荧光分光光度计原理与操作课件

荧光分光光度计原理与操作课程目标与学习内容课程目标学习内容理解荧光现象的基本原理；掌握荧光分光光度计的构造

1.

2.与性能；熟悉仪器的操作步骤与参数设置；能够进行激

3.

4.发光谱、发射光谱、同步荧光扫描和三维荧光图测定；掌

5.握定量分析方法，包括标准曲线法、内标法、外标法和加标回收法；能够分析解决仪器使用中常见的问题；了解样

6.

7.品准备的技巧与溶剂选择原则；掌握仪器的维护保养方法

8.和实验室安全规范什么是荧光现象荧光的发现历史早期观察斯托克斯的贡献12早在世纪，人们就开始观察到年，英国物理学家乔治加161852·某些物质在特定光照下会发光布里埃尔斯托克斯系统地研究了·例如，一些矿物和植物提取物在荧光现象，并提出了斯托克斯定太阳光照射下会呈现出特殊的光律，解释了荧光发射光的波长总芒是比激发光长的现象他也是第一个使用荧光（）“”fluorescence一词来描述这种现象的人现代发展斯托克斯定律斯托克斯定律指出，荧光发射光的波长总是比激发光的波长更长这是因为荧光物质吸收光能后，一部分能量会以热的形式耗散，导致发射光的能量降低，波长增加换句话说，激发光子的能量高于发射光子的能量斯托克斯位移是指激发光和发射光之间的波长差，是荧光分析中的一个重要参数在某些特殊情况下，也会出现反斯托克斯现象，即发射光的波长比激发光短，但这通常需要特殊的条件荧光的基本特征激发光谱和发射光谱荧光强度与浓度关系荧光物质具有特定的激发光谱和发在一定浓度范围内，荧光强度与荧射光谱激发光谱是指在不同激发光物质的浓度成正比利用这一关波长下，荧光强度随激发波长的变系，可以建立标准曲线，进行定量化曲线；发射光谱是指在特定激发分析但是，当浓度过高时，由于波长下，荧光强度随发射波长的变内滤效应和猝灭效应，荧光强度与化曲线通过分析激发光谱和发射浓度的线性关系会受到影响光谱，可以识别和定量分析荧光物质荧光寿命荧光寿命是指荧光物质在停止激发光照射后，荧光强度衰减到初始值的1/e（约）所需的时间荧光寿命是荧光物质的一个重要特征参数，可以

36.8%用于区分不同的荧光物质，也可以用于研究分子间的相互作用荧光发射过程示意图荧光发射过程通常包括三个步骤激发荧光物质吸收激发光子的能

1.量，从基态跃迁到激发态；振动弛豫激发态分子通过振动弛豫，降

2.低到激发态的最低振动能级；荧光发射激发态分子从最低振动能级

3.跃迁回基态，同时发射出荧光光子荧光发射过程的时间非常短，通常在纳秒级别理解荧光发射过程有助于更好地理解荧光的特性和应用荧光量子产率定义1荧光量子产率是指荧光物质发射的荧光光子数与吸收的激发光子数之比它是一个衡量荧光效率的重要指标，取值范围在0到1之间量子产率越高，表明荧光物质的荧光效率越高影响因素2荧光量子产率受多种因素的影响，包括荧光物质的结构、溶剂、温度、pH值以及是否存在猝灭剂等不同的荧光物质在不同的条件下，其量子产率可能会有很大的差异测定方法3荧光量子产率可以通过比较法或直接法进行测定比较法是利用已知量子产率的标准荧光物质作为参考，测定未知荧光物质的量子产率；直接法是直接测量荧光物质吸收的光子数和发射的光子数，计算量子产率荧光寿命概念定义荧光寿命是指荧光物质在停止激发光照射后，荧光强度衰减到初始值的（约）所需的时间荧光寿命是一个反映荧光分子激1/e

36.8%发态存在时间长短的参数，通常在纳秒级别影响因素荧光寿命受多种因素的影响，包括荧光物质的结构、溶剂、温度、值以及是否存在猝灭剂等不同的荧光物质在不同的条件下，其pH寿命可能会有很大的差异应用荧光寿命可以用于区分不同的荧光物质，也可以用于研究分子间的相互作用，例如荧光共振能量转移（）荧光寿命成像显微镜FRET（）是一种利用荧光寿命进行成像的技术，可以提供关于细胞FLIM和组织微环境的信息影响荧光强度的因素浓度温度荧光强度与荧光物质的浓度在一定范1温度升高通常会导致荧光强度降低，围内成正比，但浓度过高时会出现内2因为高温会加速激发态分子的非辐射滤效应和猝灭效应，导致线性关系偏跃迁过程离溶剂值pH4溶剂的极性和粘度会影响荧光物质的值会影响荧光物质的质子化状态，pH3激发态寿命和非辐射跃迁速率，从而从而影响其荧光强度不同的荧光物影响荧光强度质对值的敏感程度不同pH温度对荧光的影响高温1非辐射跃迁速率加快，荧光强度降低室温2荧光强度适中，有利于实验操作低温3荧光强度增强，但可能影响样品溶解度和实验操作温度对荧光强度的影响主要是通过改变激发态分子的非辐射跃迁速率来实现的高温会加速非辐射跃迁过程，导致荧光强度降低；低温则会抑制非辐射跃迁过程，增强荧光强度在实际应用中，需要根据具体的实验要求选择合适的温度值对荧光的影响pH酸性条件1某些荧光物质在酸性条件下荧光强度增强，而另一些则减弱中性条件2大多数荧光物质在中性条件下荧光强度较为稳定碱性条件3某些荧光物质在碱性条件下荧光强度增强，而另一些则减弱值对荧光的影响主要是通过改变荧光物质的质子化状态来实现的不同的荧光物质对值的敏感程度不同，有些荧光物质在酸pH pH性条件下荧光强度增强，而在碱性条件下减弱；另一些则相反在实际应用中，需要根据具体的荧光物质选择合适的值pH溶剂效应溶剂的极性和粘度会影响荧光物质的激发态寿命和非辐射跃迁速率，从而影响荧光强度一般来说，非极性溶剂有利于提高荧光强度，因为非极性溶剂可以减少激发态分子的能量损失在实际应用中，需要根据具体的荧光物质选择合适的溶剂猝灭效应定义动态猝灭静态猝灭猝灭是指荧光物质的荧光强度因与特定动态猝灭是指猝灭剂与激发态荧光分子静态猝灭是指猝灭剂与基态荧光分子形物质（猝灭剂）相互作用而降低的现发生碰撞，导致激发态能量转移，从而成复合物，导致荧光物质的有效浓度降象猝灭分为静态猝灭和动态猝灭两种降低荧光强度动态猝灭过程受扩散控低，从而降低荧光强度静态猝灭过程类型制，温度升高会加速猝灭过程与扩散无关，温度降低有利于复合物的形成荧光分光光度计的基本构造光源系统单色器系统样品池室检测器系统提供激发光，常用的光源用于选择激发光和发射光用于放置样品，通常采用用于检测荧光信号，常用包括氙灯、汞灯和激光的波长，包括激发单色器石英样品池，因为石英具的检测器包括光电倍增管器氙灯具有较宽的光谱和发射单色器单色器的有良好的透光性，不会干（）和光电二极管PMT范围，适用于多种荧光物性能直接影响仪器的灵敏扰荧光信号的测量光电倍增管具有较高的灵质的激发度和分辨率敏度，适用于微弱荧光信号的检测光源系统介绍氙灯汞灯12具有较宽的光谱范围，适用具有较强的特定波长的光，于多种荧光物质的激发但适用于特定荧光物质的激其光强稳定性较差，需要进发但其光谱范围较窄，应行校正用范围有限激光器3具有极高的光强和单色性，适用于高灵敏度的荧光分析但其价格昂贵，操作复杂氙灯的特点光谱范围宽氙灯的光谱范围覆盖紫外、可见和近红外区域，适用于多种荧光物质的激发光强高氙灯的光强较高，有利于提高荧光信号的强度稳定性差氙灯的光强稳定性较差，需要进行校正，以保证测量结果的准确性寿命有限氙灯的寿命有限，需要定期更换，以保证仪器的正常运行激发单色器的原理入射光1光源发出的光经过透镜聚焦后，入射到激发单色器色散元件2激发单色器中的色散元件（棱镜或光栅）将入射光分解成不同波长的光选择波长3通过调节狭缝的位置，可以选择特定波长的光作为激发光照射样品样品池室结构样品池用于放置样品，通常采用石英样品池，因为石英具有良好的透光性，不会干扰荧光信号的测量光路样品池室设计应保证激发光能够有效地照射到样品，同时发射光能够有效地被检测器收集控温某些样品池室具有控温功能，可以控制样品的温度，以保证测量结果的准确性发射单色器的作用光谱扫描进行发射光谱扫描，获得荧光物质的2发射光谱，用于识别和定量分析荧光选择波长物质1选择特定波长的发射光，避免杂散光和背景光的干扰，提高测量结果分辨率的准确性影响仪器的分辨率，分辨率越高，可以区分更接近的两个波长，有利于复3杂样品的分离和分析检测器类型与特点光电倍增管（PMT）1灵敏度高，响应速度快，但易受强光损伤光电二极管2线性范围宽，稳定性好，但灵敏度较低雪崩光电二极管（APD）3灵敏度介于和光电二极管之间，响应速度快，噪声低PMT检测器的选择取决于具体的实验要求对于微弱荧光信号的检测，应选择灵敏度高的；对于强荧光信号的检测，应选择线性范围宽的PMT光电二极管；对于需要快速响应的检测，应选择响应速度快的APD光电倍增管工作原理光电效应1光子照射到光阴极上，产生光电子倍增效应2光电子经过一系列倍增极，产生大量的二次电子信号输出3大量的二次电子被收集到阳极上，形成电流信号输出光电倍增管的工作原理是基于光电效应和倍增效应光子照射到光阴极上，产生光电子；光电子经过一系列倍增极，产生大量的二次电子；大量的二次电子被收集到阳极上，形成电流信号输出光电倍增管具有极高的灵敏度，可以检测到非常微弱的光信号数据处理系统数据采集数据处理数据分析数据处理系统是荧光分光光度计的重要组成部分，主要包括数据采集、数据处理和数据分析三个功能数据采集负责将检测器输出的电流信号转换为数字信号；数据处理负责对数字信号进行校正、滤波和平均等处理；数据分析负责对处理后的数据进行定量分析、谱图解析和统计分析等仪器性能指标波长准确度灵敏度线性范围指仪器测量的波长与真实波长之间的偏指仪器能够检测到的最小荧光信号，是指荧光强度与荧光物质浓度成正比的浓差，是衡量仪器波长校正能力的重要指衡量仪器检测能力的重要指标度范围，是衡量仪器定量分析能力的重标要指标波长准确度定义影响因素校正方法指仪器测量的波长与真实波长之间的波长准确度受单色器的精度、光栅的可以使用标准波长物质（如汞灯、氘偏差，通常用纳米（）表示波长质量、仪器的校准以及环境温度等因灯）进行波长校正，以提高波长准确nm准确度是衡量仪器波长校正能力的重素的影响度要指标灵敏度指标信噪比（）检测限（）S/N LOD12指信号强度与噪声强度之指仪器能够检测到的最小荧比，是衡量仪器检测能力的光物质浓度，通常定义为信重要指标信噪比越高，表噪比为时的浓度3明仪器能够检测到的最小荧光信号越弱定量限（）LOQ3指仪器能够定量测定的最小荧光物质浓度，通常定义为信噪比为时的浓度10线性范围定义影响因素指荧光强度与荧光物质浓度成线性范围受仪器的灵敏度、杂正比的浓度范围在线性范围散光、内滤效应和猝灭效应等内，可以使用标准曲线法进行因素的影响定量分析扩展方法可以通过稀释样品、选择合适的激发波长和发射波长、降低杂散光等方法来扩展线性范围杂散光指标定义1指非激发光波长的光到达检测器的光，会干扰荧光信号的测量，降低测量结果的准确性来源2杂散光可能来源于光源、单色器、样品池室以及仪器的光学元件等降低方法3可以使用滤光片、提高单色器的精度、清洁光学元件等方法来降低杂散光扫描速度定义影响选择指仪器进行光谱扫描的速度，通常用纳米扫描速度会影响光谱的分辨率和信噪比应根据具体的实验要求选择合适的扫描速分钟（）表示扫描速度越快，扫描速度过快，可能会导致光谱失真，信度对于需要高分辨率的光谱，应选择较/nm/min测量时间越短，但可能会降低测量结果的噪比降低；扫描速度过慢，可能会导致测低的扫描速度；对于需要快速测量的样品，准确性量时间过长，样品发生变化可以选择较高的扫描速度仪器操作步骤开机预热参数设置1开机后，预热一段时间，使仪器达到根据实验要求，设置激发波长、发射2稳定状态波长、狭缝宽度、扫描速度等参数样品测量基线校正4将样品放入样品池室，进行荧光信号使用空白样品进行基线校正，消除背3的测量景信号的干扰开机预热注意事项时间1预热时间一般为分钟以上，确保仪器达到稳定状态30环境2保持实验室环境温度稳定，避免温度波动对仪器性能的影响检查3检查仪器各部件是否正常，如光源、单色器、检测器等开机预热是保证仪器测量结果准确性的重要步骤预热时间不足，会导致仪器性能不稳定，测量结果偏差较大；预热时间过长，会导致能源浪费因此，应根据仪器的具体要求，选择合适的预热时间波长校正方法标准物质1使用标准波长物质（如汞灯、氘灯）进行波长校正扫描2扫描标准物质的光谱，记录特征峰的波长校正3比较记录的波长与标准波长，进行校正，消除波长偏差波长校正是保证仪器测量结果准确性的重要步骤波长偏差会导致光谱失真，定量分析结果偏差较大因此，应定期进行波长校正，以保证仪器的测量精度仪器参数设置仪器参数设置是影响测量结果的重要因素激发波长和发射波长的选择应根据荧光物质的特性进行选择，狭缝宽度的选择应兼顾光谱分辨率和信号强度合适的参数设置可以提高测量结果的准确性和灵敏度基线校正空白样品基线扫描基线扣除使用空白样品（如溶剂、缓冲液）进行扫描空白样品的光谱，记录基线信号从样品信号中扣除基线信号，得到真实基线校正，消除背景信号的干扰的荧光信号样品室使用规范清洁避光控温保持样品室清洁，避免灰尘和污渍对避免强光照射样品室，防止光漂白现根据实验要求，控制样品室的温度，测量结果的影响象的发生保证测量结果的准确性激发光谱测定固定发射波长激发光谱12固定发射波长，扫描激发波激发光谱反映了荧光物质吸长，记录荧光强度随激发波收激发光的特性，可以用于长的变化选择最佳的激发波长应用3激发光谱可以用于识别和定量分析荧光物质，也可以用于研究分子间的相互作用发射光谱测定固定激发波长发射光谱固定激发波长，扫描发射波发射光谱反映了荧光物质发射长，记录荧光强度随发射波长荧光的特性，可以用于识别和的变化定量分析荧光物质应用发射光谱可以用于识别和定量分析荧光物质，也可以用于研究分子间的相互作用同步荧光扫描固定波长差1固定激发波长和发射波长之间的差值，同步扫描激发波长和发射波长，记录荧光强度随波长的变化简化光谱2同步荧光扫描可以简化光谱，提高选择性和灵敏度，减少杂散光和背景光的干扰应用3同步荧光扫描可以用于复杂样品的分析，例如石油、环境污染物等三维荧光图测定扫描激发和发射波长扫描激发波长和发射波长，记录每个激发波长和发射波长组合下的荧光强度三维图谱将荧光强度、激发波长和发射波长绘制成三维图谱，可以全面反映荧光物质的特性应用三维荧光图可以用于复杂样品的分析，例如蛋白质、核酸等，也可以用于研究分子间的相互作用定量分析方法标准曲线法内标法1利用标准曲线进行定量分析，适用于利用内标物质进行定量分析，可以消2线性范围内的样品除样品基质效应和仪器波动的影响加标回收法外标法4利用加标回收率进行定量分析，可以利用外标物质进行定量分析，适用于3评价分析方法的准确性样品基质简单的样品标准曲线法配制标准溶液1配制一系列已知浓度的标准溶液测量荧光强度2测量标准溶液的荧光强度绘制标准曲线3以荧光强度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线标准曲线法是一种常用的定量分析方法首先，配制一系列已知浓度的标准溶液；然后，测量标准溶液的荧光强度；最后，以荧光强度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线通过标准曲线，可以确定未知样品的浓度内标法加入内标物1在样品和标准溶液中加入一定量的内标物质测量2测量样品和标准溶液的荧光强度计算3计算样品中待测物质的浓度，消除基质效应的影响内标法是一种可以消除样品基质效应和仪器波动影响的定量分析方法首先，在样品和标准溶液中加入一定量的内标物质；然后，测量样品和标准溶液的荧光强度；最后，计算样品中待测物质的浓度，消除基质效应的影响内标物质的选择应与待测物质具有相似的特性，且不与待测物质发生反应外标法外标法是一种适用于样品基质简单的样品的定量分析方法首先，配制一系列已知浓度的标准溶液；然后，测量标准溶液和样品的荧光强度；最后，通过比较标准溶液和样品的荧光强度，确定样品中待测物质的浓度外标法操作简单，但容易受到样品基质效应的影响加标回收法加标测量计算在样品中加入已知量的标准物质测量加标样品和未加标样品的荧光强计算加标回收率，评价分析方法的准确度性常见问题与解决基线漂移灵敏度降低重复性差基线漂移可能是由光源不稳定、温度灵敏度降低可能是由光源老化、检测重复性差可能是由样品不稳定、仪器波动、样品池污染等原因引起的可器性能下降、光学元件污染等原因引参数设置不当、操作不规范等原因引以通过更换光源、稳定温度、清洁样起的可以通过更换光源、更换检测起的可以通过稳定样品、优化仪器品池等方法解决器、清洁光学元件等方法解决参数、规范操作等方法解决基线漂移原因分析光源不稳定温度波动12光源的输出强度随时间变温度变化会影响仪器的光学化，导致基线漂移元件和电子元件的性能，导致基线漂移样品池污染3样品池壁上的污渍会吸收或散射光，导致基线漂移灵敏度降低解决方案更换光源更换检测器光源老化会导致输出强度降检测器性能下降会导致灵敏度低，灵敏度下降，应及时更换降低，应及时更换检测器光源清洁光学元件光学元件污染会导致光损失，灵敏度下降，应定期清洁光学元件重复性差的处理稳定样品1确保样品在测量过程中保持稳定，避免样品发生变化优化参数2优化仪器参数，如狭缝宽度、扫描速度等，提高测量结果的重复性规范操作3规范操作步骤，减少人为误差，提高测量结果的重复性样品准备技巧选择溶剂选择合适的溶剂，确保样品能够完全溶解，且溶剂不干扰荧光信号的测量控制浓度控制样品浓度，避免浓度过高或过低，影响测量结果的准确性过滤样品过滤样品，去除杂质，减少杂散光，提高测量结果的准确性溶液配制方法称量溶解1准确称量固体样品将固体样品溶解在合适的溶剂中2混匀4定容3将溶液充分混匀将溶液定容至所需体积样品稀释要求线性范围1确保样品浓度在仪器的线性范围内避免过稀2避免样品浓度过低，导致信号太弱，无法检测逐步稀释3如果需要进行多次稀释，应逐步进行，避免误差积累样品稀释是样品准备的重要步骤，可以确保样品浓度在仪器的线性范围内，避免浓度过高或过低，影响测量结果的准确性稀释过程中应注意避免样品污染和损失溶剂选择原则溶解度1选择能够完全溶解样品的溶剂干扰2选择不干扰荧光信号测量的溶剂纯度3选择纯度高的溶剂，减少杂质的干扰溶剂的选择是样品准备的关键步骤，选择合适的溶剂可以确保样品能够完全溶解，且溶剂不干扰荧光信号的测量常用的溶剂包括水、乙醇、甲醇、二甲基亚砜（）等DMSO仪器维护保养日常清洁定期校准部件更换仪器维护保养是保证仪器正常运行和测量结果准确性的重要措施日常清洁可以去除仪器表面的灰尘和污渍，定期校准可以保证仪器的测量精度，部件更换可以保证仪器的性能稳定日常清洁要求表面清洁样品室清洁光学元件清洁用干净的软布擦拭仪器表面，去除灰尘用棉签蘸取无水乙醇清洁样品室，去除用专用清洁剂清洁光学元件，去除污和污渍残留样品渍，提高透光率定期校准流程选择校准物质测量校正选择合适的校准物质，如标准荧光物按照校准流程，测量校准物质的荧光根据测量结果，调整仪器参数，使测质、标准波长物质等信号或波长量结果与标准值一致光源更换方法关闭电源冷却12在更换光源前，务必关闭仪等待光源冷却后，再进行更器电源，并断开电源插头换，避免烫伤安装3按照说明书的指导，正确安装新的光源实验室安全规范防护通风实验时应佩戴防护眼镜和手实验室应保持通风良好，避免套，避免样品对眼睛和皮肤的有害气体的积聚伤害废弃物处理实验废弃物应按照规定进行处理，避免污染环境数据分析方法数据预处理1对原始数据进行校正、滤波和平均等处理，提高数据的质量谱图解析2对光谱图进行解析，识别特征峰，确定样品中存在的荧光物质定量计算3根据标准曲线或内标法，计算样品中荧光物质的浓度谱图解析技巧查阅文献对比标准谱图分析峰形查阅相关文献，了解常见荧光物质的将样品光谱与标准谱图进行对比，确分析峰形，判断样品中是否存在多种特征光谱定样品中可能存在的荧光物质荧光物质定量计算实例测量样品2测量未知样品的荧光强度y0标准曲线1已知标准曲线方程，其y=kx+b中为荧光强度，为浓度y x计算浓度根据公式，计算未知x0=y0-b/k3样品的浓度x0例如，已知标准曲线方程为，测量未知样品的荧光强度为，则未知样品的浓度为y=1000x+10510510-10/1000=

0.5ppm。