《本科生分子生物学》课件

本科生分子生物学揭示生命奥秘的分子基础探索核酸和蛋白质的结构与功能课程目标和学习要求掌握核心概念理解分子生物学基本理论和原理实验技能培养熟悉主要实验技术和操作方法分析能力提升培养科学思维和问题解决能力应用能力发展分子生物学的发展历史早期探索阶段11869年米歇尔发现DNA基础奠定阶段21953年沃森和克里克提出DNA双螺旋结构分子机制阶段31961年遗传密码破译开始技术革命阶段41975年DNA测序和重组DNA技术兴起基因组学时代52003年人类基因组计划完成核酸的化学组成五碳糖含氮碱基DNA含2-脱氧核糖嘌呤A和GRNA含核糖嘧啶C、TDNA和URNA核苷酸磷酸基团碱基+糖+磷酸连接核苷酸形成骨架核酸的基本单位提供负电荷的结构DNA双螺旋结构两条多核苷酸链围绕同一轴盘旋碱基配对A-T配对（双氢键）G-C配对（三氢键）反向平行排列两链方向相反5→3和3→5结构参数每转34Å，含10个碱基对的结构和类型RNAmRNA tRNA信使RNA，携带遗传信息转运RNA，运送氨基酸提供蛋白质合成的模板具有独特的三叶草结构其他rRNA RNA核糖体RNA，构成核糖体miRNA、siRNA、lncRNA等参与蛋白质合成参与基因表达调控核酸的理化特性紫外吸收特性热变性特性复性特性最大吸收波长260nm高温导致双链分离温度降低可重新形成双链变性后吸光度增加（增色效应）Tm值与GC含量正相关是核酸杂交技术的基础蛋白质的结构与功能酶催化功能防御功能运输功能结构功能催化生化反应抗体参与免疫防御血红蛋白运输氧气胶原蛋白提供结构支持信号传导激素和受体介导信号传递氨基酸的结构与性质氨基酸基本结构α-碳原子连接氨基、羧基和R基团按R基团分类非极性、极性不带电、带正电、带负电肽键的形成与蛋白质一级结构氨基酸缩合反应肽键形成一级结构游离状态的氨基酸分子羧基与氨基缩合失水C-N共价键连接氨基酸氨基酸线性排列顺序蛋白质的二级结构螺旋折叠无规则卷曲αβ骨架原子排列成右手螺旋肽链呈锯齿状排列不规则排列区域每圈

3.6个氨基酸残基相邻肽链间形成氢键常在蛋白质表面相隔4个残基的NH和CO形成氢键分为平行和反平行两种具有较高柔性蛋白质的三级结构和四级结构三级结构整个多肽链的三维折叠构象由多种化学键和作用力稳定•疏水作用•氢键•盐桥•二硫键四级结构多个亚基的空间排列组合亚基间相互作用形式•非共价键相互作用•同源或异源多聚体•对称或非对称排列结构稳定性影响因素包括•温度•pH值•离子强度•变性剂复制的基本概念DNA复制起始链延伸DNA解旋，形成复制起始点DNA聚合酶合成新链复制终止校对修复完成DNA分子复制检查并纠正错误配对原核生物复制DNA12复制起点复制方向单一环状染色体上只有一个oriC双向复制，形成两个复制叉330复制速度完成时间约1000个核苷酸/秒约30-40分钟完成整个基因组复制真核生物复制DNA多起点复制特定时间复制每条染色体上有多个复制起点S期完成DNA复制复制单位端粒复制复制子是独立复制的DNA片段需要特殊的端粒酶复制的酶系统DNA拓扑异构酶解除DNA超螺旋解旋酶解开DNA双链单链结合蛋白稳定单链DNA引物酶合成RNA引物DNA聚合酶合成新DNA链连接酶连接DNA片段复制的起始DNA识别起点起始蛋白识别特定DNA序列解旋DNA解旋酶打开双螺旋引物合成引物酶合成短RNA引物复制起始DNA聚合酶开始链延伸复制的延伸DNA复制的终止DNA复制叉会合两个复制叉相遇解旋停止DNA解旋酶活性终止连接末端连接酶连接DNA末端分子分离两个完整DNA分子分开修复机制DNA碱基切除修复识别并切除错误碱基修复小型DNA损伤核苷酸切除修复切除含损伤的DNA片段修复紫外线损伤错配修复识别并修复碱基错配提高复制准确性双链断裂修复连接断裂的DNA双链修复放射线损伤转录的基本概念转录起始RNA聚合酶结合启动子链延伸按DNA模板合成RNA转录终止RNA聚合酶脱离模板加工RNA转录产物进行修饰聚合酶的结构和功能RNA原核生物聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶RNA RNAI RNAII RNAIII核心酶α2ββ加σ因子转录rRNA前体转录mRNA和大多数snRNA转录tRNA和5S rRNA原核生物的转录过程启动子识别σ因子识别-10和-35区解链DNA形成转录泡核苷酸添加5→3方向延伸RNA链终止信号Rho依赖或非依赖终止真核生物的转录过程转录前起始转录起始转录延伸转录终止组装前起始复合物形成开放复合物RNA聚合酶II活性增强识别多聚A信号招募基本转录因子合成短链RNA延伸因子参与终止因子结合形成闭合复合物脱离启动子区域同时进行RNA加工RNA和DNA模板分离转录后加工剪接RNA识别剪接位点剪接体组装5和3剪接位点序列特异性snRNP和蛋白质形成剪接体外显子连接内含子切除相邻外显子连接形成成熟RNA两步转酯反应切除内含子转录后加工修饰RNA帽子结构5加入7-甲基鸟苷酸帽甲基化RNA特定位点甲基化修饰编辑RNA碱基插入、删除或替换聚尾3A添加多聚腺苷酸尾巴遗传密码及其特点三联体每三个核苷酸编码一个氨基酸简并性多个密码子可编码同一氨基酸无重叠密码子之间无重叠通用性大多数生物共用相同密码翻译的基本概念密码解读将核酸语言转换为蛋白质语言参与分子mRNA、tRNA、核糖体和辅助因子基本过程起始、延伸、终止三个阶段能量需求需要GTP水解提供能量和氨基酰合成酶tRNA-tRNA功能区域合成酶特异性反密码子识别mRNA密码子每种氨基酸对应特定合成酶接受臂连接氨基酸高度识别特异性结构反应过程tRNA三叶草二级结构两步反应L形三级结构消耗ATP能量核糖体的结构和功能原核生物核糖体真核生物核糖体功能位点70S核糖体80S核糖体A位接受位点30S小亚基16S rRNA和21种蛋白40S小亚基18S rRNA和33种蛋白P位肽基位点50S大亚基23S和5S rRNA及34种蛋白60S大亚基28S、

5.8S和5S rRNA及49E位退出位点种蛋白PTC肽基转移中心翻译的起始起始复合物形成原核生物•30S亚基结合mRNA和起始tRNA•IF

1、IF2和IF3参与•识别SD序列和AUG密码子起始复合物形成真核生物•43S前起始复合物形成•结合mRNA形成48S复合物•扫描机制寻找AUG密码子•多种eIF因子参与完整核糖体组装大亚基结合，形成完整核糖体起始因子释放准备进入延伸阶段翻译的延伸氨基酰结合肽键形成-tRNAEF-Tu/eEF1A携带tRNA进入A位P位多肽链转移至A位氨基酸循环移位A位空出准备接受下一个tRNA EF-G/eEF2促进核糖体移位翻译的终止1终止密码子UAA、UAG或UGA进入A位2释放因子结合RF1/RF2原核或eRF1真核识别终止密码子3多肽链释放催化酯键水解，释放新合成蛋白质4核糖体解离核糖体亚基分离，可重新参与翻译翻译后修饰蛋白质剪切化学基团添加二硫键形成亚基组装去除信号肽或前导序列磷酸化、糖基化、甲基化等稳定蛋白质三维结构多亚基蛋白质的组装成熟定位运输转运至正确细胞位置原核生物基因表达调控操纵子模型操纵子组成负调控模式启动子RNA聚合酶结合位点抑制物阻断基因表达操作子调控蛋白结合位点诱导物解除抑制结构基因编码蛋白质例如乳糖操纵子正调控模式激活蛋白激活转录通常响应环境信号例如阿拉伯糖操纵子乳糖操纵子抑制状态诱导状态基因产物无乳糖环境下乳糖存在环境下β-半乳糖苷酶抑制物结合操作子乳糖与抑制物结合透酶RNA聚合酶无法转录抑制物构象改变硫代半乳糖苷酰转移酶无法结合操作子色氨酸操纵子真核生物基因表达调控转录水平顺式作用元件DNA上的调控序列•核心启动子•近端启动子•增强子•沉默子•应答元件反式作用因子调控蛋白质•基本转录因子•特异性转录因子•辅激活因子•辅抑制因子染色质结构调控影响DNA可及性•染色质重塑•组蛋白修饰•DNA甲基化真核生物基因表达调控转录后水平可变剪接一个基因产生多种mRNA稳定性mRNA调控RNA降解速率定位mRNA控制RNA转运和亚细胞定位翻译抑制miRNA和siRNA调控机制表观遗传学调控定义特点主要机制生物学意义不改变DNA序列的遗传现象DNA甲基化基因表达精细调控可遗传至子代细胞组蛋白修饰细胞分化和发育受环境因素影响非编码RNA调控基因组稳定性维持可逆性修饰染色质重塑环境适应性反应甲基化DNA甲基化建立甲基化维持DNMT3催化从头甲基化DNMT1维持DNA复制后甲基化模式基因沉默甲基化去除启动子甲基化抑制基因表达TET酶催化主动去甲基化组蛋白修饰乙酰化中和赖氨酸正电荷，松弛染色质，激活转录甲基化可激活或抑制转录，取决于位点和程度磷酸化参与染色质凝聚和DNA修复泛素化调控蛋白稳定性和活性非编码调控RNAmiRNA21-23nt，转录后抑制siRNA21-25nt，靶向mRNA降解piRNA26-31nt，沉默转座子lncRNA200nt，多种调控功能circRNA环状RNA，miRNA海绵基因重组的基本概念遗传多样性1产生新的基因组合修复DNA修复受损DNA基因组稳定性3维持染色体完整性进化动力加速物种适应和进化同源重组双链断裂DNA双链断裂形成同源序列搜索RecA/Rad51介导搜索配对链侵入与置换形成D-loop结构结构形成Holliday形成十字结构中间体解析与连接切割解析重组产物位点特异性重组1特异位点识别2DNA断裂重组酶识别特定DNA序列切割特定识别位点DNA交换4DNA连接DNA片段交换位置DNA末端重新连接转座子和基因重排转座子转座子DNA RNA剪切-粘贴机制复制-粘贴机制完全离开原位置通过RNA中间体例如Tn5，Tn10例如反转录转座子生物学意义基因组多样性基因表达调控染色体结构改变基因工程的基本原理目的基因获取PCR扩增或合成酶切DNA限制性内切酶切割连接DNA连接酶催化连接转化宿主重组DNA导入宿主细胞筛选鉴定鉴定目的克隆限制性内切酶和连接酶DNA限制性内切酶连接酶DNA特点功能•识别特定DNA序列•催化DNA片段连接•在特定位点切割•形成磷酸二酯键•产生平端或粘性末端•修复DNA断裂分类种类•I型复杂、随机切割•T4DNA连接酶需ATP•II型简单、特定位点切割•E.coli DNA连接酶需NAD+•III型需ATP，切割识别序列附近克隆载体系统噬菌体载体人工染色体容量较大BAC、YAC、PAC高效包装可容纳大片段质粒载体穿梭载体λ或M13噬菌体稳定传递复制起点多宿主复制抗性标记多种选择标记多克隆位点便于表达检测3技术原理及应用PCR变性95℃使DNA双链分离退火50-65℃引物与模板结合延伸72℃DNA聚合酶合成互补链循环30-40次循环指数扩增目标序列基因表达系统基因组学概述结构基因组学功能基因组学比较基因组学DNA序列测定和分析基因功能和表达研究不同物种基因组比较计算基因组学基因组数据计算分析转录组学和蛋白质组学转录组学蛋白质组学研究对象研究对象•全部RNA转录物•全部蛋白质产物•转录水平基因表达•蛋白质表达与修饰主要技术主要技术•RNA-Seq•质谱分析•芯片杂交•蛋白质芯片•单细胞测序•蛋白质互作组生物信息学基础序列分析比对、搜索和进化分析结构预测蛋白质和RNA二级、三级结构功能注释预测基因和蛋白质功能系统生物学整合多组学数据分析基因编辑技术CRISPR/Cas9系统组成CRISPR/Cas9•Cas9核酸酶•sgRNA引导分子工作原理•sgRNA识别目标序列•Cas9切割DNA双链•细胞修复机制修复断裂编辑方式•非同源末端连接基因敲除•同源定向修复精确编辑•碱基编辑单碱基修改分子生物学在医学中的应用分子诊断基因治疗核酸检测技术诊断疾病导入功能基因修复缺陷精准医疗疫苗开发基于基因组信息个体化治疗mRNA疫苗等新型疫苗技术分子生物学在农业中的应用转基因作物分子标记育种基因编辑技术抗虫、抗除草剂、抗病作物加速育种进程，提高选择效率精确改良作物性状分子生物学在环境科学中的应用1000+环境基因组学监测环境微生物群落多样性100+生物修复基因改造微生物降解污染物50+生物传感器基于分子识别的环境污染检测30+合成生物学设计新型微生物处理环境问题课程总结与展望前沿技术拓展单细胞分析、多组学整合等新技术交叉学科融合与信息学、纳米科学等交叉融合应用领域拓展医学、农业、环境等领域广泛应用知识体系建构4分子生物学基本原理与技术方法。