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决明子提取物调控骨骼肌信号通路对糖LKB1-AMPK-GLUT4尿病大鼠胰岛素抵抗的影响靳思思I张一平I靳绵绵21•河南理工大学第一附属医院内分泌科二区，河南焦作454000；2•河南理工大学第一附属医院急诊科，河南焦作454000【摘要】目的观察决明子提取物调控骨骼肌LKB1-AMPK-GLUT4信号通路改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗的效果方法采用高脂饮食联合链胭佐菌素STZ建立2型糖尿病大鼠模型，选择健康大鼠10只为正常组，40只建模成功大鼠分为|模型组、高剂量决明子提取物组、中剂量决明子提取物组和低剂量决明子提取物组，高剂量决明子提取物组给予450mg/kg.dL中剂量决明子提取物组给予150mg/kgd和低剂量决明子提取物组给予50mg/kg・d」决明子提取物灌胃，连续治疗12周，正常组及模型组均给予等体积生理盐水灌胃12周后采用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹法检批注[A1]:决明子提取物高、中、低剂量组是哪组？对照组测大鼠腓肠肌LKB1-AMPK-GLUT4信号通路的肝脏激酶Bl LKB
1、腺甘酸活化蛋与正常组分组依据？是不是正常组、模型组；模型组中分对照组、决明子提取物高、中、低剂量组？答复:对，正常白激酶AMPK和葡萄糖转运蛋白-4大鼠设置为正常组，模型大鼠设为模型组、决明子提取物GLUT4|基因|及蛋白的相对表达量，采用高胰岛素.正糖钳夹试验HEC、胰岛高剂量组、决明子提取物中剂量组和决明子提取物低剂量组素耐量试验IPITT综合评价胰岛素抵抗水平检测大鼠雌肠肌骨骼肌组织中氧化批注[A2]:具体基因和蛋白答复已经补充应激指标的变化结果高剂量决明子提取物组大鼠体重
375.94±
4.02g、中剂量组批注[A3]:腓肠肌骨骼肌答复已经补充大鼠体重
348.43+
7.55g和低剂量组大鼠体重
332.57+
10.57g显著高于模型组
290.38±
8.04g P
0.05,高剂量决明子提取物组大鼠空腹血糖
5.37+
1.00mmol/L及空腹胰岛素FINS
23.03+
6.54ng/mK中剂量组大鼠空腹血糖
9.54±
2.05mmol/L及FINS
28.26±
2.96ng/ml和低剂量组大鼠
13.87±
1.96mmol/L及FINS
30.90±
8.31ng/ml显著低于模型组空腹血糖
23.48+
5.58mmol/L及FINS
35.11+
5.02ng/mlP
0.05高剂量决明子提取物组大鼠葡萄糖输注率GIR
28.35±
0.
78、中剂量组大基金项目河南省医学科技攻关计划联合共建项目LHGJ作者简介靳思思1988-07,女,硕士研究生，主治医师，主要从事糖尿病治疗研究，联系电话，E-mail产值
0.
0000.
0000.000注与正常组比较，*P
0.05；与模型组比较，#P
0.05Note:Compared withthe normal group,*P
0.05;Compared withthe model group,#P
0.
05.
2.2各组大鼠GIR水平比较与正常组比较，模型组大鼠GIR水平显著降低，差异具有统计学意义（p
0.05）o与模型组比较，决明子各给药组GIR水平显著增加，，差异具有统计学意义（P
0.05）,且各给药组间比较呈剂量依赖性见表2表2各组大鼠GIR水平比较元±sTable2GIR levels in each group of ratsx±s组别n GIR正常组
931.88±
2.79模型组
812.34+
3.22*高剂量决明子提取物组
928.35±
0.78#中剂量决明子提取物组
924.59+
1.85#低剂量决明子提取物组
921.85±
1.64#产值
95.928P值
0.000注与正常组比较,*P
0.05；与模型组比较,#P
0.05Note:Compared withthe normalgroup,*P
0.05;Compared withthe model group,#P
0.05各组大鼠胰岛素耐量水平比较与正常组比较，模型组大鼠各时点的血糖均显著
2.3增加，AUC显著增加，差异具有统计学意义（P
0.05）与模型组比较，决明子各给药组大鼠各时点的血糖均显著降低，曲线下面积AUC显著降低，差异具有统计学意义（PV
0.05）,见表3表3各组大鼠胰岛素耐量水平（了±s）Table3Insulin tolerancelevels of rats in each group（x±5）组别n Omin30m in60m in120min AUC正常组
95.63±
0.
503.43±
0.
272.93±
0.
233.29±
0.
4110.28±
0.92模型组
813.97+
3.21*
11.51+
5.49*
8.17+
1.15*
9.28+
1.97*
31.35+
4.42*高剂量决明子提取物组
95.38±
0.98#
3.62±
0.49#
3.47±
0.97#
3.15±
0.24#
10.46±
1.02#中剂量决明子提取物组
95.60+
1.64#
4.14±
1.63#
4.07±
0.86#
3.64±
0.73#
16.55±
2.40#低剂量决明子提取物组
95.27+
1.25#
5.03±
0.58#
4.19±
0.51#
3.81+
0.25*
21.26±
4.25#产值
35.
84715.
49854.
74664.
33175.568值O.OX.
000.O.OX O.X注与正常组比较，*P
0.05；与模型组比较，#P
0.05Note:Compared withthe normalgroup,*P
0.05;Compared withthe model group,#P
0.
052.4各组大鼠骨骼肌氧化应激相关指标的变化与正常组比较，模型组大鼠GSH及SOD水平显著降低，ROS及MDA水平显著增加，差异具有统计学意义（尸
0.05）与模型组比较，决明子各给药组大鼠GSH及SOD水平显著升高，ROS及MDA水平显著降低，差异具有统计学意义（PO.05）,见表4表4各组大鼠骨骼肌氧化应激相关指标±±sTable4Indicators relatedto oxidative stress in skeletal muscles of rats in eachgroup x±s组别n GSHmg/L SODU/L ROSU/mL MDAnmol/mL正常组
932.27+
4.
3846.58±
4.
6571.52±
5.
741.72±
0.47模型组
86.06+
0.71*
7.97+
1.11*
130.10+
4.79*
7.13+
2.04*高剂量决明子提取物组
923.92±
3.03#
33.68±
5.08#
94.80±
11.85#
2.09±
0.91#中剂量决明子提取物组9I
3.84±
3.61#
23.55+
4.10#
103.82+
7.88*
3.86±
0.65#低剂量决明子提取物组
911.47±
2.30#
15.85±
3.33#
118.07±
6.63#
4.27±
0.52#F值
98.
853119.
31770.
94735.454P值..X O.X
0.00注与正常组比较，*P
0.05；与模型组比较，#P
0.05Note:Compared withthe normalgroup,*P
0.05;Compared withthe modelgroup,#P
0.
05.
2.5各组大鼠骨骼肌LKBLAMPK・GLUT4信号通路相关蛋白的表达与正常组比较，模型组大鼠P-LKB
1、P-AMPKal2P-AMPKa2GLUT4蛋白的表达水平均显著降低，差异具有统计学意义（PV
0.05）与模型组比较，决明子各给药组大鼠P-LKB
1、P-AMPKal2P-AMPKa
2、GLUT4蛋白的表达水平均显著升高，差异具有统计学意义（P
0.05），见表5和图1表5各组大鼠骨骼肌LKBLAMPK-GLUT4信号通路相关蛋白的表达（元±5）Table5Expression of LKB1-AMPK GLUT4signaling pathwayrelated proteinsin skeletal muscle ofrats ineachgroupX±S组另IJ n P-LKB1P-AMPKa12P-AMPKa2GLUT4正常组
933.22+
6.
1129.39±
6.
0223.84±
5.
5941.07±
5.52模型组
820.08+
4.93*
18.35土
3.74*
15.50+
5.47*
27.33+
3.51*高剂量决明子提取物组
935.26±
5.33*
28.76±
4.82#
40.66+
4.81#
55.66±
6.1中剂量决明子提取物组
928.55±
10.27#
23.87±
5.01#
32.06±
8.03#
46.42土
5.42#低剂量决明子提取物组
922.78+
5.07*
19.95土
2.44#
28.25±
3.70#
33.04土
4.08#产值
8.
19611.
50922.
97241.676值
0.
0000.
0000.
0000.000注与正常组比较,*P
0.05；与模型组比较，#PvO.O50Note:Compared withthe normalgroup,*P
0.05;Compared withthe modelgroup,#P
0.05A:正常组B:模型组C:高剂量决明子提取物组D:中剂量决明子提取物组E:低剂量决明子提取物组A:normalgroupB:modelgroupC:high-dose group of Cassia seed D:medium dosegroup ofCassia seedE:low dosegroup ofCassiaseed图1各组大鼠骨骼肌LKB1-AMPK-GLUT4信号通路相关蛋白的表达Fig.l Expressionof LKB1-AMPK GLUT4signaling pathwayrelated proteinsin skeletalmusclesofratsineachgroup各组大鼠骨骼肌信号通路相关基因的表达与正常组比
2.6LKB1-AMPK-GLUT4较，模型组大鼠P-LKB
1、P-AMPKal2P-AMPKa
2、GLUT4mRNA的表达水平均显著降低，，差异具有统计学意义P
0.05o与模型组比较，决明子各给药组大鼠P-LKB1P-AMPKal
2、P-AMPKa
2、GLUT4mRNA的表达水平均显著升高，差异具有统计学意义P
0.05,见表6表6各组大鼠骨骼肌LKB1・AMPK・GLUT4信号通路相关基因的表达X±STable6Genes ofLKB1-AMPK GLUT4signaling pathwayin skeletal musclesofratsineachgroup x±5组别nP-LKB1P-AMPKal2P-AMPKa2GLUT4正常组
943.22+
6.
5131.04+
4.
0023.92+
1.
7718.00+
2.21模型组
826.40+
4.64*
18.66±
3.79*
15.46土
2.22*
14.25+
2.66*高剂量决明子提取物组
940.
34.±
8.38#
32.74+
7.61#
41.87+
2.19*
37.98+
2.51#中剂量决明子提取物组
938.
02.±
5.26#
29.87±
4.10#
35.24土
3.16#
28.96±
2.64#低剂量决明子提取物组
928.35±
2.32*
25.42+
4.51#
28.85±
3.85#
23.96±
3.88#F值
14.
26212.
565116.
218113.093P值
0.
0000.
0000.
0000.000注与正常组比较,注
0.05；与模型组比较,#P
0.05Note:Compared withthe normalgroup,*P
0.05;Compared withthe modelgroup,#P
0.05讨论3胰岛素抵抗是2型糖尿病发病过程中的重要病理生理基础，其中，胰岛素刺激葡萄糖摄取的发生场所主要是在骨骼肌，因此，骨骼肌是导致外周组织发生胰岛素抵抗的关键部位[⑵腺苜酸活化蛋白激酶AMPK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员之一，在正常机体中，其上游的肿瘤抑制因子-1LKB1磷酸化被激活后，可磷酸化AMPKa亚基上的Thrl72位点而激活AMPK,促进葡萄糖转运蛋白-4GLUT4对葡萄糖的转运过程，促进骨骼肌葡萄糖的摄取、转运和利用等过程，改善患者的胰岛素抵抗水平，同时还可促进血液中甘油三酯、游离脂肪酸的代谢，调节调节骨骼肌对葡萄糖的摄取和利用【⑶有研究显示口4],2型糖尿病患者体内骨骼肌LKB1-AMPK-GLUT4信号级联通路发生表达的抑制,降低骨骼肌糖原的转输效率，造成胰岛素敏感性降低、血液中葡萄糖清除率减少和血糖升高因此，LKB1-AMPK-GLUT4信号通路是糖尿病代谢途径的重耍信号通路本研究结果显示，与正常大鼠相比，糖尿病大鼠体重显著降低，空腹血糖及FINS水平显著增高，GIR水平显著降低，曲线下面积AUC显著增加，与王秋燕[⑸研究相符，提示2型糖尿病大鼠由于链版佐菌素诱导出现了胰岛素抵抗此外，本研结果显示，模型组大鼠P-LKBl、P-AMPKal
2、P-AMPKa
2、GLUT4mRNA和蛋白的表达水平，提示在糖尿病的病理状态下LKB1-AMPK-GLUT4信号级联通路受到显著的抑制，可能参与了糖尿病的发生经过决明子提取物干预后，糖尿病大鼠空腹血糖、FINS及GIR水平均显著得到改善，而P-LKB
1.P-AMPKal
2、P-AMPKa
2、GLUT4mRNA和蛋白也相应呈现降低趋势，表明通过调控大鼠骨骼肌LKBI-AMPK-GLUT4信号通路表达，能显著改善其胰岛素抵抗水平文献显示，氧化应激损伤也伴随着2型糖尿病的整个发展过程口叫血糖和脂肪酸水平的升高可机体产生大量的ROS和MD0⑺，增加骨骼肌对胰岛素的抵抗性，造成B细胞功能的衰退，增加大鼠骨骼肌葡萄糖的耐受量，诱发或恶化2型糖尿病患者的病情其中，GSH、SOD在细胞氧化反应中发挥重要的还原剂的作用，能促进过氧化代谢产物的清除，减缓脂质过氧化反应的发生网本研究显示，糖尿病大鼠骨骼肌GSH、SOD水平均显著降低，ROS及MDA水平显著增加，说明糖尿病大鼠骨骼肌氧化应激可能受到胰岛素抵抗增加和LKB1-AMPK-GLUT4信号级联通路下降的影响，表现出显著下降的状态，而接受经决明子提取物治疗后，糖尿病大鼠骨骼肌GSH、SOD水平呈现上升趋势，而ROS及MDA水平则呈现下降趋势，结合糖尿病大鼠骨骼肌在决明子干预下LKB1-AMPK-GLUT4信号通路变化趋势，提示决明子提取物显著降低2型糖尿病大鼠的高血糖状态及胰岛素抵抗可能由于决明子提取物能够显著降低糖尿病大鼠骨骼肌2型糖尿病大鼠骨骼肌LKB1-AMPK-GLUT4信号通路的损伤，修复其骨骼肌氧化应激水平，从而提高其胰岛素的敏感性本研究结果显示，糖尿病大鼠接受决明子提取物越高，其骨骼肌胰岛素抵抗改善效果越明显说明决明子治疗糖尿病患者胰岛素抵抗可能受到用药剂量的影响综上所述，决明子提取物能显著修复骨骼肌LKB1-AMPK-GLUT4信号通路的损伤，减轻机体血液氧化应激损伤状态，改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗然而本研究未对LKB1-AMPK-GLUT4信号通路与糖尿大鼠器官如晶状体、海马体和心肌等氧化应激损伤是否存在相关性进行分析，应在下一步进行更深入的研究，以完善结论参考文献
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33.鼠GIR
24.59±
1.
85、低剂量组大鼠GIR
21.85+
1.64显著高于模型组GIR
12.34+
3.22P
0.05各决明子剂量大鼠Omin胰岛素耐量
5.38±
0.
98、
5.60±
1.
64、
5.27±
1.25,030min胰岛素耐量
3.62±
0.
49、
4.14+
1.
635.03+
0.58,60min胰岛素耐量
3.47+
0.
97、
4.07±
0.
86、
4.19+
0.51和120min胰岛素耐量
3.15+
0.
243.64+
0.
733.81+
0.25显著低于模型组Omin胰岛素耐量
13.97±
3.
21、30min胰岛素耐量
11.51±
5.4960min胰岛素耐量
8.17+
1.15和120min胰岛素耐量
9.28+
1.97P
0.05,高剂量决明子提取物组、中剂量组、低剂量组大鼠曲线下面积AUC
10.46±
1.
0216.55±
2.
40、
21.26±
4.25显著低于模型组
35.11±
5.02P
0.05高剂量决明子提取物组大鼠谷胱甘肽GSH
23.92±
3.03mg/L和超氧化物歧化酶SOD
33.68+
5.08U/L、中剂量决明子提取物组大鼠GSH
13.84±
3.61mg/L和SOD
15.85±
3.33U/L、低剂量决明子提取物组大鼠GSH
1.47±
2.30mg/L和SOD
15.85+
3.33U/L显著高于模型组GSH
6.06+
0.71mg/L和SOD
7.97±
1.11U/LP
0.05,高剂量决明子提取物组大鼠活性氧ROS
94.80+
11.85U/mL及丙二醛MDA
2.09±
0.91nmol/mL、中剂量决明子提取物组大鼠ROS
103.82+
7.88U/mL及MDA
3.86+
0.65nmol/mL、低齐ij量决明子提取物组大鼠ROS
118.07±
6.63U/mL及MDA
4.27±
0.52nmol/mL显著低于模型组ROS
130.10+
4.79U/mL及MDA
7.13±
2.04nmol/mLP
0.05o高剂量决明子提取物组大鼠P-LKB1蛋白
35.26±
5.33和mRNA
40.34+
8.38P-AMPKal2蛋白
28.76±
4.82和mRNA
32.74±
7.
61、P-AMPKa2蛋白
40.66+
4.81和mRNA
41.87+
2.
19、GLUT4蛋白
55.66±
6.11和mRNA
37.98±
2.51,中剂量组大鼠P-LKB1蛋白
28.55±
10.27和mRNA
38.02+
5.
26、P-AMPKal2蛋白
23.87+
5.01和mRNA
29.87±
4.
10、P-AMPKa2蛋白
32.06+
8.03和mRNA
35.24+
3.
16、GLUT4蛋白
46.42±
5.42和mRNA
28.96±
2.64,低剂量组大鼠P-LKB1蛋白
22.78±
5.07和mRNA
28.35±
2.
32、P-AMPKal2蛋白
19.95+
2.44和mRNA
25.42+
4.
51、P-AMPKa2蛋白
28.25+
3.70和mRNA
28.85+
3.
85、GLUT4蛋白
33.04+
4.08和mRNA
23.96+
3.88均显著高于模型组大鼠P-LKB1蛋白
20.08±
4.93及mRNA
26.40+
4.64P-AMPKal2蛋白
18.35±
3.74及mRNA
18.66±
3.
79、P-AMPKa2蛋白
15.50±
5.47及mRNA
15.46±
2.22和GLUT4蛋白
27.33±
3.51及mRNA
14.25±
2.66PV
0.05结论决明子提取物能调控糖尿病大鼠骨骼肌LKB1-AMPK-GLUT4信号通路，修复其骨骼肌氧化应激损伤，改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗【关键词】决明子提取物；糖尿病；骨骼肌；胰岛素抵抗中图分类号S
859.79+3Effects ofcassia seed extract oninsulin resistancein diabetes rats byregulatingLKB1-AMPK-GLUT4signaling pathwayinskeletalS©,ZHANG Yiping!JINMian-mian
2.].The2nd Departmentof Endocrinology,First AffiliatedHospital of HenanUniversity ofTechnology,Jiaozuo,454000,Henan,China;
2.Emergency Department,FirstAffiliated HospitalofHenanUniversityofTechnology,J iaozuo.454000,Henan,China[Abstract]Objective Toobserve theeffectofcassia seed extractonimproving insulinresistancein diabetesrats byregulating LKB1-AMPK-GLUT4signaling pathwayinskeletal dsA ratmodel oftype2diabetes wasestablished byhigh-fat dietcombined withstreptozotocinSTZ.IO healthyrats wereselected asthe normalgroup,and40successfully modeledrats weredivided intomodelgroup,high-dose cassia seed extractgroup,medium dose cassiaseed extract group,and low-dose cassiaseed extract group.Thehigh-dose cassiaseed extract group was given450mg/kg d\the medium dose cassiaseedextract groupwasgiven150mg/kg d-1,and the low-dose cassiaseed extractgroup wasgiven50mg/kg d-|cassiaseed extract bygavage for12weeks ofcontinuous treatment,Boththe normalgroup andthe modelgroup weregiven equal volume ofphysiological salinebythe normalgroup andthe modelgroup weregiven anequalvolumeof normalsaline.After12weeks,real-time quantitativePCR andWestern blottingwere used to detectthe relativeexpressionofLKB1-AMPK-GLUT4signaling pathway-related genesand proteinsin ratgastrocnemiusmusclebone muscle.High insulin-negative glucoseclamp testand insulintolerance test wereusedtocomprehensively evaluateinsulin resistancelevels.The changesofoxidative stressindicators inrat skeletalmuscle tissueswere tsBody weight with
375.94±
4.02g of high-dose cassiaseed extractgroup,body weight with
348.43±
7.55gof medium-dose cassiaseed extractgroup,and bodyweightwith
332.57±
10.57g oflow-dose cassiaseed extractgroup weresignificantly higherthan bodyweightwith
290.38±
8.04g of model groupP
0.05,fasting blood glucose with
5.37+
1.00mmol/L andfastinginsulin FINS with
23.03±
6.54ng/ml ofhigh-dose cassiaseed extractgroup,fasting blood glucose with
9.54±
2.05mmol/L and FINS with
28.26±
2.96ng/mlof medium-dose cassiaseed extractgroup,fasti ngbloodglucosewith
13.87±
1.96mmol/Land FINSwith
30.90±
8.31ng/ml of low-dose cassiaseed extractgroup weresignificantlylower thanbloodglucosewith
23.48+
5.58mmol/L andFINSwith
35.11+
5.02of modelgroupP
0.
05.The glucoseinfusion rateGIR with
28.35±
0.78ofhigh-dose cassiaseedextract grouprats,GIR with
24.59±
1.85of medium-dose cassiaseed extractgroup,andGIR with
21.85±
1.64of low-dose cassiaseed extractgroup weresignificantly higherthanGIR with
12.34+
3.22ofmodelgroup P
0.
05.The insulin tolerance with
5.38±
0.98,
5.60±
1.64,
5.27+
1.25at0min,
3.62+
0.49,
4.14+
1.63,
5.03±
0.58at30min,
3.47±
0.97,
4.07+
0.86,
4.19±
0.51at60min,and
3.15+
0.24,
3.64±
0.73,and
3.81±
0.25at120min ofhigh-dose cassiaseed extractgroup,medium-dose cassiaseed extractgroup,and low-dose cassiaseed extractgroup weresignificantly lowerthan insulintolerance with
13.97±
3.21at0minute,insulintolerance with
11.51±
5.49at30minute,insulintolerance with
8.17±
1.15at60minute,and insulintolerancewith
9.28±
1.97at120minute of the modelgroup P
0.05,the areaunder thecurve AUC with
10.46±
1.02ofhigh-dose cassiaseed extractgroup,
16.55±
2.40of medium-dose cassiaseed extractgroup,and
21.26±
4.25oflow-dose cassiaseed extractgroup weresignificantly lowerthanAUCwith
35.11±
5.02of themodelgroupP
0.
05.The GlutathioneGSH with
23.92+
3.03mg/L andsuperoxide dismutaseSOD with
33.68±
5.08U/L ofhigh-dosecassia seedextractgroup,the GSHwith
13.84±
3.61mg/L andSOD with
15.85±
3.33U/L ofmedium-dose cassiaseedextractgroup,andGSHwith
1.47±
2.30mg/L andSODwith
15.85±
3.33U/L oflow-dose cassiaseedextractgroup weresignificantly higherthanGSH with
6.06±
0.71mg/L andSODwith
7.97±
1.11U/L ofmodelgroupP
0.05,reactive oxygenspecies ROS with
94.80+
11.85U/mL andmalondialdehydeMDA with
2.09±
0.91nmol/mL of the high-dose cassiaseed extractgroup,ROS with
103.82±
7.88U/mL andMDA with
3.86±
0.65nmol/mL ofthemiddle-dose cassiaseedextractgroup,and ROSwith
118.07+
6.63U/mL andMDA with
4.27+
0.52nmol/mL ofthelow-dose cassiaseedextractgroup weresignificantly lowerthanROSwith
130.10±
4.79U/mL andMDA with
7.13土
2.04nmol/mL ofmodelgroup P
0.
05.The levelsof P-LKB1protein with
35.26±
5.33and mRNAwith
40.34±
8.38,P-AMPKal2protein with
28.76±
4.82and mRNAwith
32.74±
7.61,P-AMPKa2protein with
40.66±
4.81and mRNAwith
41.87±
2.19,GLUT4protein with
55.66±
6.11and mRNAwith
37.98±
2.51ofthehigh-dosecassiaseedextractgrouprats,P-LKB1protein with
28.55+
10.27and mRNAwith
38.02±
5.26,P-AMPKal2protein with
23.87+
5.01and mRNAwith
29.87±
4.10,P-AMPKa2protein with
32.06+
8.03and mRNAwith
35.24+
3.16,GLUT4protein with
46.42±
5.42and mRNAw汕
28.96±
2.64ofthemediumdosegroupofrats,P-LKB1with protein
22.78±
5.07and mRNAwith
28.35±
2.32,P-AMPKa12protein with
19.95±
2.44and mRNAwith
25.42±
4.51,P-AMPKa2protein with
28.25±
3.70and mRNAwith
28.85±
3.85,GLUT4protein with
33.04±
4.08and mRNAwith
23.96±
3.88ofthelow-dose cassiaseedextractgrouprats weresignificantly higherthan levelsof P-LKB1protein with
20.08±
4.93and mRNAwith
26.40±
4.64,P-AMPKal2protein with
18.35+
3.74andmRNA with
18.66±
3.79,P-AMPKa2protein with
15.50±
5.47and mRNAwith
15.46+
2.22,GLUT4protein with
27.33+
3.51and mRNAwith
14.25±
2.66of themodelgroupP
0.
05.Conclusion Cassia extract canregulate theLKB1-AMPK-GLUT4signaling pathwayof skeletalmusclein diabetesrats,repair theoxidativestressinjury ofskeletalmuscle,and improveinsulin resistanceindiabetesrat.[Key words]Cassiaextract;diabetes;skeletalmuscle;insulinresistance近年来，随着人们生活水平的不断提高，全球成年人糖尿病的患病人数已到达了
2.85亿人，且仍在不断增高据报道，我国20岁以上人群糖尿病的患病率已达
9.7%,总患病人数已超过了9000万，2型糖尿病已成为威胁我国人民健康的最常见的代谢性内分泌疾病⑴研究发现2叫外周组织中胰岛素抵抗Insulinresistance,IR在2型糖尿病的发生发展中发挥关键作用，主要表现为肌肉、肝脏、脂肪组织对葡萄糖的利用障碍，为了弥补降糖效应的缺陷，胰岛B细胞需要代偿性地增加胰岛素的分泌，但随着病情的进展，胰岛B细胞的功能逐渐丧失，最终诱发糖耐量异常，2型糖尿病的发生因此，如何缓解胰岛素抵抗状态成为治疗2型糖尿病的研究热点研究显示⑷，骨骼肌组织是导致外周IR发生的重要靶点，2型糖尿病患者存在骨骼肌IR,降低葡萄糖的转运和摄取，直接导致了血糖的升高肝脏激酶Bl Liverkinase Bl,LKB1-腺甘酸活化蛋白激酶Amp-activated proteinkinase,AMPK和葡萄糖转运蛋白-4glucose transporter4,GLUT4信号通路是促进骨骼肌葡萄糖的摄取、转运和利用的重要信号通路⑸研究发现⑹，在糖尿病患者骨骼肌批注[A4]:第一次出现，应显示其中文答复己经补充OLKBLAMPK-GLUT4信号通路可发生异常的表达，最终导致胰岛素敏感性降低，血糖升高因此，通过调节LKBLAMPK-GLUT4信号通路的活性可能成为减少胰岛素抵抗、治疗糖尿病患者的新的思路决明子是一种常见的传统中草药，具有清肝明目、祛风散热、及润肠通便的功效，现代药理研究表明，决明子具有显著的降脂、降压、抑制脂质的氧化过程等药理作用⑺研究显示网，决明子提取物可有效减轻糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤损伤，其机制可能与其降脂并激活蛋白激酸B proteinkinase B,PKB及细胞外调节蛋白激酶1/2extracellular regulatedproteinkinases1/2,ERK1/2信号活性有关但其对骨骼肌胰岛素抵抗是否具有改善作用尚未见报道本研究观察了决明子提取物对2型糖尿病大鼠的降糖作用及对骨骼肌胰岛素抵抗的改善作用现报道如下材料与方法
11.1实验动物SPF级SD雄性大鼠50只，6周龄，体重180-200g,购于华中科技大学动物实验中心合格证号SCXKC鄂2015-0018所有大鼠均在温度22±5℃,湿度50±10%,明暗交替的动物房中进行分笼饲养，大鼠自由饮食水，适应性喂养1周实验试剂决明子中药饮片由吉林德济药业有限责任公司许可证号吉提供，L2链胭佐菌素STZ CAS号:18883-66-
4、兔抗P-LKB1抗体CAS号:PA5-
14072、兔抗P・AMPKal2抗体CAS号:SC-
101630、兔抗AMPKa2抗体（CAS号:ABS-117828）、兔抗P-AMPKa2抗体（CAS号:P54646）、兔抗GLUT4抗体（CAS号:70R-GR014）、兔抗GAPDH抗体（CAS号:C1846-50）和蛋白酶/磷酸酶抑制剂（CAS号PM11595）均由美国Sigma公司提供，ECL发光试剂盒（CAS号CB）由北京中山生物科技有限公司提供,TaKaRaRNA PCR试剂盒（CAS号CB）由大连宝生物工程有限公司提供，骨骼肌糖原测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供（CAS号BH-02X9743）,胰岛素试剂盒（CAS号EIA-2935）由大连碧云天生物技术研究所提供方法
22.1动物模型的建立及分组随机抽取10只健康大鼠作为正常组，给予普通饲料喂养，其余40只大鼠参照文献［9］方法进行2型糖尿病大鼠模型的制备，大鼠均给予高脂高糖饲料（脂肪41%、蛋白17%、碳水化合物42%）喂养8周，8周后禁食12h,给予35mg/kg的链脉佐菌素（Streptozocin,STZ）一次性腹腔注射，并于注射卜2h后［⑼进行尾静脉采血检测大鼠的空腹血糖，若空腹血糖三
16.7mmol/L提示2型批注［A5］:诱导时间确定是否有依据？在四周内连续检测糖尿病大鼠模型制备成功将40只成功造模的大鼠随机分为模型组、高剂量决明血糖答复诱导时间根据文献1（）,是给药72h后检测一次血糖子提取物组、中剂量决明子提取物组和低剂量决明子提取物组建模成功后，各组大鼠继续普通饲料喂养4周给药方法
2.2给药前先制备决明子提取物，方法为取500g决明子中药饮片粉碎后添加10倍量60%乙醇放置2h后，在60℃水浴回流2h过滤后残渣加入5倍量60%乙醇并水浴回流2h,合并滤液后用旋转蒸发仪回收溶剂，获得提取物62g用于本实验高、中、低剂量决明子提取物组大鼠参考文献［⑴分别给予
450、
150、SOmg/kg.d1,灌胃，每日1次,正常组吸模型组均给予等体积生理盐水灌胃，各组大鼠均连续给药批注［A6］:正常组和模型组中的对照组答正常组为正常大鼠，模型组为未接受药物干预的模型大鼠12周
2.3体重、空腹血糖和空腹胰岛素（fastinginsulin,FINS）水平的检测正常组及模型组大鼠给予等体积生理盐水灌胃和高、中、低剂量决明子提取物组大鼠给药相应剂量决明子提取物12周后，于末次给药结束后24h,禁食水12h后，去实验过程中意外死亡的6只大鼠，其中正常组1只、模型组2只、决明子高、中、低剂量组各1只，称取体重后采用2%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，进行尾静脉采血，检测空腹血糖水平采用胰岛素试剂盒检测FINS的水平参照文献报道的方法，计算胰岛素敏感指数Insulin sensitivityindex,ISIo高胰岛素.正葡萄糖钳夹试验检测葡萄糖输注率的
2.4Glucose InfusionRate,GIR测定正常组及模型组大鼠给予等体积生理盐水灌胃和高、中、低剂量决明子提取物组大鼠给药|相应剂量决明子提取物4周后，禁食不禁水12h后，2%批注[A7]:STZ答正常组及模型组大鼠给予等体积生理盐水灌胃和高、中、低剂量决明子提取物组大鼠给药相应戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，固定大鼠，分别分离左侧颈动脉和右颈内静脉并在血剂量决明子提取物管内插入PE-50导管，同时连接胰岛素输液泵和葡萄糖输液泵在开始实验室检测基础胰岛素和基础血糖basic bloodglucose,BBG,之后持续输注胰岛素，速度控制在
0.12U/kg.h,每5min测1次血糖，并输入10%葡萄糖，注意根据血糖变化调整葡萄糖输入速度，力求血糖保持在该范围内使血糖保持在BBG+
0.5mmol/Lo若连续4次检测血糖均维持在BBG±
0.5mmol/L,则表示钳夹过程处于稳态，可继续维持到120min,实验中共检测血糖24次空腹注射胰岛素耐量试验的测定常组及
2.5Fasting insulintolerancetest,FITT il:模型组大鼠给予等体积生理盐水灌胃和高、中、低剂量决明子提取物组大鼠给药相应剂量决明子提取物12周后，禁食不禁水12h,给予各组大鼠普通胰岛素腹腔注射，分别于
0、
30、
60、120min4个时间段检测，并计算曲线下面积Area UnderCurve,AUC骨骼肌组织中氧化应激水平的检测正常组及模型组大鼠给予等体积生理盐水
2.6灌胃和高、中、低剂量决明子提取物组大鼠给药相应剂量决明子提取物12周后，用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，取血后，处死大鼠，快速取出大鼠腓肠肌,置于PE管中，进行匀浆后，按照试剂盒的说明书进行超氧化物歧化酶superoxidedismutase,SOD、丙二醛malonaldehyde,MDA、活性氧Reactive OxygenSpecies,ROS活性及谷胱甘肽glutathione,GSH水平的检测蛋白免疫印迹法检测信号通路相关蛋白的表达处死大
2.7LKB1-AMPK-GLUT4鼠后，迅速留取腓肠肌组织100mg,在液氮中进行速冻后进行粉碎，加入冰预冷的细胞裂解液200可，并加入相应的磷酸酶抑制剂，4℃、12000r/min,离心10min,提取上清液，BCA法测定蛋白的总浓度，取100口1蛋白+100u1样品缓冲液2义,煮沸5分钟进行蛋白变性后，进行SDS-PAGE电泳分离目的蛋白，经过转膜，封闭后，加入相应的一抗、TBST洗膜3次后，加入相应的二抗，TBST洗膜3次后，采用BCIP酶显法进行显色，采用FlourChem V
2.0凝胶成像分析软件（America）分析目的条带的灰度值
2.8实时荧光定量PCR检测GLUT4mRNA的表达同
2.6的方法，取lOOmg腓肠肌组织，采用Trizol法取腓肠肌中的总RNA,按照ReverTra AceqPCR逆转录试剂盒说明书进行cDNA的合成，GLUT4mRNA引物由Primer Permier
5.0软件进行设计，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列如下GLUT4上游序歹ij51TGTTGCGGATGCTATGGG3,下游序列55-CTGCGAGG AA AGGAGGG A-39；4-actin上游序歹U5^TCATCACTCGGCAATG-39,5,-ACAGCACTGTGTGTTGGCAT-3,采用含有SYBRoGreenI的AccuPower@2X GreenStarq PCRMaster Mix反应体系进行PCR反应的扩增PCR扩增条件95℃预变性10s,95℃变性15s；55℃退火20s,共40个循环采用2--ct法检测腓肠肌组织中相关基因的的相对表达量
2.9统计学分析采用SPSS
21.0统计软件包进行数据分析计量资料采用均数土标准差（x土s）表示，两组间均数比较采用两独立样本t检验，同组干预前后均数比较采用配对t检验组间均数比较采用单因素方差分析PV
0.05为差异有统计学意义结果
22.1各组大鼠体重、空腹血糖和水平比较与正常组比较，模型组大鼠体重显FINS著降低，空腹血糖及FINS水平显著增高，差异具有统计学意义（PV
0.05）与模型组o比较，决明子各给药组体重显著增加，空腹血糖及FINS水平显著降低,差异具有统计学意义（P
0.05）且各给药组间比较呈剂量依赖性，见表1表1各组大鼠体重、空腹血糖和FINS水平M±sTable1Body weight,fasting bloodglucose,andFINSlevelsineachgroupofratsx±S组别n体重（g）空腹血糖（mmol/L）FINS ng/ml正常组
9385.98+
4.
265.39±
0.
6120.95+
1.81模型组
8290.38+
8.04*
23.48+
5.58*
35.11+
5.02*高剂量决明子提取物组
9375.94±
4.02#
5.37+
1.00#
23.03±
6.54#中剂量决明子提取物组
9348.43±
7.55#
9.54±
2.05#
28.26±
2.96#低剂量决明子提取物组
9332.57±
10.57#
13.87±
1.96#
30.90+
8.31#“值
228.
64763.
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