生物化学实验复习课件

生物化学实验复习课件欢迎参加生物化学实验复习课程本课件将系统地回顾生物化学实验中的基本原理、操作技能和实验方法，帮助同学们巩固实验知识，提高实验技能我们将详细讲解蛋白质、糖类、脂类、核酸和酶学实验的相关内容，以及重要的色谱和电泳技术原理通过本课件的学习，你将能够全面回顾生物化学实验的关键知识点，掌握实验技术的原理与应用，提高在实际实验中的操作能力和数据分析能力，为将来的学习和研究奠定坚实基础课程概述1课程目标2学习要求本课程旨在帮助学生掌握生物化学学生需要认真预习实验内容，掌握实验的基本原理和操作技能，培养实验原理和具体步骤；按时参加所学生独立设计和执行生物化学实验有实验课程并完成实验报告；遵守的能力通过系统学习蛋白质、糖实验室安全规则，熟练掌握实验基类、脂类、核酸和酶学实验，学生本操作技能；积极思考实验现象和将能够理解生物大分子的结构与功结果，培养科学思维和问题解决能能，并学会应用现代生物化学技术力解决科学问题3考核方式课程考核采用平时表现（30%）、实验报告（40%）和期末考试（30%）相结合的方式平时表现包括出勤率、实验准备和操作规范；实验报告评分基于数据记录、结果分析和讨论质量；期末考试将考察学生对实验原理和方法的理解实验室安全规范个人防护试剂使用注意事项仪器操作安全进入实验室必须穿着实使用前仔细阅读试剂标使用仪器前必须阅读操验服，长发需束起操签和安全数据表取用作手册，严格按照操作作危险化学品时必须佩试剂时不得用手直接接规程使用电气设备使戴防护眼镜和手套严触腐蚀性和挥发性试用前检查电源线是否完禁在实验室内饮食、吸剂必须在通风橱中操作好，确保接地良好高烟或化妆离开实验室使用有毒试剂时避免速离心机必须平衡后再前必须洗手，防止化学吸入蒸气废弃物必须启动实验结束后，关污染如皮肤接触化学按规定分类处理，不得闭所有电源和气源，清品，应立即用大量清水随意倾倒入水槽理工作台面冲洗并报告指导教师实验基本操作技能移液技术1移液是生物化学实验最基础的操作之一使用移液器前应检查其准确性和精密度根据所需体积选择合适规格的移液器移液时保持垂直姿势，缓慢匀速按压按钮，避免产生气泡液体吸取与排放应在同一速度下完成，以确保准确度定期校准移液器以维持其准确性称量技术2准确称量是配制溶液的关键步骤使用分析天平前需检查水平气泡位置，必要时调整水平称量前应校准天平至零点称量化学品时应使用称量纸或称量皿，避免直接接触天平盘精确称量时应关闭天平门，避免气流影响称量完毕后清理天平，确保下次使用准确无误溶液配制3配制溶液时，先计算所需试剂量，然后精确称量固体试剂应先溶解在少量溶剂中，再逐渐加入更多溶剂至接近所需体积使用容量瓶调节至准确体积，边加溶剂边摇匀pH敏感溶液需使用pH计调节酸碱度配制完成的溶液应贴上标签，注明名称、浓度和配制日期实验室常用仪器介绍分光光度计离心机pH计分光光度计是测量物质对特定波长光吸收的离心机用于分离混合物中的组分使用前检pH计是测量溶液酸碱度的精密仪器使用仪器使用前需预热15-30分钟，并用空白查转子是否安装牢固，样品管必须对称放置前需用标准缓冲液校准（通常为pH

4.

0、对照调零样品吸光度应在

0.1-

1.0范围内，以保持平衡设定转速、温度和时间后再启

7.0和

10.0）测量时，电极浸入溶液中，超出此范围需稀释样品使用比色皿时应避动离心过程中不得打开盖子，离心结束后轻轻搅拌后静置等待读数稳定不用时电极免触摸光路部分，以防留下指纹影响读数待转子完全停止再取出样品高速离心时注应浸泡在存储溶液中，避免干燥电极污染测量完毕后，清洗比色皿并擦干，避免残留意控制温度，防止样品因高温变性定期检后需及时清洗，延长使用寿命测量强酸或试剂腐蚀比色皿查离心机状态，确保安全使用强碱溶液后应立即清洗电极蛋白质实验1蛋白质检测方法分类实验原理实验应用蛋白质定性实验可分为呈色反应、沉淀反蛋白质定性实验基于蛋白质分子中特定化蛋白质定性实验广泛应用于食品安全检测应和特殊基团检测三大类呈色反应利用学基团或结构与试剂间的特异性反应例、临床诊断和生物化学研究在食品工业蛋白质特定基团与试剂反应产生特征颜色如，双缩脲反应依赖于肽键与铜离子形成中用于检测食品中的蛋白质含量；在医学，如双缩脲反应和茚三酮反应沉淀反应紫色配合物，而茚三酮反应则检测游离氨临床上用于检测体液中的异常蛋白；在研则利用重金属离子、强酸或有机溶剂使蛋基这些反应的特异性和灵敏度各不相同究中则用于确认蛋白质的纯化效果和鉴定白质变性沉淀特殊基团检测针对特定氨，可根据实验目的选择合适的检测方法特定蛋白质的存在基酸残基，如米隆反应检测酪氨酸蛋白质实验2双缩脲反应原理双缩脲反应是检测蛋白质的经典方法，基于肽键与铜离子在碱性条件下形成紫色配合物的原理只有含有至少两个肽键的分子才会呈现紫色，单个氨基酸不会产生阳性反应反应的颜色强度与肽键数量成正比，可用于蛋白质的半定量分析这一反应特异性强，几乎所有蛋白质都呈现阳性结果实验步骤取5毫升待测蛋白质溶液于试管中，加入5毫升10%氢氧化钠溶液混匀缓慢滴加1-2滴1%硫酸铜溶液，轻轻摇匀观察溶液颜色变化，紫色表示蛋白质存在对照组应包括空白对照（蒸馏水）和阳性对照（已知蛋白质溶液，如牛血清白蛋白）比较不同浓度蛋白质溶液的颜色深浅注意事项硫酸铜溶液添加量不宜过多，否则会产生铜离子的蓝色，掩盖双缩脲反应的紫色实验结果应在加入硫酸铜后立即观察，因为反应颜色会随时间减弱某些非蛋白质物质如胆碱也可能干扰反应结果，解释结果时应谨慎实验废液应收集处理，不可直接倒入水槽结果分析紫色反应的强度与蛋白质浓度成正比，可通过目视或分光光度计测量540nm处的吸光度进行定量分析多肽需至少含有三个氨基酸才能产生明显反应反应灵敏度较低，检测限约为

0.5-1mg/mL在蛋白质纯化过程中，可用此方法快速检测各组分中蛋白质的存在蛋白质实验3原理介绍考马斯亮蓝法是一种常用的蛋白质定量方法，基于考马斯亮蓝G-250染料在酸性条件下与蛋白质结合形成蓝色复合物的原理染料主要与蛋白质中的碱性和芳香族氨基酸残基结合，导致染料的最大吸收波长从465nm移至595nm由于其简便、快速和灵敏度高的特点，成为蛋白质定量的首选方法之一实验步骤首先配制标准蛋白质溶液系列（通常使用牛血清白蛋白，浓度范围0-1mg/mL）取100μL各浓度标准蛋白和待测样品加入试管中，分别加入5mL考马斯亮蓝G-250工作液，充分混匀室温孵育5-10分钟后，使用分光光度计在595nm波长测定吸光度以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，由待测样品的吸光度计算其蛋白质浓度结果分析绘制标准曲线时应确保线性关系良好，相关系数R²应大于

0.99标准曲线的线性范围通常为

0.1-

1.0mg/mL，样品浓度超出此范围需适当稀释考马斯亮蓝法的检测灵敏度高，可检测低至1-5μg/mL的蛋白质不同蛋白质由于其氨基酸组成不同，对染料的结合能力也不同，因此标准蛋白的选择应尽量与目标蛋白相似注意事项染料工作液应避光保存，避免长时间暴露在强光下一些表面活性剂、缓冲液成分和还原剂可能干扰测定，需在样品制备时考虑反应过程中形成的蓝色复合物相对不稳定，应在混合后2小时内完成测定操作过程中需小心避免染料污染实验服和实验台，染色后难以清洗始终包括空白对照以排除背景干扰蛋白质实验4原理仪器准备紫外吸收法测定蛋白质基于蛋白质中的芳香族氨1使用紫外可见分光光度计，检查仪器功能是否正基酸（主要是色氨酸和酪氨酸）在280nm波长处2常，预热15分钟以上准备石英比色皿，用无水有强吸收的特性该方法简便快速，不破坏样品乙醇清洗后晾干，适用于纯化蛋白的浓度测定数据计算样品测定4使用蛋白质的消光系数计算浓度C=A₂₈₀/ε使用适当缓冲液作为空白对照调零将蛋白质溶3×L，其中C为浓度，A₂₈₀为吸光度，ε为消光液装入比色皿，在280nm波长处测量吸光度记系数，L为光程录数据并计算蛋白质浓度紫外吸收法的优点在于操作简单，无需额外试剂，且不破坏样品，测定后的样品可继续用于其他实验然而，该方法也存在一些局限性核酸在260nm处有强吸收，可能干扰测定结果；不同蛋白质由于芳香族氨基酸含量不同，其消光系数差异较大；测定溶液必须澄清，悬浮颗粒会导致散射干扰对于未知蛋白质，若无法获得其消光系数，可使用经验公式1A₂₈₀≈1mg/mL蛋白质为提高准确性，可同时测量260nm和280nm的吸光度，通过公式校正核酸的干扰该方法检测限约为

0.05-

0.1mg/mL，适用于相对纯净的蛋白质溶液蛋白质实验5SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是分析蛋白质分子量和纯度的有力工具SDS是一种阴离子表面活性剂，能与蛋白质以恒定比例（

1.4g SDS/g蛋白质）结合，使蛋白质变性并带有均一的负电荷在电场作用下，蛋白质-SDS复合物主要按分子量大小分离，分子量小的蛋白质迁移速度快制备凝胶时，分离胶浓度决定了分离范围，通常6-15%的凝胶适用于10-200kDa的蛋白质上样前，样品与含SDS、β-巯基乙醇的缓冲液混合并加热，以打断二硫键电泳完成后，可用考马斯亮蓝、银染色或特异性抗体检测蛋白质条带通过与已知分子量标准品比较，可估算目标蛋白的分子量该技术广泛应用于蛋白质纯度分析、分子量测定和Western印迹的前处理糖类实验1先进特殊检测1色谱-质谱联用技术实现高灵敏度检测定量分析方法2蒽酮法、苯酚-硫酸法测定总糖特定糖类检测3碘化钾检测淀粉、塞利文试剂检测己糖还原糖检测4斐林试剂、本尼迪克试剂、纸层析法糖类基础检测5莫利休试剂检测碳水化合物糖类定性实验是生物化学实验中的重要内容，旨在检测和鉴别不同类型的糖分子糖类分子具有多种官能团，如羟基、醛基或酮基，这些基团可与特定试剂发生反应产生特征性颜色变化或沉淀，从而实现糖类的定性分析常见的糖类定性实验包括莫利休反应（检测所有碳水化合物）、斐林反应和本尼迪克反应（检测还原糖）、塞利文反应（检测己糖）以及特异性试剂如碘液检测淀粉等这些定性实验各有特点和适用范围，正确理解其原理和特异性对实验结果的准确解释至关重要例如，某些非糖物质也可能与这些试剂发生反应，导致假阳性结果因此，通常需要结合多种方法进行综合分析，以提高检测的可靠性现代分析中，虽然已有更精确的色谱和质谱技术，但这些经典定性方法因其简便快速的特点，仍在基础教学和初步筛查中广泛应用糖类实验2斐林试剂配制1斐林A液（硫酸铜溶液）与斐林B液（酒石酸钠钾和氢氧化钠溶液）使用前混合实验操作2等量混合样品与斐林试剂，水浴加热，观察颜色变化还原糖反应3还原糖的醛基或酮基还原Cu²⁺为Cu⁺，形成红色氧化亚铜沉淀结果判断4红色沉淀表示还原糖阳性，无颜色变化表示阴性斐林试剂检测还原糖是糖类定性分析中的经典方法该方法基于还原糖分子中的醛基（直链醛糖）或潜在醛基（环状糖在碱性条件下开环）还原斐林试剂中的Cu²⁺为Cu⁺，后者以红色氧化亚铜（Cu₂O）沉淀形式呈现常见的还原糖包括葡萄糖、果糖、麦芽糖等，而蔗糖等非还原糖则呈阴性反应实验结果判断时应注意，反应的敏感性与糖的种类有关，醛糖通常比酮糖反应更明显反应的强度也可用于粗略估计还原糖的浓度，浓度越高，产生的沉淀越多此外，反应溶液的pH值必须严格控制在碱性范围，因为只有在碱性条件下环状糖才能开环，暴露出醛基参与反应在临床应用中，改良的斐林试剂用于检测尿糖，帮助诊断糖尿病；在食品工业中则用于监测食品中还原糖的含量糖类实验3蒽酮法是测定总糖含量的经典方法，基于糖类在浓硫酸作用下脱水生成糠醛衍生物，这些衍生物与蒽酮反应产生蓝绿色复合物该方法适用于检测几乎所有糖类，包括单糖、双糖和多糖，因其高灵敏度（检测限低至5μg/mL）和良好的线性关系而广泛应用于食品、植物和环境样品分析实验操作包括准备标准糖溶液系列（通常使用葡萄糖，浓度范围0-100μg/mL）；将2mL样品或标准溶液与4mL蒽酮试剂（

0.2%蒽酮在浓硫酸中的溶液）混合，立即冷却；在沸水浴中加热10分钟后迅速冷却至室温；在620nm波长测定吸光度；根据标准曲线计算样品中的总糖含量注意事项包括蒽酮试剂需新鲜配制并避光保存；加入浓硫酸时温度升高，需在冰浴中操作；不同糖类对蒽酮的反应程度不同，如己糖反应强于戊糖，因此标准曲线应选择与样品性质相近的糖类糖类实验4540测量波长nmDNS法标准测量波长，最大吸收区域3,5二硝基水杨酸含量%标准DNS试剂中的最适浓度

0.01检测限mg/mL可靠检测的最低还原糖浓度95反应温度°C水浴加热的最佳反应温度DNS法（3,5-二硝基水杨酸法）是测定还原糖含量的常用方法，其原理是还原糖在碱性条件下加热时，将DNS试剂中的3,5-二硝基水杨酸还原为3-氨基-5-硝基水杨酸，后者呈现橙红色反应的颜色强度与还原糖浓度成正比，通过分光光度计在540nm波长处测量吸光度，可实现还原糖的定量分析实验步骤包括配制DNS试剂（含3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钠钾和氢氧化钠）；准备标准还原糖（通常为葡萄糖）系列稀释液；将1mL样品或标准溶液与1mL DNS试剂混合；在沸水浴中加热5-15分钟；加入8mL蒸馏水稀释后冷却至室温；在540nm波长测定吸光度；根据标准曲线计算样品中的还原糖含量DNS法具有操作简便、灵敏度高（

0.01-2mg/mL线性范围）的优点，广泛应用于食品工业、酶学研究和生物技术领域，特别适用于淀粉酶、纤维素酶等活性测定脂类实验1样品准备将生物样品（如植物组织、动物组织）研磨成细粉，称取适量样品于锥形瓶中对于动植物组织，通常需要先进行干燥处理，可采用冷冻干燥或低温烘干法样品粉碎越细，提取效率越高动物组织中脂肪含量较高，可直接提取；植物组织中脂肪含量较低，需要较大量样品溶剂提取加入适量有机溶剂（常用氯仿-甲醇混合溶剂，体积比2:1）充分混合后静置或使用索氏提取器进行连续提取溶剂体积通常为样品重量的20倍提取时间根据样品性质决定，通常需要3-24小时为提高提取效率，可在室温下振荡或超声处理对于复杂样品，可重复提取2-3次相分离加入

0.9%氯化钠溶液形成两相系统，静置分层下层为含脂类的有机相，上层为含非脂溶性物质的水相小心移取下层有机相，避免带入上层水相为确保完全分离，可在分液漏斗中进行操作，或使用离心法加速分层收集有机相于干净容器中后处理有机相用无水硫酸钠脱水，然后在氮气或真空条件下蒸发溶剂，得到粗脂提取物可用旋转蒸发仪控制温度在40°C以下进行溶剂蒸发，避免脂类氧化获得的脂类提取物可进一步纯化或直接用于分析提取物应储存在-20°C冰箱中，避光并充入氮气以防氧化脂类实验2样品点样展开分离检测显色使用毛细管或微量进样器将脂类样品点于硅胶板起始将点样完成的薄层板放入预先平衡好的色谱槽中，色展开完成后取出色谱板，标记溶剂前沿，在通风橱中线上，点样量通常为5-20μL点样应集中形成小点，谱槽内含适量展开剂（如石油醚-乙醚-冰醋酸，晾干使用特定显色剂如碘蒸气、10%硫酸、茚三酮直径不超过3mm样品间距离至少1cm，边缘距离80:20:1）确保展开剂液面低于样品点，色谱板垂或荧光染料喷洒色谱板根据显色剂不同，可能需要至少

1.5cm点样后在室温下干燥，或用冷风吹干直放置盖紧色谱槽，保持密闭环境根据分离需要加热显色（如喷洒硫酸后在110°C加热10分钟）不样品点位置可用铅笔轻轻标记，但不要划伤硅胶层，展开至适当高度（通常为板长的3/4）整个过程同脂类显示不同颜色，如中性脂显黄褐色，磷脂显蓝在通风橱中进行，避免有机溶剂挥发污染环境色立即标记各斑点位置，计算Rf值（斑点移动距离/溶剂前沿移动距离）薄层色谱（TLC）是分离和鉴定脂类混合物的有效方法，基于不同脂类在固定相（通常为硅胶）与移动相（有机溶剂系统）之间分配系数的差异脂类分子根据极性大小在色谱板上移动不同距离，实现分离TLC技术操作简便，成本低，可同时分析多个样品，适合于教学实验和初步分析通过比较未知样品与已知标准品的Rf值，可初步鉴定脂类成分核酸实验1裂解与去除蛋白质核酸沉淀与纯化质量检测与定量将组织或细胞样品在裂解缓冲液（含有向水相中加入等体积异丙醇或2-

2.5倍体使用分光光度计测量DNA溶液在260nmSDS、EDTA和蛋白酶K）中充分匀浆，积冰冷无水乙醇，轻轻混合，DNA形成和280nm波长处的吸光度纯净DNA的以破坏细胞结构并释放核酸在55-65°C可见的絮状沉淀在-20°C静置30分钟或A₂₆₀/A₂₈₀比值应在

1.8-

2.0之间温育1-3小时，使蛋白酶K充分消化蛋白更长时间，增加沉淀效率高速离心（A₂₆₀=1相当于约50μg/mL双链DNA质加入酚-氯仿混合液（体积比1:1），≥12,000×g）10-15分钟收集DNA沉淀通过琼脂糖凝胶电泳检查DNA的完整性充分混合形成乳状液，然后离心分离弃去上清液，用70%乙醇洗涤DNA沉淀2和纯度，完整的基因组DNA应在凝胶顶蛋白质变性后进入有机相，而DNA保留次，以去除残留盐分再次离心，弃去部呈现单一明亮带，没有拖尾现象使在上层水相中小心吸取上层水相，避上清液，将DNA沉淀在室温或37°C干燥用荧光染料如PicoGreen结合定量PCR进免带入中间相的蛋白质和杂质5-10分钟（不要过度干燥）最后用适行更精确的DNA定量纯化的DNA样品量TE缓冲液（10mM Tris-HCl,1mM应分装后存储在-20°C或-80°C，避免反复EDTA,pH

8.0）或纯水溶解DNA冻融核酸实验21凝胶制备根据待分离DNA片段大小选择适当浓度的琼脂糖（通常

0.8-2%），大片段使用低浓度，小片段使用高浓度将琼脂糖粉末加入适量TAE或TBE缓冲液中，微波加热至完全溶解，溶液变为透明冷却至约60°C后，加入核酸染料（如溴化乙锭或SYBR Safe），充分混合后倒入带有梳子的凝胶盒中，室温凝固30-45分钟2样品准备与上样将DNA样品与上样缓冲液（含有甘油和追踪染料）混合，通常比例为5:1同时准备适当的DNA分子量标准品待凝胶完全凝固后，小心取出梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入足够的电泳缓冲液覆盖凝胶表面使用微量移液器将样品和标准品加入到凝胶孔中，避免气泡和样品溢出3电泳分离盖上电泳槽盖，连接电源，设定适当电压（通常80-120V）注意电极连接方向，DNA带负电荷，将从负极向正极移动电泳过程中可观察追踪染料的移动情况，估计电泳进度根据样品和凝胶大小，电泳时间通常为30-90分钟当追踪染料移动到适当位置时，关闭电源，取出凝胶4结果观察与分析将凝胶置于紫外透射仪上观察DNA条带（使用含溴化乙锭的凝胶）或蓝光透射仪上观察（使用含SYBRSafe的凝胶）拍照记录电泳结果根据DNA标准品，估算样品DNA片段的大小分析DNA条带的数量、强度和大小，评估DNA的完整性和纯度鲜明的条带表示DNA质量好，而模糊的条带或拖尾现象则表示DNA可能已降解或含有杂质核酸实验3样品编号A₂₆₀A₂₈₀A₂₆₀/A₂₈₀核酸浓度纯度判断μg/mL

10.

3520.

1921.

8317.6良好

20.

6350.

3241.

9631.8优秀

30.

4980.

3121.

6024.9蛋白质污染

40.

7230.

3522.

0536.2RNA污染

50.

2460.

1351.

8212.3良好紫外分光光度法是测定核酸浓度最常用的方法之一，基于核酸碱基在260nm波长处有特征吸收的原理纯DNA溶液在260nm处的吸光度（A₂₆₀）为

1.0时，相当于约50μg/mL双链DNA或40μg/mL单链DNA/RNA样品中核酸的纯度可通过A₂₆₀/A₂₈₀比值评估，因为蛋白质在280nm处有较强吸收对于纯DNA，此比值应在

1.8-

2.0之间；对于纯RNA，此比值应在

2.0-

2.2之间测定步骤包括使用石英比色皿（或低紫外吸收的塑料比色皿），先用溶剂建立基线；将适当稀释的核酸样品加入比色皿，测量260nm和280nm处的吸光度；记录数据并计算核酸浓度和纯度比值此外，测量230nm处的吸光度也有助于评估样品是否含有如EDTA、糖类或酚类等污染物理想情况下，A₂₆₀/A₂₃₀比值应大于

2.0当样品中同时存在DNA和RNA时，可使用特异性核酸酶处理，如用RNase去除RNA，然后再测定DNA浓度酶学实验1反应速率测定酶活性单位通过测量单位时间内底物消耗或产物生成的国际单位（U）定义为在规定条件下，每分量来确定酶的反应速率常用方法包括分光钟转化1微摩尔底物的酶量比活性定义为每光度法、荧光法、电化学法等反应初速率毫克蛋白质的酶活性单位数（U/mg），用于（v₀）是评价酶活性的重要参数，通常在反表示酶纯度酶活力的测定必须在酶的最适12应的前5-10%阶段测定，以确保底物浓度基pH、温度和离子强度下进行，以获得可比较本恒定的结果影响因素控制测定方法选择酶活性测定受多种因素影响，如pH、温度、根据酶催化反应的特性选择适当的测定方法底物浓度、辅因子含量等实验中必须严格43直接法测量底物消失或产物生成；偶联法控制这些条件，确保结果可靠和可重复对将目标反应与指示反应偶联方法选择考虑照实验必不可少，包括空白对照（无酶）和灵敏度、特异性、便捷性和经济性商业试阳性对照（已知活性的酶）样品制备过程剂盒提供标准化的测定方案，但自行设计的中应避免酶失活，如避免剧烈震荡、极端pH方法可能更适合特定研究需求和有机溶剂酶学实验2实验原理琥珀酸脱氢酶（SDH）是三羧酸循环中的关键酶，催化琥珀酸氧化为延胡索酸的反应在这一过程中，电子被转移给辅酶FAD，然后经过电子传递链最终传递给人工电子受体如二氯酚靛酚（DCPIP）DCPIP在氧化态呈蓝色，还原后变为无色因此，可通过测量DCPIP在600nm处吸光度的降低来监测SDH的活性实验步骤首先制备琥珀酸脱氢酶粗提物，通常从线粒体中提取在反应体系中依次加入磷酸缓冲液（pH

7.4）、DCPIP溶液、琥珀酸钠溶液和酶提取液快速混匀后，在600nm波长处连续监测20分钟的吸光度变化同时设置无底物和无酶的对照组根据DCPIP的消光系数（ε=21,000M⁻¹·cm⁻¹），计算酶活性数据分析绘制吸光度随时间变化的曲线，从线性区域计算斜率（ΔA/min）根据公式酶活性=ΔA/min×稀释倍数/ε×d×V酶，其中d为光程长度（通常为1cm），V酶为加入的酶液体积将酶活性除以蛋白浓度，得到比活力（U/mg）比较不同处理组或不同来源酶的活性差异，分析影响因素注意事项酶提取过程需在4°C进行，避免酶失活琥珀酸脱氢酶对氧敏感，实验过程尽量避免长时间暴露在空气中DCPIP对光敏感，溶液应避光保存反应体系的pH和温度必须严格控制，因为它们显著影响酶活性测定前应确定最佳底物浓度和酶量，确保反应在线性区间内对于抑制剂研究，通常使用丙二酸等结构类似物作为SDH的特异性抑制剂酶学实验3时间秒氧气浓度mmol/L过氧化氢酶（catalase）是一种广泛存在于需氧生物体内的重要保护酶，能催化有毒的过氧化氢（H₂O₂）分解为水和氧气2H₂O₂→2H₂O+O₂这一反应对于清除细胞内产生的活性氧，防止氧化损伤具有重要意义过氧化氢酶活性测定的基本原理是测量反应过程中氧气的释放或过氧化氢的消耗速率常用的测定方法包括气体测定法（如上图所示，利用氧电极测量释放的氧气）；分光光度法（测量240nm波长处H₂O₂的吸光度降低）；高锰酸钾滴定法（通过残余H₂O₂与KMnO₄反应的程度间接测定）酶活性单位定义为在25°C、pH

7.0条件下，每分钟分解1μmol H₂O₂的酶量影响过氧化氢酶活性的因素包括pH（最适pH约为

7.0）、温度（通常在20-45°C范围内活性最高）、抑制剂（如叠氮化钠和氰化物）以及激活剂（如某些金属离子）在实验设计中应充分考虑这些因素，确保测定结果准确可靠酶学实验4米氏常数（Km）是酶动力学中的重要参数，定义为使酶反应达到最大速率一半时的底物浓度Km值反映了酶与底物的亲和力，Km越小表示亲和力越高测定Km的经典方法是通过测量不同底物浓度下的初速率，然后使用Lineweaver-Burk双倒数作图法或其他数据处理方法进行计算实验步骤通常包括准备一系列不同浓度的底物溶液；在各底物浓度下测定酶反应的初速率；绘制反应速率与底物浓度的关系曲线（如上图所示）；将数据转换为双倒数形式（1/v对1/[S]）并绘图；从直线的斜率和截距计算Km和Vmax在实验设计中，底物浓度范围应覆盖

0.2Km至5Km，以获得可靠的结果影响Km测定准确性的因素包括反应条件（pH、温度、离子强度）、酶制剂纯度、底物纯度及稳定性、反应产物的抑制作用等通过比较不同条件下的Km值，可以研究环境因素、抑制剂或激活剂对酶催化特性的影响色谱技术1分配原理基本组成色谱参数色谱分离基于样品组分在固定相和移动色谱系统主要由固定相、移动相和检测评价色谱分离效果的主要参数包括保留相之间的分配差异不同物质由于物理系统组成固定相可以是固体吸附剂（时间（tR，组分从进样到被检测所需时化学性质（如极性、分子大小、电荷等如硅胶、活性炭）、液体涂覆在惰性载间）、保留因子（k，反映组分在两相）的不同，在两相中的分配系数各异，体上（如气液色谱）或特殊功能基团连间的分配情况）、理论塔板数（N，反导致在色谱系统中的迁移速率不同，从接的基质（如离子交换、亲和色谱）映柱效率）、分离度（Rs，表示相邻两而实现分离分配系数K=固定相中物移动相可以是气体（气相色谱）或液体峰的分离程度）和拖尾因子（Tf，反映质浓度/移动相中物质浓度，K值越大（液相色谱）检测系统根据被测物质峰形对称性）理想的色谱分离应有足，物质在色谱柱中滞留时间越长特性选用不同检测器，如紫外、荧光、够的分离度（Rs≥

1.5）和对称的峰形（电化学或质谱检测器等Tf≈

1.0）常见类型根据分离机制和实验设计，色谱技术可分为多种类型吸附色谱（基于极性差异）、分配色谱（基于溶解度差异）、离子交换色谱（基于电荷差异）、分子筛色谱（基于分子大小差异）、亲和色谱（基于特异性结合）等每种类型都有其特定的应用范围和优势，选择适当的色谱类型对实验成功至关重要色谱技术2纸层析是一种简单而经典的色谱分离技术，广泛应用于生物化学实验教学中它利用特殊滤纸作为固定相载体，样品中的不同成分根据其在固定相（纸纤维上吸附的水）和移动相（有机溶剂系统）之间分配系数的差异而分离纸层析操作简便，成本低廉，适合于实验室初步分析和教学示范实验步骤包括选择合适的滤纸（通常为Whatman1号或3号）；在滤纸底端约2cm处轻轻画一铅笔起始线；使用毛细管或微量进样器在起始线上点样，样品点直径应控制在3-5mm；待样品点干燥后，将滤纸放入预先平衡好的色谱缸中，确保样品点位置高于溶剂液面；盖紧色谱缸，等待溶剂上升至适当高度（通常为滤纸长度的2/3）；取出滤纸，标记溶剂前沿，风干后使用适当显色剂（如茚三酮、紫外灯照射或碘蒸气）进行检测；计算各组分的Rf值（组分移动距离/溶剂前沿移动距离）进行定性分析纸层析最常用于分离氨基酸、糖类、有机酸和某些色素等小分子化合物色谱技术3薄层板选择根据分离对象选择适当的薄层色谱板常用的有硅胶板（适合大多数极性和中等极性化合物）、氧化铝板（适合碱性化合物）、纤维素板（类似纸层析，适合水溶性物质）和反相板（C18修饰的硅胶，适合非极性化合物）商品化的预制板使用方便，质量稳定；也可以自行制备薄层板，成本更低但均一性可能较差薄层厚度通常为

0.25-

0.5mm，影响分离容量和分辨率样品制备与点样样品应溶解在挥发性溶剂中，浓度适中（通常为1-10mg/mL）使用毛细管或微量进样器在距薄层板底部1-2cm处的起始线上点样点样应集中，直径不超过3mm，相邻样品间距至少1cm可多次点样增加样品量，但每次点样后应完全干燥对照品应与样品同时点于同一薄层板上，以便直接比较点样完成后，在室温下完全干燥展开与分离选择适当的展开剂系统，常用的有多种有机溶剂混合物，如石油醚-乙酸乙酯、氯仿-甲醇等展开前，将展开剂加入色谱缸中，缸内放置滤纸条增加饱和度，密闭平衡20-30分钟将点样完成的薄层板垂直放入色谱缸中，确保展开剂液面低于样品点待展开剂上升到适当高度（通常为板长的2/3-3/4），取出薄层板，立即标记溶剂前沿，在通风橱中干燥检测与分析根据被分离物质的性质选择适当的检测方法常用方法包括自发荧光或紫外灯照射；碘蒸气显色（适用于大多数有机物）；硫酸喷雾后加热炭化（通用法，敏感度高）；特异性显色剂（如茚三酮显示氨基酸，2,4-二硝基苯肼显示醛酮类）计算各斑点的Rf值（斑点中心到起始线的距离/溶剂前沿到起始线的距离），与对照品比较进行定性分析还可刮取斑点，用适当溶剂洗脱进行后续定量分析色谱技术4原理1凝胶过滤色谱（也称分子筛色谱或凝胶渗透色谱）是基于分子大小差异进行分离的技术凝胶颗粒含有大小均一的孔道，小分子可以自由进入孔内，而大分子则被排除在外，仅在颗粒之间柱填充的空隙中流动因此，大分子先流出色谱柱，小分子后流出，实现按分子量大小的分离不同2类型的凝胶材料有不同的分离范围，如Sephadex G-25适合分离分子量1,000-5,000的物质，而首先选择合适的凝胶材料并按说明书进行膨胀（通常需要在缓冲液中浸泡数小时至数天）将Sephadex G-100则适合分离分子量4,000-100,000的物质柱子垂直固定，加入少量缓冲液缓慢均匀地将凝胶悬浮液倒入柱中，避免气泡形成允许凝胶自然沉降，同时可轻轻敲打柱壁帮助排除气泡待凝胶完全沉降后，连接缓冲液贮液瓶，用数倍柱体积的缓冲液平衡色谱柱检查柱效，确保填充均匀无气泡和裂缝样品上样与洗脱3样品体积应不超过柱床体积的2-5%，以免影响分离效果小心将样品溶液加到凝胶表面，不要扰动凝胶床待样品完全进入凝胶床后，开始用缓冲液洗脱洗脱速度应控制在适当范围（通常为

0.2-1ml/min），过快会降低分辨率，过慢则造成样品扩散使用分数收集器或手动收集洗数据分析脱液，同时记录流速和收集时间现代系统通常配备在线检测器（如UV、荧光或折光检测器）4实时监测洗脱情况测定各组分的洗脱体积（Ve），计算分配系数Kav=Ve-V0/Vt-V0，其中V0为排阻体积（通常用蓝色葡聚糖测定），Vt为柱床总体积构建标准曲线（log分子量对Kav作图），可用于未知样品的分子量测定另外，通过分析各峰的面积可进行组分的相对定量凝胶过滤色谱的主要应用包括蛋白质的脱盐和缓冲液交换；大分子与小分子的快速分离；天然状态下的分子量测定；以及考察蛋白质的寡聚状态等电泳技术电泳基本原理电泳是利用带电分子在电场中移动速率差异进行分离的技术带电粒子在电场中的移动速度取决于其电荷与质量比、分子形状以及支持介质的阻力对于生物大分子，如蛋白质和核酸，其在特定pH下带有不同的净电荷，因此在电场作用下会以不同速率向相反电极移动，实现分离电泳支持介质常用的有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和纤维素膜等主要电泳类型常用的电泳技术包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE，适合分离蛋白质）；SDS-PAGE（在变性条件下按分子量分离蛋白质）；等电聚焦电泳（按等电点分离蛋白质）；脉冲场凝胶电泳（PFGE，分离大片段DNA）；毛细管电泳（高效、微量样品分析）；二维电泳（结合等电聚焦和SDS-PAGE，高分辨率分离复杂蛋白混合物）每种技术都有其特定的应用范围和优势，需根据研究目的选择合适的方法电泳后分析电泳完成后，需要通过染色或其他检测方法显示分离的组分蛋白质电泳常用考马斯亮蓝、银染色或特异性免疫染色；核酸电泳常用溴化乙锭、SYBR Green等荧光染料通过与标准品比较，可确定目标分子的大小、等电点或其他特性现代技术还包括电泳后的蛋白质印迹（Western blot）、质谱分析（MS）等，提供更详细的分子信息应用领域电泳技术在生物化学研究中应用广泛，包括蛋白质纯度评估；蛋白质分子量测定；蛋白质复合物分析；DNA/RNA纯度和完整性检查；DNA片段大小测定；PCR产物验证；基因组DNA指纹图谱分析；临床样本中特定生物标志物的检测等电泳已成为分子生物学、蛋白质组学、临床诊断等领域不可或缺的基础技术，对生物医学研究和疾病诊断具有重要价值。