《免疫细胞分离技术》课件

免疫细胞分离技术免疫细胞分离技术是现代免疫学研究和临床应用的基础工具通过各种先进的分离技术，科研人员能够从复杂的混合组织中获得高纯度的目标免疫细胞，用于后续的功能研究、药物筛选和免疫治疗本课程将系统介绍各类免疫细胞的分离原理和方法，包括密度梯度离心、免疫亲和、流式细胞术和磁珠分选等核心技术，以及不同免疫细胞类型的特异性分离策略和注意事项课程概述课程内容授课方式12本课程共十章，涵盖免疫细理论与实践相结合，通过多胞基础知识、分离原理、各媒体教学、实验室演示和案类细胞的特异性分离方法、例分析，帮助学生掌握关键纯度检测和功能验证从理技术和方法每章结束后有论到实践，全面介绍现代免练习题和讨论环节，促进知疫细胞分离技术的应用识内化适用对象3免疫学、细胞生物学、生物医学工程等专业高年级本科生、研究生，以及从事免疫学研究、细胞治疗和临床诊断的专业技术人员学习目标掌握基础知识理解各类免疫细胞的生物学特性、表面标志物和功能特点，为分离技术的选择和应用奠定理论基础熟悉技术原理掌握密度梯度离心、免疫亲和分离、流式细胞分选和磁珠分选等主要分离技术的工作原理、适用范围和操作流程实践操作技能能够独立完成外周血单个核细胞分离、细胞、细胞、细胞、树突T BNK状细胞和巨噬细胞的分离，并进行纯度检测和功能验证培养科研能力能够针对不同研究目的，设计合理的细胞分离策略，解决分离过程中的常见问题，并将分离技术应用于实际科研和临床工作第一章免疫细胞简介免疫细胞是机体免疫系统的核心执行单免疫细胞根据发育来源可分为骨髓源性研究免疫细胞的分离技术，首先需要了位，负责识别和清除外来病原体、异常和胸腺源性；根据功能可分为先天免疫解各类免疫细胞的基本生物学特性，以自身细胞和有害物质它们广泛分布于细胞和适应性免疫细胞不同类型的免便选择合适的分离方法和策略本章将血液、淋巴组织和各种组织器官中，共疫细胞在形态、表面标志物、功能机制概述主要免疫细胞类型的特征及其在免同构成了人体的免疫防御网络和分布位置等方面存在显著差异疫应答中的作用免疫细胞的类型淋巴细胞吞噬细胞抗原提呈细胞包括细胞、细胞和细胞，主要参与包括单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞主要包括树突状细胞、巨噬细胞和细胞T BNK B特异性免疫应答和免疫记忆形成，是适，负责吞噬和消化病原体及死亡细胞，，能够摄取、加工和提呈抗原，激活细T应性免疫的核心细胞同时分泌细胞因子调节免疫反应胞，连接先天免疫和适应性免疫淋巴细胞定义与特征分类淋巴细胞是最主要的免疫细胞根据发育来源和功能，淋巴细类型，约占白细胞总数的胞可分为细胞、细胞和20-T BNK它们体积小，核大细胞细胞三大类它们各自表达不40%质少，在血液和淋巴组织中广同的表面分子，执行不同的免泛分布，是适应性免疫的主要疫功能，共同参与机体的免疫执行细胞防御生物学特性淋巴细胞具有识别特异性抗原、产生免疫记忆和自我调节等特点它们在静息状态下体积小，活化后可增大并快速增殖，分化为效应细胞和记忆细胞细胞T发育和分化细胞源于骨髓造血干细胞，在胸腺中发育成熟，经过阳性选择和阴性T选择，确保只有能够识别自身但不与自身抗原过度反应的细胞才MHC T能存活分类与功能细胞主要分为辅助细胞（）和细胞毒性细胞（T CD4+T ThCD8+T）细胞可进一步分化为、、和调节性细胞（CTL ThTh1Th2Th17T）等亚型，参与调节免疫应答；直接杀伤被病原体感染的Treg CTL细胞表面标志物所有成熟细胞表面均表达和细胞受体（）复合物T CD3T TCR此外，不同亚群还表达特异性标志物，如、、、CD4CD8CD

25、等，用于区分不同功能的细胞亚群CD45RA CD45RO T细胞B发育过程1B细胞在骨髓中发育，经过多个阶段（前B细胞、前B细胞、未成熟B细胞）后成为成熟的初始B细胞，迁移至脾脏和淋巴结等外周淋巴组织发育过程中，B细胞重排免疫球蛋白基因，形成独特的B细胞受体（BCR）功能特点2B细胞是体液免疫的主要执行细胞，能够识别可溶性抗原，在T细胞帮助下活化、增殖并分化为浆细胞，分泌抗原特异性抗体部分活化B细胞可分化为长寿命的记忆B细胞，负责免疫记忆的形成表面标志物3成熟B细胞表面表达多种特征性分子，包括B细胞受体（膜表面免疫球蛋白）、CD

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21、CD22和CD40等这些分子既是B细胞鉴定的标志，也是B细胞分离的靶点细胞NK定义与起源识别机制自然杀伤（）细胞是一类大颗粒淋巴细细胞通过表面的激活受体和抑制受体平NK NK胞，属于先天免疫系统，起源于骨髓造血衡调节识别靶细胞当细胞表面分MHC-I干细胞，但其发育途径与细胞和细胞不子缺失或表达异常（如肿瘤细胞、病毒感T B12同细胞约占外周血淋巴细胞的染细胞），抑制信号减弱，激活信号占优NK5-15%，细胞被激活NK表面标志物功能作用人细胞主要表达和（细胞可直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染细NK CD56CD16FcγRIII NK），不表达根据表达强度，可胞，无需事先致敏；能分泌多种细胞因子CD3CD5643分为和两个亚群，功如、等，调节免疫反应；参与CD56bright CD56dim IFN-γTNF-α能略有差异其他特征性标志还包括抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（、、和等）NKp30NKp44NKp46NKG2D ADCC吞噬细胞吞噬细胞是先天免疫系统的重要组成部分，主要包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等它们通过识别病原体相关分子模式（）和损伤相关分子模式（），迅速做出免疫反应PAMPs DAMPs吞噬细胞的主要功能是吞噬并消化病原体、死亡细胞和异物；分泌细胞因子和趋化因子，调节炎症反应；部分吞噬细胞还能处理和提呈抗原，连接先天免疫和适应性免疫在细胞分离技术中，常利用吞噬细胞的贴壁性和特异性表面标志物进行分离抗原提呈细胞（）APC专职APC1树突状细胞是最有效的抗原提呈细胞，表达高水平的和共刺激分子MHC次级APC2巨噬细胞、细胞等也具有抗原提呈能力，但效率较低B非专业APC3其他组织细胞在特定条件下可表达提呈抗原MHC-I抗原提呈细胞是连接先天免疫和适应性免疫的桥梁，它们摄取外来抗原或自身异常蛋白，在细胞内进行加工处理，然后通过分子将抗原MHC肽段展示在细胞表面，提呈给细胞识别T除了提呈抗原外，专业还表达等共刺激分子和分泌细胞因子，提供细胞活化所需的第二信号和第三信号不同类型的APC CD80/CD86T APC有各自偏好的抗原摄取方式和处理途径，共同构成完整的抗原提呈网络第二章细胞分离的基本原理样本制备初步富集1组织消化、单细胞悬液制备密度梯度离心、红细胞裂解2纯度验证特异性分离4流式检测、功能分析3免疫亲和、流式分选、磁珠分选免疫细胞分离技术的核心原理是利用细胞之间的物理特性差异（如密度、大小、颗粒度）或生物学特性差异（如表面标志物表达），将目标细胞从混合细胞群中分离出来现代细胞分离技术通常结合多种原理，采用多步骤策略先通过物理方法进行初步富集（如从外周血中分离单个核细胞），再利用特异性方法进行精细分离（如从中分离特定的细胞亚群）这种策略既提高分离效率，又保证细胞纯度和活性PBMC T密度梯度离心法原理分离效果操作要点基于不同细胞类型密度差异，在离心力以分离为例，离心后形成多梯度介质与稀释血液需小心分层；离心Ficoll PBMC作用下，细胞在梯度介质中按密度大小层上层为血浆，中间层（界面层）为力、温度、加速和减速速率都需严格控分层常用的梯度介质包括、单个核细胞和血小板，下层为梯度介质制；离心后小心收集界面层，避免污染Ficoll等，通常调整为特定密度（如，底层为红细胞和粒细胞收集界面层；分离后需多次洗涤去除残留梯度介质Percoll）即可获得

1.077g/ml PBMC免疫亲和分离法免疫亲和分离特异性抗体与细胞表面标志物结合1基质固定抗体2抗体固定在磁珠、柱子或培养皿上靶细胞结合3目标细胞与固定抗体特异性结合非靶细胞洗脱4非目标细胞被洗脱，靶细胞被保留靶细胞回收5通过洗脱缓冲液或酶切回收目标细胞免疫亲和分离法利用抗原-抗体特异性结合原理，使用特异性抗体（通常为单克隆抗体）识别并结合细胞表面特异性标志物，从而将目标细胞从混合细胞群中分离出来根据操作模式，可分为正向分选（直接选择目标细胞）和负向分选（去除非目标细胞）此方法是现代细胞分离技术的核心，具有特异性高、效率高、细胞活性保存好等优点磁珠分选、流式细胞分选和亲和柱分离等技术都是基于免疫亲和原理的衍生技术流式细胞分选法细胞染色用荧光标记的特异性抗体标记目标细胞表面分子，不同细胞亚群可用不同荧光标记，实现多参数分析流式检测细胞悬液以单细胞流经激光束，每个细胞的散射光和荧光信号被探测器捕获，分析细胞理化特性和表面标志物表达电荷分选根据预设门限，赋予目标细胞特定电荷，使其在电场中偏转，被收集到相应的收集管中，实现物理分选收集分析分选后的细胞可进行纯度检测、功能分析或培养扩增现代流式分选仪可实现多达18个参数同时分析，且保持高细胞活性磁珠分选法原理利用包被特异性抗体的磁性微珠，与目标细胞表面抗原结合，在磁场作用下，标记细胞被吸附，非标记细胞流出，实现分离操作方式正向分选直接标记并保留目标细胞；负向分选标记并去除非目标细胞，收集未标记部分常见系统MACS系统（Miltenyi Biotec）磁性微珠与分离柱配合使用Dynabeads（Thermo Fisher）直接磁性分离，不使用柱子优势操作简便，可同时处理大量样本，保持细胞活性，成本相对较低，可实现多参数分选局限性纯度可能低于流式分选，难以分离极低丰度细胞，依赖特异性抗体的质量第三章外周血单个核细胞（）分离PBMC定义和意义主要方法12外周血单个核细胞（）是密度梯度离心法是PBMC Ficoll PBMC指外周血中的单核细胞、淋巴细分离的金标准，基于不同血液成胞和部分树突状细胞的总称，不分密度差异，在离心力作用下实包括红细胞、血小板和颗粒细胞现分层分离此外还有磁珠分离分离是大多数免疫细胞法、离心管法等改良PBMC Leucosep分离的第一步，也是最常用的基方法，适用于不同实验需求础细胞分离技术应用领域3分离的可用于免疫学基础研究、疫苗开发、细胞因子检测、细胞治PBMC疗（如）、药物筛选和毒性评价等多个领域掌握分离技术CAR-T PBMC是进行高级免疫细胞分离的前提分离的原理PBMC密度梯度离心法Ficoll血液稀释血液采集用稀释抗凝血PBS1:12抗凝管采集新鲜血液1分层加样轻轻铺在分离液上Ficoll35收集界面密度梯度离心吸取单核细胞层4离心分钟，缓加缓停800g30密度梯度离心法是分离最经典、最可靠的方法其基本原理是利用溶液的特定密度（通常为），在离心力作用下，FicollPBMCFicoll

1.077g/ml将血液中不同密度的组分分层操作关键点包括使用合适抗凝剂（如或肝素）采集血液；血液需稀释以降低黏度；分层时需极其小心，避免混合；离心条件严格EDTA1:1控制；收集界面层时需精准操作，避免吸入分离液或血浆正确操作可获得约纯度的，活性95%PBMC95%分离步骤（）PBMC1准备工作1准备材料新鲜全血（或肝素抗凝）、分离液、、无EDTA FicollPBS菌离心管、移液枪和吸头、离心机所有操作在生物安全柜内进行，试剂预热至室温，确保无菌环境血液稀释2将全血与等体积的混合均匀（稀释），稀释目的是降低血液黏PBS1:1度，防止红细胞聚集，提高分离效率稀释液应轻柔混匀，避免产生气泡和细胞损伤分层加样3在离心管中加入分离液，然后小心将稀释后的血液沿管15ml3ml Ficoll壁缓慢滴加到上层，保持两层界面清晰，不混合或使用Ficoll管，先加，离心后再加血液Leucosep Ficoll分离步骤（）PBMC2密度梯度离心1将加样完成的离心管放入离心机，设置800g（约2000rpm），常温离心30分钟，加速和减速均设为最低档位，避免离心过程中层次混合离心收集后可观察到清晰分层上层为血浆，中间为浑浊的白色环状界面层（2PBMCPBMC），下层为透明的Ficoll，底部为红细胞和粒细胞使用巴斯德吸管或移液器小心吸取界面层的PBMC，尽量少带血浆和Ficoll将收集的细胞转移到新的15ml离心管中，加PBS至10ml，轻轻混匀，300g离心10分钟洗涤弃上清，重悬细胞，再次洗涤1-2次，去除血细胞计数和质控3小板和残留Ficoll最后一次洗涤后，用适量PBS或培养基重悬细胞取少量细胞悬液与台盼蓝等量混合，在血球计数板上计数，确定细胞数量和活性正常情况下，每毫升全血可获得约1-2×10^6个PBMC，活性应95%可通过流式细胞术进一步检测PBMC组分分离注意事项PBMC样本处理血液样本应在采集后4小时内处理，过长时间会导致细胞活性下降若无法及时处理，应在室温保存，避免冷藏（会激活中性粒细胞）样本应轻柔混匀，避免剧烈震荡造成溶血操作技巧分层加样是关键步骤，必须保持界面清晰离心参数（速度、时间、加减速）需严格控制收集界面层时要精准，避免吸入过多Ficoll或血浆洗涤次数不应少于2次，确保去除残留分离液和血小板常见问题分离后回收率低可能是血液保存不当、离心参数不适或收集不完全红细胞污染可能是分层不清、离心参数不当或红细胞脆性增加细胞活性差可能与样本质量、操作时间过长或机械损伤有关细胞保存分离的PBMC可立即使用，或在4℃短暂保存（24小时）长期保存需使用冻存液（含10%DMSO的血清）缓慢冷冻至-80℃或液氮中冻存前，细胞浓度应控制在1-2×10^7/ml，确保冻存效果第四章细胞分离技术T重要性分离策略挑战与发展细胞是适应性免疫的核心细胞，在免细胞分离通常采用两步策略先通过细胞分离的主要挑战在于保持细胞的T T T疫监视、抗感染和抗肿瘤免疫中发挥关密度梯度离心法获得，再基于功能活性和表型稳定性近年来，封闭PBMC T键作用分离高纯度、功能完整的细细胞特异性表面标志（如、、式自动化分离系统和基于微流控技术的T CD3CD4胞对免疫学研究和细胞治疗（如）进行免疫分选主要分离方法包新方法不断涌现，提高了分离效率和细CAR-T CD8）至关重要从中分离细胞是括磁珠分选法和流式细胞分选法，可根胞质量，促进了细胞在基础研究和临PBMC T T常见的免疫细胞分离任务据实验需求选择正向分选或负向分选床应用中的广泛使用细胞表面标志物T磁珠分选细胞（原理）T正向分选负向分选两步分选使用抗抗体标记使用抗非细胞标志物先进行全细胞分离，CD3T T的磁珠直接标记细胞（如、、再分离特定亚群例T CD14CD16，在磁场中保留标记、等）的如，先使用抗磁CD19CD56CD3细胞，非标记细胞流抗体混合物，标记并珠获得全细胞，再使T出优点是操作简单去除非细胞，未标记用抗或磁珠T CD4CD8，缺点是分离的细胞的细胞流出优点是进一步分离亚群此T T表面结合有抗体，可获得的细胞表面无抗方法适用于低丰度亚T能影响后续功能研究体干扰，缺点是纯度群分离，可提高纯度可能略低和特异性磁珠分选细胞（步骤）T样本准备从外周血中分离PBMC，计数后调整细胞浓度至1×10^7/ml使用冰冷的分选缓冲液（含2%FBS和2mM EDTA的PBS）重悬细胞细胞应新鲜，活性90%，避免反复冻融磁珠标记以负向分选为例将细胞悬液与生物素标记的抗非T细胞抗体混合物（抗CD

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19、CD56等）孵育15分钟洗涤后，加入抗生物素磁珠，4℃孵育15分钟期间轻轻混匀，避免细胞沉降磁场分离将标记细胞悬液加入预湿润的分离柱（放置在磁铁架上）未标记的T细胞流出收集用缓冲液洗涤柱子3次，确保所有未标记T细胞洗脱若需高纯度，可使用两个连续柱子进行二次分离质量控制分离后进行细胞计数和活性检测使用流式细胞术检测T细胞纯度（CD3+比例）和亚群分布（CD4+、CD8+比例）分析分离效率（回收率=获得T细胞数/理论T细胞数×100%）典型纯度应95%，回收率90%流式分选细胞T

99.9%90%纯度活性流式分选可基于多参数精确选择目标细胞优化的分选参数可保持细胞功能完整80%4h回收率操作时间典型的T细胞流式分选回收效率单次分选处理1×10^7细胞所需时间流式细胞分选是基于荧光激活细胞分选（FACS）原理的高精度分离技术，能够同时分析多种细胞表面标志物，实现更精细的T细胞亚群分离典型的T细胞流式分选步骤包括细胞标记（使用荧光抗体如CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC等）；流式检测和设置分选门；电荷赋予和物理分选；收集分选细胞和质量控制与磁珠分选相比，流式分选的优势在于多参数分析能力强，可分离极低丰度亚群，纯度极高；劣势在于操作复杂，设备昂贵，速度较慢，不适合大规模细胞分离流式分选特别适用于研究性分离和稀有亚群（如记忆干细胞）分离细胞亚群分离T细胞亚群分离是在全细胞分离基础上的进一步精细分离，通常基于特定亚群的表面标志物常见的细胞亚群分离包括细胞TTT CD4+T（辅助细胞）分离，使用抗抗体；细胞（细胞毒性细胞）分离，使用抗抗体；细胞分离，使用T CD4CD8+TT CD8Treg低表达作为标志CD4+CD25+CD127细胞亚群分离可采用直接从一步分离或从预先富集的细胞中二次分离两种策略对于低丰度亚群（如、等），推荐采T PBMCT TregTh17用二步法，先富集总细胞，再分离特定亚群分离方法仍以磁珠分选和流式分选为主，具体选择取决于纯度要求、细胞数量和下游应用T第五章细胞分离技术B分离意义分离难点12细胞是体液免疫的主要执行者细胞在外周血中比例相对较低B B，负责产生抗体和建立体液免疫（约的），且不同5-15%PBMC记忆分离纯细胞对于研究抗个体和生理状态下波动较大B B体反应、疫苗评价、自身免疫疾细胞表面标志物种类多，不同分病机制和细胞淋巴瘤治疗等领化阶段表达谱差异大某些细B B域至关重要高纯度细胞是研胞亚群（如记忆细胞）极度稀B B究抗原特异性免疫反应和抗体基少，需特殊技术分离因库构建的基础分离策略3细胞分离通常采用两步策略先分离，再基于细胞特异性表面标志B PBMCB物（如、、）进行分选磁珠分选和流式分选是主要方法，CD19CD20CD22临床级分离还可使用纤维素柱吸附或自动化封闭系统细胞表面标志物B膜表面免疫球蛋白（）CD19CD20mIg细胞系最广泛的标志物，从前细胞到成熟细胞表面表达的钙通道蛋白，从前细胞受体的主要组成部分，成熟细胞B B B B B浆细胞前阶段均表达作为细胞共受体细胞晚期到浆细胞前阶段表达，浆细胞表达和，记忆细胞可表达、B BIgM IgDB IgG复合物的成员，参与信号转导是不表达广泛用于细胞淋巴瘤的靶向治或不同阶段细胞表达不同类型CD19B IgAIgE B细胞分离最常用的靶分子，几乎所有疗（如利妥昔单抗）也可用作细胞分和水平的，可用于区分不同细胞亚B BB mIgB细胞分离试剂盒都使用抗抗体离的靶分子，但覆盖范围略窄于群，如初始细胞和记忆细胞CD19CD19BB磁珠分选细胞B细胞准备磁珠标记从外周血或淋巴组织获取单细胞悬液，若为外周血，需先分离根据所选策略，加入相应磁珠标记的抗体正向分选使用抗CD19PBMC计数并调整细胞浓度至1×10^7/ml，使用含2%FBS和2mM磁珠；负向分选使用抗非B细胞标志物（CD

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14、CD16等）EDTA的PBS作为分选缓冲液确保细胞新鲜、活性高，且充分混的抗体混合物在4℃条件下孵育15-30分钟，期间轻轻混匀，避免匀成单细胞悬液细胞沉降1234分选策略选择磁场分离与质检可选择正向分选（直接标记CD19+B细胞）或负向分选（标记非B将标记细胞悬液加入置于磁铁架上的分离柱对于正向分选，洗脱细胞）正向分选操作简单，纯度高；负向分选可避免激活B细胞后移除磁铁，用缓冲液冲洗收集CD19+细胞；对于负向分选，直接或影响其功能根据下游研究需求选择合适策略，如功能研究优先收集流出液中的未标记B细胞分离后进行计数、活性检测和纯度选负向分选分析（流式检测CD19+比例，应95%）流式分选细胞B荧光标记将PBMC或淋巴组织单细胞悬液与荧光标记的B细胞特异性抗体（如CD19-PE、CD20-APC）和排除标记（如7-AAD用于排除死细胞）混合孵育若需分离特定B细胞亚群，可使用多色组合，如CD19+IgD+CD27-（初始B细胞）或CD19+IgD-CD27+（转换记忆B细胞）仪器设置在流式细胞仪上设置适当参数，包括散射光（前向散射FSC和侧向散射SSC）和荧光通道进行单染和FMO（Fluorescence MinusOne）对照，确定阳性群体的准确门限设置适当的分选速度和压力，平衡细胞纯度和回收率细胞分选确认门位置后，开始细胞分选对于常规B细胞分选，首先通过FSC/SSC选取淋巴细胞群体，排除细胞碎片；然后选择活细胞（7-AAD阴性）；最后根据CD19或CD20表达选择B细胞分选的细胞直接收集到含培养基的管中质量验证分选后取少量细胞进行复检，确认纯度（CD19+比例通常可达99%）计数分选细胞数量，计算回收率回收的B细胞可直接用于下游实验，如功能研究、RNA提取、单细胞测序或体外培养细胞亚群分离B第六章细胞分离技术NK分离挑战主要方法NK细胞在外周血中比例较低（约占NK细胞分离主要基于其特征性表面标PBMC的5-15%），且与部分T细胞亚志物（如CD56+CD3-），采用磁珠分群（NKT细胞）表型重叠成熟NK细选或流式分选技术临床规模NK细胞胞易被激活，分离过程可能影响其功分离可使用自动化系统，如临床意义应用方向能部分NK细胞亚群极为稀少，需特CliniMACS等体外扩增是获取大量NK细胞具有直接杀伤肿瘤细胞和病毒殊技术分离NK细胞的补充策略分离的NK细胞可用于基础研究（如杀感染细胞的能力，是肿瘤免疫治疗的伤机制研究）、药物筛选（如检测药重要效应细胞高纯度NK细胞的分离物对NK细胞功能的影响）和临床治疗是NK细胞治疗（如过继性NK细胞输（如过继性NK细胞治疗、CAR-NK细注、CAR-NK细胞）的关键环节胞治疗）等多个领域2314细胞表面标志物NK标志物表达特点分离中的应用CD56几乎所有人NK细胞表达，表达强度可分为NK细胞分离的主要阳性标志物CD56bright和CD56dim两个亚群CD16大多数NK细胞表达（主要是CD56dim亚群），介部分NK细胞分离方案中的辅助标志物导ADCCCD3NK细胞不表达CD3，T细胞表达NK细胞分离的主要排除标志物，区分NK和NKT细胞NKp46NK细胞特异性激活受体，表达相对稳定CD56表达异常时的替代标志物NKG2D NK细胞上表达的主要激活受体之一NK功能研究的重要标志物磁珠分选细胞NK正向分选使用抗CD56磁珠直接标记NK细胞，在磁场中保留标记细胞优点是操作简单，纯度较高；缺点是可能共同分选出少量NKT细胞（CD56+CD3+），且抗体结合可能影响CD56分子功能适用于对纯度要求不是极高的应用负向分选使用抗非NK细胞标志物（CD

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14、CD19等）抗体混合物，标记并去除非NK细胞优点是分离的NK细胞表面无抗体结合，功能保持完整；缺点是纯度可能略低于正向分选，且成本较高推荐用于功能研究和细胞治疗两步分选先去除明确的非NK细胞（如红细胞、单核细胞），再进行NK细胞特异性分选例如，先通过Ficoll分离PBMC，再进行NK特异性磁珠分选或先用抗CD3磁珠去除T细胞，再用抗CD56磁珠分选NK细胞这种策略可提高纯度和回收率临床级分离使用符合GMP要求的封闭式系统（如Miltenyi CliniMACS或Cytochrome大规模分离系统）进行自动化分离这些系统使用临床级试剂，可处理大量起始材料（如白细胞单采产物），获得足够临床使用的NK细胞，纯度和活性符合临床要求流式分选细胞NK流式分选是分离高纯度细胞及特定典型的细胞流式分选策略是首先流式分选的优势在于能够精确区分细微NK NK亚群的金标准方法基本流程包括通过选择淋巴细胞群体；排的表型差异，分离特定功能的亚群NK FSC/SSC NK样本制备（通常从开始）；荧除死细胞（阴性）；选择，且可同时分选多个不同群体缺点是PBMC7-AAD CD3-光抗体标记（典型组合为、群体作为细胞；必要时可进处理量有限，不适合大规模分离；设备CD56-PE CD56+NK和，加排一步根据表达强度和表达和操作要求高流式分选特别适用于研CD3-FITC CD16-APC7-AAD CD56CD16除死细胞）；流式仪器参数设置和门限分离亚群（和究性分离和稀有亚群（如组织驻留NK CD56brightCD16-NK确定；细胞分选和收集；质量控制和下）分选后的细胞细胞）的分离CD56dimCD16+NK NK游应用纯度通常可达以上99%细胞纯度检测NK流式细胞术检测免疫荧光显微镜功能验证最常用的细胞纯度检测方法典型组用荧光标记的抗和抗抗体染色通过功能测试间接评估细胞纯度和质NK CD56CD3NK合使用和双染色，细胞表现细胞，在荧光显微镜下观察细胞表量常用方法包括细胞毒性实验（如对CD56CD3NK NK为高质量分离应达到现为阳性（通常呈膜表达）、细胞的杀伤活性）、细胞因子分泌检CD56+CD3-90%CD56CD3K562的比例可添加、阴性此方法直观但通量低，主要用于少测（如、产生）和脱颗粒反应CD56+CD3-CD16IFN-γTNF-α等标志物进行多参数分析，或使用量样本的形态学确认和空间分布研究，不（表达）高活性是纯度高、质CD45CD107a、等功能分子评估细胞适合常规纯度检测量好的细胞的重要指标NKp46NKG2D NKNK亚群分布第七章树突状细胞（）分离DC技术研究价值分离挑战12树突状细胞是最强大的专职抗原在外周血和组织中含量极低DC提呈细胞，是连接先天免疫和适（外周血中的白细胞），且1%应性免疫的桥梁它们不仅是基存在多种亚型，形态和表型各异础免疫学研究的重要对象，也是不同组织中的表面标志物DC肿瘤疫苗和细胞治疗的关键工具表达谱存在差异，难以用统一标分离和培养高质量的对免准分离极易受到分离过程DC DC疫治疗的成功至关重要的刺激而改变表型和功能主要策略3分离主要采用三种策略直接从组织或血液中分离天然；从DC DC CD34+造血干细胞诱导分化；从单核细胞体外诱导分化为单核细胞衍生（DC DC）其中第三种方法最为常用，特别是在临床应用中MoDC的类型和特征DC外周血分离DC制备PBMC从健康供者外周血中通过Ficoll密度梯度离心法分离PBMCDC在外周血中比例极低（约占PBMC的

0.5-2%），需要大量起始血液（通常100ml）才能获得足够数量的DC用于研究富集策略由于DC比例低，通常需要先进行预富集，去除主要的非DC细胞群常用方法包括贴壁法去除单核细胞；抗体鸡尾酒（抗CD

3、CD

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16、CD19等）负向选择去除T细胞、单核细胞、NK细胞和B细胞；密度梯度进一步分离低密度细胞特异性分离DC亚型特异性分离主要基于特征性表面标志物pDC可使用抗CD123或CD303BDCA-2抗体分离；cDC1使用抗CD141BDCA-3抗体；cDC2使用抗CD1cBDCA-1抗体分离方法可采用磁珠分选或流式分选，后者纯度更高但通量较低质量评估分离后的DC需要进行纯度和功能验证纯度评估通常采用流式细胞术检测特异性标志物表达；功能验证包括形态学观察（特征性树突）、混合淋巴细胞反应（刺激T细胞增殖能力）、细胞因子产生谱和抗原呈递能力等体外诱导分化DC单核细胞分离1从PBMC中分离单核细胞，可采用贴壁法、密度梯度法或CD14磁珠分选法CD14磁珠分选纯度最高，但成本也最高贴壁法简便经济，但纯度较低典型分化培养的单核细胞纯度应90%，细胞活性95%2将纯化的单核细胞以密度

0.5-1×10^6/ml接种于含10%FBS的RPMI-1640完全培养基中，添加GM-CSF50-100ng/ml和IL-420-50ng/ml诱导分化为未成熟DC成熟诱导DC3培养物每2-3天添加新鲜细胞因子，总培养时间约5-7天未成熟DC具有强抗原摄取能力但抗原提呈能力弱要获得功能完整的成熟DC，需添加成熟刺激物，如LPS100ng/ml、TNF-α20ng/ml、IL-1β10ng/ml和收获与功能验证IL-615ng/ml的细胞因子鸡尾酒，或CD40L等，刺激24-48小时4成熟DC呈典型的星形或树枝状形态，半贴壁生长轻轻吹打即可收获验证成熟标志物表达（CD

80、CD

83、CD86和MHC-II高表达）和功能特性（低抗原摄取能力、高T细胞刺激能力和高水平IL-12产生）纯度和成熟度检测DC形态学观察表面标志物检测功能测试成熟呈典型的不规流式细胞术是评估功能测试是质量的DC DC DC则形态，有丰富的胞纯度和成熟度的主要最终评估包括混质突起或树突光学方法典型的标志合淋巴细胞反应（DC显微镜下可观察细胞物包括、），检测刺激同CD11c HLA-MLR形态；电子显微镜可（高表达）、种异体细胞增殖的能DR T观察更详细的超微结（低不表达）力；抗原特异性细胞CD14/T构，包括丰富的内质和特定亚型标志物激活试验；细胞因子网、溶酶体和成熟高表达分泌谱分析（如MHC-II DCCD80IL-小泡等、、和、等）；CD83CD8612p70IL-10，低表达抗原摄取能力（如胞CCR7CD1a和饮）CD207FITC-Dextran第八章巨噬细胞分离技术巨噬细胞是组织中的专职吞噬细胞，由巨噬细胞分离的主要挑战在于组织巨根据来源不同，巨噬细胞分离可分为三循环单核细胞迁移到组织后分化而来噬细胞与组织基质结合紧密，需要特殊类直接从组织中分离原代巨噬细胞；它们在先天免疫防御、炎症调节、组织方法分离；不同组织巨噬细胞表型和功从外周血单核细胞体外诱导分化；使用修复和抗原提呈等方面发挥重要作用能存在明显异质性，难以用统一方法分巨噬细胞系细胞（如、THP-1不同组织中的巨噬细胞具有特定名称和离；巨噬细胞易被机械刺激和消化酶激等）本章将重点介绍前两RAW

264.7功能特点，如肺泡巨噬细胞、活，影响功能研究；组织中巨噬细胞数种方法，特别是常用的腹腔巨噬细胞和Kupffer细胞、小胶质细胞和骨髓巨噬细胞等量有限，难以获得大量纯细胞肺泡巨噬细胞的分离技术巨噬细胞的来源和特征组织特异性巨噬细胞适应特定组织微环境的专职吞噬细胞1炎症巨噬细胞2由循环单核细胞迁移分化而来组织驻留巨噬细胞3胚胎期定居，可自我更新维持单核细胞4循环中的前体细胞骨髓祖细胞5单核细胞-巨噬细胞系统的起源巨噬细胞是一类高度异质性的免疫细胞，根据发育来源可分为两大类组织驻留巨噬细胞，起源于胚胎卵黄囊或胎肝祖细胞，在组织中长期维持并自我更新，如小胶质细胞、Langerhans细胞等；炎症巨噬细胞，由骨髓源性单核细胞在炎症条件下迁移到组织后分化而来巨噬细胞根据激活状态可分为M1型（经典活化，促炎症）和M2型（替代活化，抗炎症）不同极化状态的巨噬细胞表达不同的表面标志物、分泌不同的细胞因子，发挥不同的功能在分离和研究巨噬细胞时，需考虑其来源和极化状态的影响腹腔巨噬细胞分离腹腔细胞收集1腹腔巨噬细胞分离通常使用小鼠或大鼠作为来源可采集静息状态（未刺激）的腹腔巨噬细胞，或通过硫糖铝2ml4%、淀粉糊精或刀豆蛋白A等刺激物注射腹腔3-4天后收集募集的巨噬细胞（数量更多）麻醉动物后，暴露腹部，用含5-10mMEDTA的冰冷PBS5-10ml灌洗腹腔2-3次，收集腹腔液巨噬细胞富集2腹腔细胞悬液含有巨噬细胞、淋巴细胞、肥大细胞等多种细胞利用巨噬细胞的贴壁特性进行富集将细胞悬液接种于培养板中，37℃培养1-2小时，非贴壁细胞用PBS洗去，剩余贴壁细胞主要为巨噬细胞（纯度约70-80%）或使用密度梯度离心法初步富集巨噬细胞纯化与鉴定3若需更高纯度，可使用磁珠分选（抗F4/80或CD11b抗体）或流式分选（F4/80+CD11b+）分离的巨噬细胞可通过形态学观察（大型单核细胞，丰富的胞质），特异性标志物表达（F4/

80、CD11b、CD68等）和功能测试（吞噬能力、NO产生、细胞因子分泌等）进行鉴定肺泡巨噬细胞分离支气管肺泡灌洗肺组织消化纯化与鉴定肺泡巨噬细胞主要通过支气管肺泡灌洗（对于深层肺巨噬细胞，需进行肺组织消化初步获得的细胞可通过贴壁培养（小时）1-2）收集麻醉动物（小鼠大鼠）或利用将肺脏灌注清除血液，剪碎组织，用含消化富集巨噬细胞更高纯度需使用磁珠分选（BAL/人体肺叶切除标本，插管气管，用冰冷酶混合物（胶原酶、分散酶和）的人小鼠或）或流式分选（PBS III DNaseI CD14/F4/80CD11c反复灌洗肺泡（小鼠约次，大鼠约培养基消化分钟通过细胞筛过人小鼠

0.8ml×330-4570μm CD45+CD206+/CD11c+Siglec-次），收集灌洗液正常肺泡灌洗液滤获得单细胞悬液消化法获得的巨噬细胞）肺泡巨噬细胞呈圆形或椭圆形，胞质5ml×3F+中的细胞为肺泡巨噬细胞包含肺泡和间质两种类型丰富，含自体荧光；可通过吞噬测试、表面90-95%标志物检测和细胞因子分泌谱鉴定巨噬细胞的体外培养培养条件体外诱导分化12巨噬细胞通常在含血清（从外周血单核细胞诱导分化巨噬10-15%或自体血清）的细胞是常用方法将纯化的FBS RPMI-1640或培养基中培养可添加单核细胞（）培DMEM CD14+1×10^6/ml抗生素防止污染，但应注意某些养在含的完M-CSF50-100ng/ml抗生素（如庆大霉素）可影响巨全培养基中天型巨噬细5-7M1噬细胞功能培养板通常预先涂胞可通过和诱导，型LPS IFN-γM2布胞外基质蛋白（如纤连蛋白）通过和诱导不同诱导IL-4IL-13以促进贴壁和存活培养温度条件产生的巨噬细胞表型和功能℃，，湿度存在差异375%CO295%功能维持3巨噬细胞体外培养的主要挑战是维持其功能稳定性原代巨噬细胞通常不适合长期培养（周），随着培养时间延长，其表型和功能会发生显著变化1若需长期研究，建议使用巨噬细胞系（如、、等）或THP-1U937RAW

264.7从造血干祖细胞诱导/第九章免疫细胞分离后的纯度检测免疫细胞分离后的纯度检测是确保实验可靠性和重复性的关键步骤无论采用何种分离方法，都需要通过客观定量的方法确认分离细胞的身份、纯度和活性纯度检测不仅能验证分离技术的有效性，也是质量控制的重要环节常用的纯度检测方法包括流式细胞术（最常用，可定量分析特异性标志物表达）；免疫细胞化学免疫荧光染色（可观察标志物/表达和细胞形态）；分子生物学方法（检测特异性基因表达）；功能测试（验证细胞特征性功能）对于临床应用，通RT-PCR常需要多种方法综合评估，确保细胞产品符合质量标准流式细胞术检测原理细胞标记激光激发1荧光抗体与细胞表面标志物结合单细胞流过激光束被激发产生荧光2数据分析信号检测4软件处理生成点图和直方图显示细胞特性3散射光和荧光被检测器捕获转换为电信号流式细胞术是免疫细胞纯度检测的首选方法，能够在单细胞水平同时分析多个参数其基本原理是利用荧光标记的抗体特异性识别细胞表面或胞内分子，在激光照射下产生荧光信号，由检测器捕获并转换为数字信号进行分析现代流式细胞仪通常具有多个激光器和检测器，可同时检测10-30个参数检测免疫细胞纯度时，通常选择该细胞类型的特征性标志物（如T细胞的CD

3、B细胞的CD19等）和排除标志物（其他细胞类型的标志物），结合活死细胞染料，全面评估分离细胞的纯度、亚群组成和活性免疫荧光染色步骤细胞准备收集分离的细胞，用PBS洗涤，调整浓度至约1×10^6/ml制备细胞涂片（离心沉淀或细胞离心机）或贴壁培养于载玻片上必要时进行固定（4%多聚甲醛10分钟）和通透（

0.1%Triton X-100，仅检测胞内抗原时需要）封闭与标记使用封闭液（含5-10%血清的PBS）室温封闭30分钟，减少非特异性结合加入稀释适当的荧光标记一抗（如抗CD3-FITC、抗CD19-PE等），4℃孵育2小时或过夜用PBS-T洗涤3次，每次5分钟若使用非标记一抗，需进一步孵育荧光标记二抗核染色与封片加入核染料（如DAPI，1μg/ml）染色细胞核，室温5分钟PBS洗涤后，使用抗淬灭封片剂封片封片干燥后，在荧光显微镜下观察并拍照荧光通道选择应与所用荧光染料匹配，避免光谱重叠结果分析计算特定标志物阳性细胞比例（阳性细胞数/总细胞数×100%）作为纯度指标观察细胞形态和标志物表达模式，判断细胞身份合格的分离样本通常要求目标细胞纯度90%（研究用途）或95%（临床用途）必要时拍摄多个视野进行统计分析流式细胞仪操作要点仪器准备启动流式细胞仪，让系统稳定30分钟进行日常清洗和灭菌程序校准仪器，使用单染色对照调整补偿，消除荧光通道间干扰如有必要，使用荧光微球校准荧光强度，确保不同批次数据可比样本制备分离的细胞悬浮于FACS缓冲液（含2%FBS和2mM EDTA的PBS）中细胞数应适中（

0.5-1×10^6/样本），避免过多（堵塞）或过少（统计不足）准备单染色对照和FMO（Fluorescence MinusOne）对照，用于设置补偿和门限数据采集设置合适的阈值和收集速度，通常控制在1000-3000个事件/秒，避免过快导致多细胞聚集收集足够数量的事件（通常至少10,000个，对稀有群体至少100个），确保统计意义实时观察散点图，检查是否有异常模式分析策略使用FSC/SSC识别细胞群体，排除碎片用活死染料（如7-AAD、PI）或FSC-A/FSC-H排除死细胞和聚集根据关键标志物表达确定目标细胞群体计算目标细胞比例和绝对数量结果通常以比例、平均荧光强度MFI或直方图表示数据分析和解释纯度评估活性与功能亚群分析纯度计算方法目标细胞数总有效细胞数除纯度外，还应评估细胞活性（通常用多参数分析可进一步评估分离细胞的亚群组/7-例如，细胞分离后的纯度为或排除死细胞）和功能状态功能状成例如，细胞分离后可分析×100%T CD3+AAD PITCD4+/CD8+细胞百分比，细胞分离后的纯度为态可通过特定标志物表达反映，如细胞活比例、记忆初始细胞比例，或细胞比B CD19+T/T Treg细胞百分比研究用途纯度要求通常，化标志（、）、细胞活化标志例；细胞可分析初始记忆细胞比例；90%CD25CD69BB/B DC临床应用通常要求同时应关注污染细（、）或细胞活化受体表达（可分析成熟度标志表达亚群组成分析有助95%CD80CD86NK胞的类型和比例，某些污染（如死细胞）影、）功能检测可结合增殖实于更全面理解分离细胞的功能特点和潜在应NKG2D NKp46响较小，而其他污染（如激活细胞）可能严验、细胞因子分泌或特异性杀伤活性等用价值重干扰实验第十章分离细胞的功能检测细胞活性检测1验证细胞是否存活并保持基本代谢功能表型稳定性检测2确认细胞保持原有表面标志物表达谱功能应答测试3评估细胞对特定刺激的反应能力特异性功能验证4检测不同免疫细胞类型的特征性功能免疫细胞分离后的功能检测是评估分离质量的重要环节，也是确保下游实验可靠性的必要步骤分离过程可能对细胞功能产生影响，如表面抗体结合可能激活或抑制细胞，机械应力可能导致细胞应激，而分离试剂残留可能干扰细胞信号传导功能检测的选择应根据细胞类型和研究目的确定基本检测包括细胞活性（MTT/CCK-8或台盼蓝排斥）和应激状态（热休克蛋白表达或活性氧水平）特异性功能检测则针对各类免疫细胞的特征性功能，如T细胞的增殖和细胞因子分泌、B细胞的抗体产生、NK细胞的杀伤活性和DC的抗原提呈能力等细胞增殖实验T24h刺激时间T细胞完全活化所需最短时间72h增殖高峰CD3/CD28刺激后增殖达峰时间2-4增殖倍数健康T细胞72小时内的典型增殖倍数95%活性标准功能完整T细胞的最低增殖应答率T细胞增殖实验是评估分离T细胞功能完整性的基本方法主要刺激方式包括非特异性丝裂原刺激（如PHA、ConA）；抗CD3/CD28抗体刺激（模拟TCR信号）；同种异体混合淋巴细胞反应（MLR，反映对异体MHC的反应）；抗原特异性刺激（对特定抗原的记忆T细胞反应）增殖检测方法主要有CFSE标记法（通过细胞分裂稀释荧光强度评估增殖代数）；3H-胸腺嘧啶核苷掺入法（测量DNA合成）；MTT/CCK-8法（测量代谢活性）；BrdU掺入法（检测新合成DNA）；Ki-67表达检测（增殖标志物）功能完整的T细胞应表现出剂量依赖的增殖反应和细胞因子（如IL-

2、IFN-γ）产生细胞抗体分泌检测B细胞杀伤活性检测NK靶细胞准备1选择合适的靶细胞（如K

562、Yac-1等MHC-I低表达细胞系）使用CFSE、PKH26等荧光染料标记靶细胞，以便后续与效应细胞区分标记后洗涤靶细胞，计数并调整浓度死亡靶细胞将用PI或7-AAD染色鉴别效靶细胞共培养2将分离的NK细胞（效应细胞）与标记的靶细胞以不同效靶比（如10:

1、5:

1、

2.5:1）混合，在96孔板中共培养4小时设置靶细胞单独培养作为自发死亡对照，和Triton X-100处理靶细胞作为最大死亡对照培养条件为37℃，5%CO2杀伤活性测定3共培养结束后，加入PI或7-AAD染色死亡细胞使用流式细胞术检测CFSE+PI+双阳性细胞比例（代表被杀伤的靶细胞）计算特异性杀伤率实验组死亡%-自发死亡%/最大死亡%-自发死亡%×100%绘制效靶比与杀伤率的曲线评估NK活性功能解读4典型的健康供者NK细胞对K562靶细胞的杀伤率（效靶比10:1时）应40%通过剂量依赖曲线可计算半数杀伤率（EC50）如杀伤活性低于预期，应考虑分离过程中是否有抑制因素、细胞疲惫或激活受体下调等情况还可检测NK细胞脱颗粒（CD107a表达）和细胞因子分泌（IFN-γ）作为功能补充指标抗原提呈功能检测DC抗原摄取能力细胞刺激能力细胞因子分泌谱T使用荧光标记物质（如混合淋巴细胞反应（分泌的细胞因子决定DC葡聚糖、）是评估抗原细胞分化方向收集FITC-FITC-MLR DCT或荧光微球）检测提呈功能的金标准将培养上清或细OVA DCDC-T的吞噬或胞饮能力分离的与异基因细胞共培养上清，使用DCDCT将与荧光物质共培养胞以不同比例（如或流式细胞素检DC1:10ELISA小时，洗涤后通过流、、）共培养测关键细胞因子（如11:301:100IL-式细胞术或荧光显微镜天，检测细胞增殖、、3-5T12p70IL-10TNF-α检测摄取比例和强度（通过稀释或、）水平不同成CFSE3H-IL-6未成熟表现出强抗原掺入）和活化（熟状态和不同亚型的DC TdRDC摄取能力，成熟则下、表达）具有特征性细胞因子分DCCD25CD69调此功能功能完整的成熟应诱泌谱DC导强烈的细胞增殖反T应总结免疫细胞分离技术的应用前景药物开发基础研究建立疾病模型和药效评价系统2探索免疫细胞功能与调控机制1精准医疗个体化免疫细胞功能监测和干预35技术创新推动分离纯化工艺不断优化升级细胞治疗4免疫细胞产品开发和临床应用免疫细胞分离技术在过去几十年取得了长足进步，从简单的物理分离发展到多参数特异性分离，极大地促进了免疫学研究和临床应用现代分离技术的特点是高通量化（自动化设备处理大量样本）；微型化（微流控技术实现单细胞操作）；整合化（分离与功能分析一体化）；无标记化（基于物理特性的标记无关分离）；临床转化（符合GMP的封闭系统）随着单细胞技术和人工智能的发展，免疫细胞分离将更加精准高效新型分离技术如声波分选、介电分选和微滴阵列技术不断涌现这些技术进步将进一步推动免疫细胞治疗（如CAR-T、CAR-NK、DC疫苗）、精准免疫诊断和个体化免疫干预的发展，为攻克癌症、自身免疫病等重大疾病提供新的希望问题与讨论如何选择合适的分离方法？分离质量如何提升？12分离方法选择应综合考虑多种因提高分离质量的关键策略包括素目标细胞类型和丰度；样本优化起始样本的处理和保存；选来源和数量；对纯度和活性的要择高特异性分离标志物；减少操求；下游应用需求；可用设备和作时间和机械损伤；控制低温减技术条件；成本和时间限制对轻细胞应激；使用无菌技术防止于临床应用，还需考虑合污染；定期验证和校准设备；建GMP规性和质量控制要求立完善的质量控制体系新兴技术与发展方向3免疫细胞分离的未来发展方向包括高通量自动化系统；微流控单细胞分选技术；基于生物传感器的实时监测；人工智能辅助优化分离策略；整合型分离分析培养平台；无标记无干扰分离方法；符合临床转化的封闭系统--。