数;每毫U/mg-pr ab升样品中的酶活性单位数酶日勺纯浓度越高酶日勺比活性也就越高本试验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐酚在碱性条件下与-氨基安替比作用，4经铁氟化钾氧化，生成红色的醍衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比于处比色，即可510nm求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶日勺活性单位可定义为在摄氏度保温3715min每产生Img的酚为一种酶活性单位样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定
3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响在环境的温度、和酶的浓度一定期，酶促反应速度与底物浓度之间的关系体现为反应PH开始时酶促反应的速度（V）随底物浓度（S）的增长而迅速增长若继续增长底物浓度，反应速度的增长率将减少当底物浓度增长到某种程度时，反应速度就会到达一种极限值，即最大反引起速度（Vmax）底物浓度与酶促反应速度H勺这种关系可用米氏方程式表_^Max[S]V=达KT+TST式中为最大反应速度；为底物浓度；为米氏常数；代表反应日勺起始速度Vmax[S]Km V
①当时，因此，等于酶促反应速度达最大值二分之一时的底物浓度v=Vmax/2Km=[S]Kmo
②Km是酶的最重要的特性性常数，测定Km值是研究酶动力学的一种重要日勺措施，大多数酶的值在Km
0.01-100mmol/Lo
③Km和Vmax欧I测定重要采用Lineweaver-Burk双倒数作图法此式为直线方程,以不一样的底物浓度为横坐标，以为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴1/S1/V方向延长，此线与横轴相交日勺负截距为由此可以对的球勺该酶的］值方-1/Km,H Km程式与图如下:⑸—=-―+——V V/vmax max本试验以碱性磷酸酶为例，测定不一样底物浓度时勺酶活性，再根据H Lineweaver-Burk法作图计算其值试验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游Km离酚和磷酸盐酚在碱性条件下与氨基安替比林作用，经铁氟化钾氧化，生成红4-色的酶衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比根据吸光值得大小可以计算出酶的活I I性，也可以从原则曲线上差得酚的含量，进而算出酶活性日勺大小
二、试验材料
（一）碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定、样品1兔肝、试剂2
①
0.5mol/L乙酸镁溶液
②O.lmol/L乙酸钠溶液
③
0.01mol/L乙酸镁一O.Olmol/L乙酸钠溶液
④O.Olmol/L Tris—
0.01mol/L乙酸镁PH
8.8缓冲液
⑤丙酮（分析纯）（）乙醇（分析纯）695%
⑦正丁醇（分析纯）
⑧
0.04mol/L底物液
⑨1mg/ml分原则液⑩
0.5mol/LN aO H⑪
0.3%4—氨基安替比林⑫
0.5%铁氟化钾⑬
0.lmg/mL蛋白原则液⑭碱性铜试剂©酚试剂、仪器与器材3
①研钵
②刻度离心管
③刻度吸管
④电动离心机
⑤玻璃漏斗和玻璃棒
⑥托盘天平
⑦恒温水浴
⑧可见分光光度计二底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响、样品1兔肝匀浆液、试剂2
①
0.04mol/L底物液
②
0.1mol/L碳酸盐缓冲液PH1037℃
③碱性溶液
④
0.5%铁氧化钾
⑤
0.3%4一氨基安替比林
⑥酚原则液
0.1mg/ml、仪器与器材3
①恒温水浴锅
②可见光分光光度计
三、试验环节一时提取AKP提取试验环节AKP环节操作1匀浆2g新鲜兔肝剪碎,加入O.Olmol/L乙酸镁一
0.01mol/L乙酸钠溶液
6.0ml,研磨成匀浆匀浆倒入刻度离心管中，记录其体积，此为液A吸取液于另一试管中，力口缓冲液稀释，此为稀释液A
0.1ml PH
8.8Tris
4.9ml A供此比活性用1:50,除杂蛋白2在液中加入正丁醇用玻璃棒充足搅拌室温放置用滤纸过滤A
2.0mL2min,20min,内酮沉淀3AKP滤液置于刻度离心管中，加入等体积的冷丙酮，立即混匀离心2023r/min5min溶解4AKP沉淀加入乙酸镁用玻璃棒充足搅拌使其溶解，记录其体积，此为
0.5mol/L
4.0ml,B液取液于另一试管中,加入缓冲液此为稀释液B
0.1ml PH
8.8Tris
4.9mL B1:50,供动力试验用二AKP的比活性测定、廿勺活性测定1AKP温浴水浴预温237℃5min加酶和底物3活性测定试验环节AKP环节操作加缓冲液1取试管支，按表操作3试剂测定管原则管空白管ml缓冲液------PH
8.8Tris
1.0底物液
0.04mol/L
1.
01.
01.
00.1mol/ml原则酚--
1.0应用液待测液L0酶促反应精保证温437℃15inin加显色液
0.5mol/LNaOH
1.
01.
01.05—氨基安替
0.3%
41.
01.
01.0比林铁氟化钾
0.5%
2.
02.
02.0显色反应6混匀，室温放置10min测吸光度处测吸光度7510nm、蛋白质含量测定2蛋白质含量测定试验环节环节操作1反应体系设取3支试管，按表操作置试剂测定管原则管空白管缓冲液--------PH
8.8Tris
1.0待测酶液
1.0—-蛋白原则液—
1.0—
0.1mg/ml碱式铜试剂
5.
05.
05.0反应混匀后室温放置210min加酚试剂酚试剂
30.5ml显色反应混匀后室温放置430min比色反应在处比色5510nm三底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响、底物浓度对酶促反应速度的影响1将新鲜兔肝用碳酸缓冲液匀浆，按倍稀释即可20酶曲线绘制环节环节操作反应体系设置取支试管标号，按表操作16试齐」1ml123456底物液--一O.Olmol/
10.
010.
200.
300.
501.00碳PHlOO.lmol/L
0.
070.
700.
700.
700.
700.70酸盐缓冲液蒸储水
1.
101.
000.
900.
700.
201.20水浴中保温保温37℃5min2加酶各管分别加入兔肝稀释匀浆液
30.10ml4酶促反应混匀，立即记录时间，将各管精保证温15min终止反应各管分别加入碱性溶液
51.0ml加显色剂各管分别加入氨基安替比林
60.3%4-
1.0ml各管分别加入铁氟化钾
0.5%
2.0ml显色7充足混匀，放置15min比色测定以号空白管作对照，于波长处比色测定86510nm9反应速度计算根据酚原则曲线计算出每样品酚的1含量，算出反应速度曲线绘制10以各管底物浓度的倒数为横坐标，以各管反应速度的倒数为纵1/[|S]1/V坐标，作图求出值Km、酚原则曲线的绘制的绘制2J酚原则曲线的绘制口勺绘制环节环节操作1反应体系设置取洁净干燥试管6支，依次加入试剂试剂（ml）123456酚原--
0.1mol/ml
0.
050.
100.
200.
300.40则溶液蒸僧水
2.
01.
951.
901.
801.
701.60预加热水浴中保温237℃5min加显色剂碱性溶液
31.
01.
01.
01.
01.
01.0—氨基
0.3%4L
01.
01.
01.
01.
01.0安替比林铁氧化钾
0.5%
2.
02.
02.
02.
02.
02.0显色反应混匀后，室温放置415min比色测定波长处比色5510nm6曲线绘制以酚含量微克为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制酚原则曲线注意事项一碱性磷酸酶日勺分解纯化和比活性测定、在纯化过程中，各步加入的有机试剂要计算精确1J、加入有机试剂混匀后应立即离心，不适宜放置过久
2、在测定酶活性时，每加入一种试剂须立即混匀，防止浑浊3
（二）底物浓度对碱性磷酸酶活性欧影响I、血清取量要精确
1、原则曲线必须是过原点勺一条直线2H、在酶促反应中，每管加入后立即计时，保证各管反应时间一致3。
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