《微生物学实验教程》课件

微生物学实验教程欢迎来到微生物学实验教程！本课程将带领您探索微观世界的奥秘，了解各种微生物的形态特征、生长特性及其在自然界和人类生活中的重要作用通过系统学习显微技术、培养方法、生理生化特性测定等实验技能，您将能够独立开展微生物学实验研究，培养科学思维和实验操作能力让我们一起踏上这段奇妙的微生物探索之旅！课程目标和学习成果基础知识掌握通过本课程学习，学生将掌握微生物学基本概念、微生物的分类及其在各领域的应用，建立微生物学思维框架实验技能培养学生将熟练操作显微镜，掌握无菌技术、微生物分离培养、染色观察等实验基本技能，能够独立完成微生物学常规实验科研能力提升培养学生设计实验方案、收集分析数据、撰写实验报告的能力，为未来从事微生物相关科研工作奠定基础创新思维发展通过探究式学习，培养学生发现问题、分析问题和解决问题的能力，激发科学创新思维实验安全须知个人防护进入实验室必须穿着实验服，扣好扣子操作时佩戴口罩、手套，必要时戴护目镜长发须束起，禁止穿露趾鞋病原体防护严格按照病原微生物的危害程度和防护级别进行操作禁止用口吸取微生物悬液，使用移液器或吸管废弃物处理含微生物的器材必须经高压灭菌或化学消毒后处理废弃培养物应单独收集并高压灭菌实验台面实验前后必须消毒应急处理熟悉灭火器、洗眼器、应急淋浴等安全设备位置和使用方法发生感染事故立即报告指导教师，采取相应措施实验室基本操作规范实验前准备熟读实验指导书，明确实验目的和步骤•检查所需仪器设备和试剂是否齐全•整理实验台面，保持清洁•实验过程规范严格遵循操作步骤，不得擅自更改方法•正确标记试管、培养皿等容器•及时记录实验现象和数据•实验后处理妥善处理实验废弃物•清洗并归还实验用品•关闭仪器电源，检查水电气•实验记录要求使用专用实验记录本•详细记录实验步骤、观察结果和数据•记录实验中的问题和思考•显微镜的使用使用前检查检查物镜、目镜是否清洁，光源是否正常，载物台是否平稳，调焦系统是否灵活低倍镜对光先用低倍物镜（10×）对准视野中央，调节光圈和聚光器，使视野明亮均匀高倍镜观察找到目标后，转换到高倍物镜（40×），使用细调焦螺旋进行精确对焦油镜使用使用油镜（100×）时，在载片上滴加一滴浸油，注意使用后要及时清洁油镜正确使用显微镜是微生物学实验的基础技能始终保持双手稳定，操作时轻柔转动调焦旋钮使用完毕后，应将物镜转回低倍位置，降低载物台，关闭光源，盖上防尘罩细菌的单染色技术制备涂片1在洁净载玻片中央滴一小滴无菌水，取少量菌落均匀涂开并自然晾干热固定2将涂片通过火焰次，菌片朝上，固定细菌于载玻片上2-3染色3滴加甲基紫或亚甲蓝等碱性染料，染色分钟1-2水洗4用清水轻轻冲洗，去除多余染料晾干观察5滤纸吸干水分，在显微镜下观察单染色是最基本的细菌染色方法，通过使用单一染料使细菌呈现特定颜色，便于在显微镜下观察其形态和排列方式常用的碱性染料有龙胆紫、甲基紫和亚甲蓝等，这些染料带正电荷，能与带负电荷的细菌细胞壁结合革兰氏染色法原理革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌细胞壁含多层肽聚糖，厚度为，缺乏外膜结构细胞壁肽聚糖层薄（仅），但外层有脂多糖构成的外膜20-80nm2-7nm染色过程中，结晶紫与碘形成复合物沉积在厚厚的肽聚糖层中，染色时，乙醇脱色可溶解外膜中的脂质，使结晶紫碘复合物易于-不易被乙醇脱色，因此在显微镜下呈现紫色流失，随后可被复染液染成红色典型代表葡萄球菌、链球菌、芽胞杆菌等典型代表大肠杆菌、沙门氏菌、假单胞菌等革兰氏染色法是细菌学中最基本、最重要的鉴别染色方法，由丹麦科学家汉斯克里斯汀革兰（）于年发明··Hans ChristianGram1884这种染色方法可将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，为细菌的初步鉴定提供了重要依据革兰氏染色步骤演示制备涂片并热固定取少量菌落，加一滴水混匀，制成薄而均匀的涂片，自然晾干后火焰固定结晶紫染色滴加结晶紫染液，染色分钟，轻轻倾倒染液并用水冲洗1碘液处理滴加革兰氏碘液，作用分钟，形成结晶紫碘复合物，水洗1-乙醇脱色乙醇逐滴冲洗，直至洗出液无色，约秒，立即水洗95%15-30复染滴加复红或番红染液，复染秒，水洗，滤纸吸干，观察30革兰氏染色法操作中的关键点是脱色时间控制脱色过度会使革兰阳性菌也变为阴性，脱色不足则革兰阴性菌也呈阳性根据实验条件和检测菌种不同，可适当调整各步骤的时间细菌形态观察细菌按形态主要分为三大类球菌（球形）、杆菌（杆状）和螺旋菌（螺旋或弯曲状）球菌根据排列方式可分为双球菌、链球菌、四联球菌和葡萄球菌等杆菌可分为短杆菌、长杆菌、棒状杆菌等螺旋菌则包括弧菌、螺旋体和螺纹体观察时要注意细菌的大小、形态、排列方式和染色特性，这些特征是初步鉴定细菌的重要依据细菌的排列方式与其分裂方式密切相关，是细菌分类学的重要特征之一放线菌形态观察基内菌丝气生菌丝生长在培养基内部，负责营养吸收，向空气生长的菌丝，用于产生孢子，菌丝细长，直径，无隔通常较粗，表面覆有疏水性物质

0.5-

1.0μm膜基本特征孢子链放线菌兼具细菌和真菌特性，属于原核生物，但能形成分支菌丝和孢子链气生菌丝顶端形成的分生孢子链，是放线菌无性繁殖的主要结构放线菌的观察通常采用盖玻片培养法或透明平板法，使其菌落和菌丝形态能够直接在显微镜下观察许多放线菌能产生抗生素和其他活性物质，如链霉素、四环素等，在医药和农业领域具有重要应用酵母菌形态观察单细胞结构出芽生殖假菌丝形态酵母菌为单细胞真核微生物，细胞呈圆形、酵母菌主要通过出芽方式进行无性繁殖在某些条件下，部分酵母菌（如白色念珠菌）椭圆形或柠檬形，直径细胞内可适宜条件下，母细胞表面形成小芽，随后芽的芽细胞不完全分离，连续出芽形成链状结3-5μm见明显的细胞核、液泡和其他细胞器细胞体逐渐增大当芽体发育到一定程度时，母构，称为假菌丝假菌丝与真菌的真菌丝不壁主要由葡聚糖和甘露聚糖组成，表面光滑子细胞之间形成隔膜并分离，完成一次细胞同，不含有隔膜，是酵母菌的一种特殊生长分裂形式霉菌形态观察菌丝结构霉菌为多细胞真菌，由管状的菌丝组成，菌丝直径菌丝有横隔，分为细胞，具有完整2-10μm的细胞壁、细胞膜和细胞器菌丝网络称为菌丝体，分为营养菌丝和生殖菌丝营养菌丝负责吸收营养，生殖菌丝产生孢子用于繁殖孢子结构霉菌通过产生各种类型的孢子进行繁殖根据孢子形成方式和结构特点，可以分为孢子囊孢子、分生孢子等多种类型不同种属霉菌的孢子囊、孢子柄和孢子形态各异，是鉴定霉菌种类的重要依据常见的霉菌类型包括根霉（黑色的孢子囊）、青霉（刷状排列的分生孢子）和曲霉（辐射状排列的分生孢子）等观察霉菌时，通常采用透明胶带法或湿片法，重点关注菌丝有无隔膜、孢子产生方式和形态特征培养基的类型特殊培养基特定研究或鉴定用途鉴别培养基区分不同种类微生物选择培养基3抑制某些菌生长基础培养基满足一般微生物生长需求基础培养基如营养肉汤、营养琼脂等，含有微生物生长所需的基本营养物质，适合大多数非挑剔型微生物生长选择培养基添加了抑制剂，能抑制某些微生物生长而允许目标微生物生长，如麦康凯琼脂（抑制革兰阳性菌）鉴别培养基含有特定指示剂，能根据微生物的生化反应产生颜色变化，帮助区分不同种类微生物，如伊红美蓝琼脂特殊培养基针对特殊需求设计，如厌氧培养基、计数培养基等基础培养基制备5g蛋白胨提供氮源和生长因子3g酵母提取物提供族维生素和微量元素B15g琼脂粉提供固体支持，不被微生物利用1000ml蒸馏水溶解并稀释所有成分营养琼脂是一种常用的基础培养基，适合大多数非挑剔型细菌的培养制备步骤包括称量各组分，加入蒸馏水中搅拌溶解，调节至，pH

7.2-

7.4加热使琼脂完全溶解，分装到试管或三角瓶中，℃高压灭菌分钟12115-20对于液体培养基（营养肉汤），制备方法相同，但不添加琼脂制备过程中应注意避免培养基过度加热导致营养物质降解，以及确保值适合目标pH微生物生长选择培养基制备成分用量功能胰蛋白胨氮源和生长因子

17.0g蛋白胨提供氨基酸和短肽

3.0g乳糖碳源和鉴别因子

10.0g胆盐选择抑制剂

1.5g中性红指示剂

0.03g pH结晶紫选择抑制剂

0.001g琼脂凝固剂

15.0g蒸馏水溶剂1000ml麦康凯琼脂是常用的选择培养基，用于肠道菌的分离培养其中的胆盐和结晶紫能抑制革兰阳性菌的生长，而允许革兰阴性肠道菌生长制备时需注意溶解胆盐可能产生的泡沫，以及调节pH至

7.1±

0.2鉴别培养基制备材料称量溶解混合精确称量各种成分，包括营养物质、指示剂成分加入蒸馏水中充分溶解，控制温度防止和琼脂指示剂变性分装灭菌调节pH培养基分装入容器，℃高压灭菌12115-用或溶液调整值至指定范围NaOH HClpH分钟20伊红美蓝（）琼脂是经典的鉴别培养基，含有乳糖、蔗糖、伊红和美蓝等成分乳糖发酵菌如大肠杆菌在上生长形成金属光泽的深紫色菌EMB EMB落，而不发酵乳糖的菌如沙门氏菌则形成无色透明菌落鉴别培养基通常含有特定指示物质，能反映微生物的生化特性，如产酸、产气、产硫化氢等，帮助区分形态相似但生化特性不同的微生物培养基灭菌方法高压蒸汽灭菌温度℃•121压力（）•

103.4kPa15psi时间分钟•15-20适用大多数培养基•干热灭菌温度℃•160-180时间小时•2-4适用玻璃器皿、金属器具•不适用含热敏成分培养基•过滤灭菌孔径•

0.22μm适用含热敏成分培养基•例如血清、抗生素、维生素•优点避免热破坏•间歇灭菌温度℃•100时间分钟天，连续天•30/3适用含热敏成分培养基•原理杀死营养细胞，让芽孢萌发后再杀死•无菌操作技术手部准备实验前彻底洗手并消毒，操作时避免接触无菌区域戴手套时仍需遵循无菌原则，手套表面也可能被污染火焰消毒接种环、针在酒精灯火焰中灼烧至红热，等待冷却后使用玻璃器皿口部应在火焰上快速通过数次消毒容器开合打开培养皿或试管时，盖子或棉塞不要放在台面上试管口应快速通过火焰消毒，斜握试管减少污染几率环境控制操作时关闭门窗，避免空气流动尽量在无菌工作台或接种箱内操作，减少空气污染操作过程中不说话，避免飞沫污染平板划线分离法准备工作准备固体培养基平板，在平板底部画出四个区域，标记为、、、区灼烧接种环至红热并冷却1234一区划线取少量菌种，在区进行密集的来回划线，每次划线方向略有变化，覆盖整个区域1二区划线灼烧接种环，冷却后从区边缘带少量菌种到区，继续划线，线条间距增大12

三、四区划线重复灼烧冷却过程，从前一区带少量菌种到下一区，继续划线，每次减少接触次数，增大间距培养与观察平板倒置培养小时，观察末区出现的分散单菌落，这些为纯培养菌落18-24倾注平板法样品稀释将原始菌液进行倍系列稀释，通常制备至的稀释液1010^-110^-7培养基准备将灭菌后的琼脂培养基保持在℃水浴中，避免过热或过冷45-50混合倾注取适当稀释度的菌液加入无菌培养皿中，倾入约温热培养基，立1ml15-20ml即轻轻转动混匀凝固与培养待培养基凝固后，倒置培养皿，置于适宜温度下培养小时24-48倾注平板法适用于细菌总数的测定和分离纯培养物与划线法相比，它能更好地分散单个细胞，使每个菌落由单个细胞发展而来操作时需注意培养基温度控制在℃，过高会杀45-50死微生物，过低则不易均匀混合且容易产生气泡稀释涂布法样品稀释制备微生物悬液的倍系列稀释液10样品接种吸取适当稀释度的菌液滴于固体培养基表面

0.1ml涂布操作用无菌玻璃涂布棒均匀涂抹整个平板表面培养观察倒置平板培养，计数形成的菌落玻璃涂布棒可用酒精浸泡并火焰灭菌，待冷却后使用涂布时应保持涂布棒与培养基表面平行，75%轻轻旋转平板使菌液均匀分布该方法与倾注平板法相比，优点是避免了微生物接触高温培养基，适合热敏感微生物的分离涂布时通常采用螺旋式涂布或转盘式涂布，确保菌液均匀分布菌落计数时，选择菌落数在30-之间的平板进行计数，计算原始样品中的菌数300细菌生长曲线测定细菌计数方法平板计数法原理与优势操作步骤平板计数法基于每个活菌可在固体培养基上形成一个肉眼可见菌•制备样品倍系列稀释液（到）1010^-110^-8落的原理该方法只计数活菌数量，结果更接近实际有生理活性•选择适当稀释度，取或样品

0.1ml1ml的细菌数量•采用涂布法或倾注平板法接种优点是操作简单，结果直观，可同时观察不同菌落形态，有利于•适宜温度培养小时24-48纯培养的分离适用于大多数细菌的计数•选择菌落数在之间的平板计数30-300•计算结果原菌数菌落数×稀释倍数=计数时应使用菌落计数器，在放大镜下进行计数如果平板上菌落过多或过少，结果准确性会降低过多时菌落互相重叠难以区分，过少时统计学意义不显著结果通常以（菌落形成单位毫升）表示CFU/ml/细菌计数方法显微镜计数法个80平均细菌数/小方格在25个小方格中观察到的细菌总数÷

250.02mm³计数室体积5×5小方格的总体积（深度×面积）1000换算系数将单位转换为（）mm³ml cm³4×10⁶细菌浓度/ml80×1÷

0.02×1000=4,000,000cells/ml显微镜直接计数法使用特殊计数室（如计数板）在显微镜下直接计数细菌数量该方法计数的是样品中所有细菌（包括活菌和死菌），不区分细菌的活力状态使用显微镜计数时，细菌浓度应控制在每个小方格个之间样品过稀会增加计数误差，过浓则难以准确计数对于有自发运动的细菌，可20-200先用甲醛等固定后再计数细菌计数方法比浊法细菌大小测量目微尺标定细菌样品制备显微镜测量数据计算在特定物镜下，用物微制备细菌涂片并染色，将目微尺放入目镜，观根据先前标定的换算系尺标定目微尺的刻度值确保细菌分布均匀，形察染色好的细菌样品数，将刻度数转换为实例如，在×物镜下，态清晰理想的样品应将目微尺刻度线与需要际长度（）测量40μm个目微尺格可能等于有足够数量的单个分散测量的细菌对齐，读取多个细菌，计算平均值1标定完成后细菌，避免细菌聚集或细菌长度和宽度占用的和标准差，确保测量结

2.5μm记录各种物镜下的换算重叠刻度数果具有统计学意义系数细菌生理生化实验试验IMViC吲哚试验（I）检测细菌分解色氨酸产生吲哚的能力阳性反应在添加柯瓦奇试剂后液面形成红色环，如大肠杆菌；阴性反应无色变化，如肠杆菌属甲基红试验（M）检测细菌混合酸发酵能力添加甲基红指示剂后，呈现红色为阳性（如大肠杆菌）；pH≤

4.4呈现黄色为阴性（如肺炎克雷伯菌）pH≥

6.0VP试验（V）检测细菌丁酮酸途径产生乙偶姻的能力阳性反应加试剂后呈现红色（如肺炎克雷伯菌）；阴性反应呈现铜色或无色变化（如大肠杆菌）柠檬酸盐试验（C）检测细菌以柠檬酸盐为唯一碳源的能力阳性反应培养基由绿色变为蓝色（如肠杆菌属）；阴性反应保持原色（如大肠杆菌）试验是肠杆菌科细菌鉴定的重要方法，由四项独立试验组成，可用于区分大肠杆菌（结IMViC IMViC果为）和肺炎克雷伯菌（结果为）等密切相关菌种++-IMViC-+吲哚试验原理操作步骤吲哚试验检测细菌分解色氨酸产生吲哚的能力含有色氨酸的蛋•在含蛋白胨的培养基中接种待测菌株1%白胨水培养基中，具有色氨酸酶的细菌可将色氨酸分解为吲哚、•℃培养小时3724-48丙酮酸和氨•加入柯瓦奇试剂（或用吲哚试纸检测）

0.5ml当加入柯瓦奇试剂（对二甲氨基苯甲醛）时，吲哚与试剂反应生•轻轻振荡，观察液面是否形成红色环成红色复合物，显示为液面上的红色环•立即判读结果，红色环为阳性，无色变为阴性吲哚试验是鉴别大肠杆菌与其他肠杆菌科细菌的重要方法大肠杆菌、产气肠杆菌等吲哚试验阳性，而肺炎克雷伯菌、肠杆菌属等吲哚试验阴性该试验是粪便污染的重要指标，在水质卫生检测中具有重要应用甲基红试验培养基接种在培养基（含葡萄糖、磷酸盐缓冲液和蛋白胨）中接种待测菌株MR-VP培养孵育℃培养小时，使细菌充分代谢葡萄糖3748-72加入指示剂加入滴甲基红溶液，轻轻振荡混匀

50.02%结果判读立即观察颜色变化红色为阳性，黄色为阴性，橙色为弱阳性甲基红试验检测细菌的混合酸发酵能力混合酸发酵菌如大肠杆菌能产生大量有机酸（如乳酸、甲酸、乙酸等），使培养基降至以下，甲基红指示剂呈现红色丁二醇发酵菌如肺炎克雷伯菌产酸pH

4.4能力弱，培养基通常高于，甲基红指示剂呈现黄色pH

6.0试验VP菌株培养1在培养基中接种待测菌株，℃培养小时MR-VP37482加入试剂A加入萘酚的乙醇溶液（巴氏试剂）

0.6ml5%α-A3加入试剂B加入溶液（巴氏试剂）

0.2ml40%KOH B观察结果振荡试管，静置分钟，观察颜色变化15-30试验（福格斯普洛斯卡尔试验）检测细菌通过丁二醇途径产生乙偶姻的能力丁二醇发酵菌如肺炎克雷VP-伯菌能将葡萄糖发酵产生乙偶姻，在碱性条件下，乙偶姻与萘酚反应生成红色复合物，呈现粉红色至深红α-色阳性反应混合酸发酵菌如大肠杆菌不产生乙偶姻，试验呈现阴性（无色或微铜色）此试验常与甲基红试验联合使VP用，帮助区分肠杆菌科中不同属种柠檬酸盐利用试验培养基准备菌株接种使用西蒙柠檬酸盐琼脂，其中柠檬酸钠为在斜面上划线接种待测菌株，避免带入其唯一碳源他培养基结果判读培养孵育阳性培养基由绿色变为蓝色并有菌落生℃培养小时，观察菌落生长和33724-48长；阴性培养基保持原色培养基颜色变化柠檬酸盐利用试验检测细菌以柠檬酸盐为唯一碳源的能力能利用柠檬酸盐的细菌（如肠杆菌属、克雷伯菌属）将柠檬酸代谢为碳酸和乙酸盐等碱性产物，使培养基升高，导致培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为蓝色pH细菌生理生化实验糖发酵试验发酵机制试验方法结果判读细菌通过酶系统分解糖类获取能量，同时产使用含特定糖（如葡萄糖、乳糖、蔗糖产酸产气（）培养基变黄且德氏管1%A/G生酸和气体（₂和₂）产酸会使培等）和指示剂的肉汤培养基，内置倒置中有气泡；仅产酸（）培养基变黄但无CO HpH A养基中的指示剂（如酚红）变色，气体的小管（德氏管）收集气体接种后℃气泡；无发酵（）培养基颜色不变，通pH37-则在倒置的德氏管中形成气泡培养小时，观察颜色变化和气体产常保持红色或粉红色不同细菌对不同糖的24-48生情况发酵模式可作为鉴定依据细菌生理生化实验产生试验H₂S原理细菌通过脱硫氨基酸（如半胱氨酸）产生₂•H S₂与重金属离子（如⁺）反应形成黑色硫化物沉淀•H SFe²黑色沉淀在培养基中可直接观察•试验方法使用含硫蛋白胨铁琼脂（）或三糖铁琼脂•TSI先深部刺种，再在斜面划线•℃培养小时•3718-24观察培养基中是否出现黑色沉淀•结果判读阳性培养基中出现黑色线或黑色区域•弱阳性仅在接种线附近有轻微黑变•阴性无黑色沉淀生成•常见微生物反应沙门氏菌强₂阳性•H S奇异变形杆菌₂阳性•H S大肠杆菌₂阴性•H S克雷伯菌₂阴性•H S细菌生理生化实验淀粉水解试验原理操作方法淀粉水解试验检测细菌产生淀粉酶和淀粉酶的能力这些酶•在含可溶性淀粉的营养琼脂平板上划线接种α-β-1%能将淀粉大分子（直链淀粉和支链淀粉）水解为麦芽糖和葡萄糖•℃培养小时3724-48等小分子糖•在平板表面滴加稀碘液（碘碘化钾溶液）-淀粉与碘反应呈蓝色，而水解产物与碘不呈色因此，在淀粉培•观察菌落周围是否形成透明区养基上生长的产淀粉酶菌株周围形成透明区，表明淀粉被水解•测量透明区大小，评估淀粉酶活性淀粉水解试验常用于鉴别芽孢杆菌、梭菌和某些肠杆菌科细菌芽孢杆菌（如枯草芽孢杆菌）通常淀粉水解阳性，而大肠杆菌则为阴性该试验也用于评估微生物淀粉酶的工业生产潜力，这种酶在食品、纺织和造纸工业中有重要应用α-细菌生理生化实验明胶液化试验培养基准备制备含明胶的营养明胶培养基，分装于试管中制成直立明胶柱12%菌株接种用接种针沿试管中央垂直刺种，深度约3-4cm培养条件22°C培养最多14天，每天观察明胶液化情况冷却检查将试管置于4°C冰箱冷却30分钟，区分真液化和假液化结果判读根据液化形态（杯状、漏斗状、囊状或层状）和液化程度记录结果明胶液化试验检测细菌产生明胶酶的能力明胶酶可水解明胶中的多肽键，使明胶失去凝胶特性真液化在冷却后仍保持液态，而假液化（仅因菌体生长）在冷却后会重新凝固产明胶酶的细菌包括绿脓杆菌、奇异变形杆菌、枯草芽孢杆菌等该试验对鉴别肠杆菌科细菌及某些革兰阴性非发酵菌有重要价值细菌生理生化实验脲酶试验脲酶试验检测细菌水解尿素产生氨的能力含脲酶的细菌能将尿素水解为氨和二氧化碳，氨使培养基呈碱性，指示剂（酚红）由黄色pH变为粉红色或鲜红色操作方法包括在含尿素和酚红的培养基上接种待测菌株，℃培养小时，观察颜色变化根据变色速度可分为快速脲酶阳2%3724-48性（几小时内变色，如变形杆菌）和慢性脲酶阳性（小时后变色，如克雷伯菌）该试验是鉴别变形杆菌（强脲酶阳性）的重要依据，24也用于区分不动杆菌与假单胞菌细菌生理生化实验过氧化氢酶试验原理过氧化氢酶能催化过氧化氢（₂₂）分解为水和氧气当含过氧化氢酶的细菌与H O₂₂接触时，会立即产生气泡（氧气），这是肉眼可见的阳性反应H O操作方法在载玻片上涂抹少量新鲜培养的菌落，滴加滴过氧化氢溶液，立即观察是否产1-23%生气泡也可直接在培养物上滴加过氧化氢溶液观察结果判读阳性反应立即产生气泡（氧气）；弱阳性产生少量气泡；阴性无气泡产生发泡强度与过氧化氢酶活性相关常见微生物反应大多数需氧菌和兼性厌氧菌过氧化氢酶阳性（如葡萄球菌、大肠杆菌）；严格厌氧菌通常过氧化氢酶阴性（如梭菌属）；链球菌属细菌（包括肺炎链球菌）为过氧化氢酶阴性细菌生理生化实验氧化酶试验原理试剂准备12氧化酶试验检测细菌产生细胞色素氧化酶的C四甲基对苯二胺二盐酸盐溶液，需新鲜配1%能力，该酶能在分子氧存在下氧化某些芳香胺制或冷藏避光保存结果判读操作方法阳性秒内变为深紫色；弱阳性10-30滤纸法在滤纸上滴加试剂，涂抹新鲜培养物；秒内变为浅紫色；阴性无色变或超30-603直接法直接在培养物上滴加试剂过秒变色60氧化酶试验是鉴别革兰阴性菌的重要方法，尤其用于区分氧化酶阳性的假单胞菌属和氧化酶阴性的肠杆菌科绿脓杆菌、弧菌属和奈瑟菌属通常氧化酶阳性，而大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌等肠杆菌科细菌氧化酶阴性抗生素敏感性试验纸片扩散法菌悬液制备取新鲜培养物调制成

0.5麦氏浊度标准的菌悬液（约

1.5×10⁸CFU/ml）平板接种用棉拭子均匀涂布穆勒欣顿琼脂平板，确保整个表面覆盖-抗生素纸片放置使用无菌镊子或分配器放置含特定浓度抗生素的纸片，相互间距离足够培养孵育4℃培养小时，避免培养过长导致抑菌圈边界模糊3716-18抑菌圈测量与判读测量抑菌圈直径（包括纸片），根据等标准判断敏感、中介或耐药CLSI抗生素敏感性试验最小抑菌浓度测定琼脂稀释法肉汤微量稀释法法E-test在含有系列浓度抗生素的琼脂平板上点种标在孔板中制备含抗生素的系列稀释液，使用一端含抗生素梯度浓度的塑料条，放置96准菌悬液培养后观察最低浓度的平板上无加入标准菌悬液，培养后观察无细菌生长的在接种好的平板上培养后在抑菌椭圆与条菌生长，该浓度即为值方法准确但耗最低浓度该方法可同时检测多种抗生素，带交叉点读取值方法简便，结果直观，MIC MIC时耗材，主要用于参考实验室和研究工作是临床实验室常用方法，也可用于自动化检但成本较高，常用于特殊菌种和抗生素的检测系统测最小抑菌浓度（）是能抑制肉眼可见细菌生长的最低抗生素浓度，是评价抗生素敏感性的金标准值可用于指导临床用药剂量，MIC MIC监测细菌耐药性的发展，以及新抗生素的研发评价环境因素对微生物生长的影响温度环境因素对微生物生长的影响pH嗜碱菌（）pH

8.5-

11.51如嗜碱芽孢杆菌，适应高环境pH中性菌（）pH

6.5-

7.5大多数病原菌，如大肠杆菌、沙门氏菌嗜酸菌（）pH

1.0-

5.5乳酸菌、醋酸菌和某些霉菌、酵母菌值影响微生物的生长主要通过影响细胞膜稳定性、酶活性和营养物质的溶解性大多数细菌的最适为，霉菌和酵母菌通常pH pH

6.5-

7.5能在更广泛的范围内生长，一般为pH pH4-

6.5实验方法包括在不同的培养基中培养微生物，观察生长情况；测定培养过程中的变化；检测不同条件下特定酶的活性缓pH pH pHpH冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐等常用于维持培养基的稳定环境这些知识广泛应用于食品保藏、发酵工业和微生物污染控制pH环境因素对微生物生长的影响渗透压微生物应对高渗透压的机制积累相容性溶质（如甘油、甜菜碱）•增强细胞壁和细胞膜强度•调整离子交换和水分子转运•合成特殊保护蛋白•不同耐盐性微生物类型非嗜盐菌适宜生长在低盐环境（）•

0.5%NaCl耐盐菌能在盐浓度下生长•2-5%嗜盐菌需要的盐浓度生长•5-20%极端嗜盐菌需要盐浓度•15-30%实验方法不同浓度的培养基制备•NaCl不同糖浓度培养基的制备•生长曲线测定和比较•直接显微镜观察形态变化•应用领域食品保藏（盐腌、糖腌）•制药工业发酵过程•环境微生物监测•极端环境生物技术•环境因素对微生物生长的影响氧气微生物氧气需求分类实验装置与方法•严格需氧菌必须有氧气存在才能生长，如铜绿假单胞菌厌氧培养方法•兼性厌氧菌有无氧气均可生长，无氧时通过发酵获能，如大厌氧罐使用气体发生剂消耗氧气并产生₂•CO肠杆菌厌氧培养箱通入₂、₂和₂混合气体•N HCO•微需氧菌需要低浓度氧气（），如幽门螺杆菌2-10%厌氧指示剂如亚甲蓝，在还原状态下无色••严格厌氧菌氧气存在时无法生长，氧气对其有毒性，如梭菌属需氧性测定方法•耐氧厌氧菌厌氧代谢但能耐受低浓度氧气半固体培养基穿刺观察生长位置•触酶和过氧化氢酶测定•氧气影响微生物生长主要通过两种方式作为终末电子受体参与有氧呼吸产生能量；产生活性氧自由基（如超氧阴离子、过氧化氢）对细胞造成氧化损伤需氧菌具有超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等防御酶系统，而严格厌氧菌缺乏这些保护机制微生物的分离与纯化土壤微生物样品采集采集不同层次土壤样品，用无菌容器储存，记录采样地点、时间和环境参数样品预处理风干、过筛、悬浮稀释；可用℃水浴热处理分钟筛选芽孢菌8010选择性培养使用不同选择培养基针对不同类群微生物；如放线菌选择培养基、真菌培养基等纯培养分离挑选不同形态菌落进行划线纯化，重复次确保纯度2-3初步鉴定显微镜观察、生理生化实验、分子生物学鉴定等方法确定分离菌株类别微生物的分离与纯化水体微生物100ml标准采样量水体微生物检测的典型样本体积℃37总菌培养温度水体细菌总数检测的标准培养温度24-48h培养时间大多数水生微生物的适宜培养时间

0.45μm滤膜孔径膜过滤法使用的标准滤膜孔径水体微生物采样需注意使用无菌容器，保留至少空气层，采样点应代表性强，样品应尽快检测（小时内）或在℃保存（不超过小时）1cm6424常用检测方法包括平板计数法（倾注或涂布）、膜过滤法和最可能数（）法MPN水体微生物检测的重要指标包括总菌数、总大肠菌群、粪大肠菌群和特定病原菌不同类型水体（饮用水、地表水、废水）有不同的检测标准和方法膜过滤法特别适用于洁净水样的检测，可直接在滤膜上培养微生物形成菌落微生物的分离与纯化空气微生物采样方法选择自然沉降法根据场所和目的选择合适的采样技术打开平板暴露特定时间，简单但不精确2过滤式采样撞击式采样用泵抽气通过滤膜捕获微生物用离心力使微生物撞击在培养基表面空气微生物检测在医院、食品加工厂、制药厂等环境中具有重要意义自然沉降法简便但定量性差，主要用于初步评估；撞击式采样器（如安德森采样器）能根据气溶胶粒径分级收集样品，适合定量分析；液体撞击采样器（如）适用于活性敏感的微生物采集Biosampler空气微生物的培养通常需要使用多种培养基，如营养琼脂（细菌总数）、沙氏琼脂（真菌）等采样点的选择应具有代表性，通常在人员活动区域、出入口、空调出风口等处进行采样结果常以表示，并与相应环境的标准限值比较CFU/m³微生物的分离与纯化食品微生物样品前处理样品稀释选择性培养固体食品需研磨或搅碎使用生理盐水或根据目标微生物选择适

0.85%均质化；液体食品需充蛋白胨水进行当培养基如大肠菌群

0.1%10分混匀；表面污染可用倍系列稀释通常需准用琼脂，MacConkey棉拭子采样前处理方备10⁻¹至10⁻⁶的稀金黄色葡萄球菌用鸡蛋法会直接影响后续检测释液，具体根据预期污黄氯化钠琼脂，沙门氏结果的准确性，应严格染程度决定稀释过程菌用琼脂等不同XLD按照标准方法进行需使用无菌技术，防止食品的标准检测方法有交叉污染所不同确证试验疑似菌落需进行进一步生化试验确认如试验确认大肠杆IMViC菌，凝固酶试验确认金黄色葡萄球菌现代检测还常结合分子生物学和免疫学方法提高特异性和灵敏度病原微生物检测粪便标本处理样本采集使用无菌容器采集新鲜粪便，液体粪便取，含异常物质（血液、黏液、2-5g5-10ml脓液）部分优先采集直接镜检2湿片法检查寄生虫囊肿、卵囊和滴虫；革兰染色观察细菌形态和炎症细胞选择性培养3使用琼脂、琼脂等分离沙门氏菌、志贺氏菌；培养基分离艰难梭菌SS XLDCCFA病原体鉴定生化试验、血清学分型和分子生物学方法确认病原体身份粪便标本采集后应在小时内送检，如无法及时送检，需使用适当保存液（如培养基）2Cary-Blair对于某些特殊病原体检测，如肠道病毒、隐孢子虫等，需采用特殊处理方法和检测技术病原微生物检测血液培养采样前准备采血部位用碘伏或氯己定消毒，待干后酒精擦拭，严格无菌操作防止污染75%样本采集成人每次采血，儿童根据体重调整，一般至少两套，间隔分钟，采血前消毒血培养瓶橡胶盖8-10ml30培养过程℃培养天，自动化血培养系统可连续监测₂产生或压力变化，阳性信号提示微生物生长35-375-7CO阳性处理培养瓶显示阳性后立即取样，进行革兰染色和平板分离培养，同时接种药敏试验结果报告初步报告包括革兰染色结果，最终报告包括病原体鉴定和药敏结果，必要时进行分子分型血培养是诊断血流感染的金标准方法培养瓶通常包括需氧瓶和厌氧瓶，部分还有特殊类型如真菌培养瓶、小儿专用瓶等抗生素使用前采血可提高阳性率，快速准确的报告对指导临床抗感染治疗至关重要病原微生物检测尿液培养标本采集培养方法常见病原体清洁中段尿是首选方法，早晨第一次排尿的标准方法为校准环接种法（或尿路感染最常见病原体为大肠杆菌（占

0.01ml中段尿最佳采集前需清洁外生殖器，排出）使用血琼脂和以上的社区获得性感染），其次为其

0.001ml MacConkey80%少量尿液后收集中段尿于无菌容琼脂平板，℃培养小时他肠杆菌科细菌、肠球菌和金黄色葡萄球菌10-20ml35-3718-24器中导管尿需在新置入的导管处采集，避尿路感染的诊断标准通常为中段尿菌落计数非典型病原体如结核分枝杆菌、支原体和衣免从集尿袋取样采集后应在小时内接种，某些情况如纯培养的病原原体需采用特殊方法检测医院获得性尿路2≥10⁵CFU/ml或置℃保存（不超过小时）菌、导管尿等，较低的菌落计数也有临床意感染中，铜绿假单胞菌和耐药肠杆菌科细菌424义分离菌株需进行鉴定和药敏试验更为常见病原微生物检测咽拭子培养采样技术培养和鉴定采样前应避免使用含抗菌成分的漱口水采样时用压舌板压住舌咽拭子常规接种在血琼脂平板和巧克力琼脂平板上，如怀疑链球头，用无菌棉拭子在两侧扁桃体和咽后壁有炎症或脓性分泌物处菌感染，应加用革兰阳性菌选择培养基如琼脂℃培CNA35-37旋转擦拭，避免接触口腔其他部位养小时，必要时延长至小时18-2448采集后的咽拭子应立即放入适当的运送培养基（如或组链球菌是咽炎的主要病原体，可通过溶血、杆状试验和后续Stuart Aβ培养基）中，室温下可保存小时，℃可保存小时分组确认其他常见病原体包括葡萄球菌、流感嗜血杆菌和莫拉Amies24448如需检测病毒，应使用病毒采样管并冷藏或冰冻保存菌属等可使用快速抗原检测和分子方法提高诊断效率咽拭子培养结果解读需考虑定植菌的影响，正常人咽部有大量共生菌群结果报告通常包括优势菌群描述和可能的病原体鉴定对疑似病原体需进行药敏试验，指导临床用药近年来，咽拭子检测呼吸道病原体（包括细菌和病毒）在临床中应用日益广泛PCR微生物的鉴定形态学鉴定形态学鉴定是微生物学基本鉴定方法，包括显微形态和菌落形态观察显微形态观察包括细胞大小、形状（球形、杆形、螺旋形等）、排列方式（单个、成对、链状、簇状等）、革兰染色反应、有无荚膜和芽孢、鞭毛数量和排列等特殊染色如抗酸染色、荚膜染色和鞭毛染色可显示细菌特定结构菌落形态观察包括大小、形状（圆形、不规则等）、隆起度、边缘（整齐、波状等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度、颜色、气味和质地等特征特定培养基上的表现也有助于初步鉴定，如溶血类型、色素产生和特殊培养基上的生化反应等形态学鉴定简便快速，是后续生理生化和分子鉴定的基础微生物的鉴定生理生化鉴定生化性状大肠杆菌肺炎克雷伯菌变形杆菌铜绿假单胞菌吲哚试验+--/+-甲基红试验+-+-试验VP-+--枸橼酸盐-+-/++尿素酶-++-/+₂产生H S--+-葡萄糖发酵A/G A/G A/G-乳糖发酵A/G A/G--氧化酶---+生理生化鉴定是基于微生物代谢和酶活性的差异进行种属鉴定传统方法包括单项生化试验和商品化鉴定系统单项试验如前面学习的试验、糖发酵试验等，针对特定生化特性商品化系统如系列、IMViC API卡片等，集成多种生化反应，结合计算机数据库分析，提高鉴定效率和准确性VITEK微生物的鉴定血清学鉴定凝集反应免疫荧光技术酶联免疫吸附试验免疫层析技术抗体与细菌表面抗原结合形使用荧光标记的抗体直接或可检测微生物特异性结合层析和免疫反应原理的ELISA成肉眼可见的凝集物常用间接检测微生物抗原直接抗原或宿主对微生物的特异快速检测方法，如侧向流免于沙门氏菌、志贺氏菌等的法操作简便但灵敏度较低，性抗体该方法灵敏度高，疫层析（试纸条法）操作抗原和抗原分型，以及间接法步骤较多但灵敏度更特异性好，可半定量或定量简便，无需专业设备，结果O H链球菌的兰斯菲尔德分组高该技术可用于组织切片分析，适用于大批量样本筛快速（通常分钟），5-15凝集反应操作简便，结果直或涂片中病原体的原位检测，查常用于病毒（如、适合现场筛查和（即HIV POCT观，是实验室常用的快速鉴如细小病毒、衣原体等难培乙肝病毒）和细菌毒素（如时检验）广泛应用于组A定方法养微生物的鉴定肠毒素、外毒素）的检测链球菌、军团菌、诺如病毒等快速检测微生物的鉴定分子生物学鉴定核酸提取从微生物培养物或临床标本中提取DNA/RNAPCR扩增扩增特异性微生物靶基因序列检测分析通过凝胶电泳、杂交或测序确认产物PCR数据库比对将序列与参考数据库比对确定微生物身份分子生物学鉴定具有特异性高、灵敏度好、速度快的优点，尤其适用于难培养或生长缓慢的微生物，以及需要精确到种或亚种水平的鉴定常用的鉴定靶基因包括基因（细菌）、16S rRNA18S基因（真核微生物）、区域（真菌）等保守序列，以及特异性毒力基因或抗性基因rRNA ITS现代分子生物学鉴定技术包括多重（同时检测多个病原体）、实时荧光（定量检测）、高通PCR PCR量测序（微生物组分析）等临床实验室常用的商品化分子诊断系统如、Cepheid GeneXpert等，实现了样本进、结果出的全自动化检测，大大缩短了微生物鉴定的周期BioFire FilmArray微生物实验室质量控制染色液质控培养基质控新配制染色液需使用标准阳性和阴性菌株验证，定期检查染色效果每批培养基进行无菌检查和生产力测试，使2用标准菌株验证其选择性和鉴别能力1试剂质控3生化试剂使用前用已知结果的标准菌株验证，建立试剂使用记录结果监测标准菌株管理4定期分析实验室数据，监测关键指标变化趋势，参加能力验证计划使用等机构的标准菌株，严格按规程ATCC保存和传代，防止变异微生物实验室质量控制是保证实验结果准确可靠的关键实验室应建立完善的质量管理体系，包括标准操作程序（）、仪器设备维护SOP保养计划、人员培训和考核制度等环境监测和无菌操作验证也是重要的质量控制环节，尤其对洁净区域工作尤为重要实验数据分析与处理数据整理系统记录原始数据，包括日期、实验条件、观察结果等使用标准格式的实验记录本或电子表格，确保数据的完整性和可追溯性对异常值进行标记并记录可能的原因统计分析计算平均值、标准差、变异系数等描述性统计量根据研究设计选择适当的统计检验方法，如检验、方差分析、相关分析等明确统计显著性水平（通常）t p

0.05图表绘制根据数据类型选择合适的图表形式生长曲线用折线图，种群分布用柱状图或饼图，相关性分析用散点图确保图表包含完整的标题、坐标轴标签和单位、图例和误差线结果解释将实验结果与研究假设和已有文献进行对比分析讨论结果的生物学意义，而不仅仅是统计学意义对异常或意外结果提出合理解释，避免过度解读或推断微生物实验数据处理常见软件工具包括（基础数据整理和简单统计）、、Excel SPSSGraphPad（专业统计分析和图表绘制）、语言（高级统计分析和自定义图表）等生物信息学分析可Prism R能需要专门的软件如（进化分析）、（序列比对）等MEGA BLAST实验报告的撰写要求报告结构•标题（简明扼要反映实验内容）•摘要（概述目的、方法、结果和结论）•引言（背景信息和实验目的）•材料与方法（详细实验步骤）•结果（客观呈现数据和观察）•讨论（结果分析和解释）•结论（核心发现和意义）•参考文献（引用格式规范）结果部分要求•客观描述实验现象和数据•使用表格和图表呈现数据•图表必须有编号和说明文字•数据单位和精度保持一致•不在结果部分进行解释和推断讨论部分要求•解释结果的生物学意义•与已有研究进行比较分析•讨论实验中可能的误差来源•提出改进方法或后续研究方向•避免过度解读数据格式规范•语言简洁明了，使用科学术语•微生物名称首次出现时写全，后可缩写•图表与文字相互呼应但不重复•参考文献格式统一（如APA、MLA等）•页面设置和字体大小符合要求课程总结与展望微生物学前沿技术基因编辑、单细胞测序、微生物组学综合能力培养2实验设计、数据分析、科研思维基本实验技能3无菌操作、分离培养、鉴定检测本课程系统讲授了微生物学基本实验技能，从显微镜使用、染色技术到培养基制备、微生物分离培养、生理生化特性检测和鉴定等核心内容通过这些实验训练，您已掌握了微生物学研究的基础方法学，为未来深入学习和研究奠定了坚实基础微生物学是当今生命科学领域发展最为活跃的学科之一，在医学、农业、环保、能源和工业领域有着广泛应用随着新技术的不断涌现，微生物组研究、合成生物学、微生物代谢工程等前沿领域正在改变我们对微生物世界的认知和利用方式希望您能将所学知识和技能应用于实践，探索微观世界的奥秘，为人类健康和社会发展贡献力量。