分子生物学实验技术教学课件

分子生物学实验技术教学课件欢迎学习分子生物学实验技术课程！本课程将系统介绍现代分子生物学实验的基本原理和操作技术，帮助您掌握从核酸提取到基因编辑的一系列实验方法通过本课程的学习，您将能够独立设计和执行分子生物学实验，为未来的科研工作或生物技术行业就业打下坚实基础课程内容涵盖实验室安全、核酸操作、蛋白质分析、细胞培养和基因工程等多个方面的技术让我们一起探索分子生物学的奥秘，掌握改变世界的生物技术！课程概述课程目标学习要求掌握分子生物学实验的基本原学生需具备基础的分子生物学理和实验技能，能够独立设计理论知识，积极参与课堂讨论和执行分子生物学实验，培养和实验操作要求认真完成实严谨的科学思维和实验操作能验前预习、实验报告撰写，并力通过系统学习，建立分子遵守实验室安全规定本课程生物学实验的理论框架，为未要求全勤出席实验课，无特殊来科研工作奠定基础情况不得缺勤考核方式平时成绩（30%）包括出勤、课堂表现和实验预习报告；实验操作（40%）评估实验技能和实验报告质量；期末考试（30%）理论知识与实验设计能力考核，采用闭卷笔试和开放式实验设计相结合的方式分子生物学基础知识回顾中心法则DNA→RNA→蛋白质DNA结构与功能双螺旋结构，遗传信息储存RNA类型与作用3mRNA、tRNA、rRNA等多种类型分子生物学中心法则阐述了遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质的流动方向，是理解生命科学的核心概念DNA作为遗传物质，通过其独特的双螺旋结构稳定存储遗传信息，并通过复制过程传递给子代RNA根据功能可分为多种类型信使RNA（mRNA）负责传递遗传信息；转运RNA（tRNA）负责运送氨基酸；核糖体RNA（rRNA）是核糖体的组成部分；此外还有非编码RNA如microRNA、长链非编码RNA等，参与基因表达调控理解这些基础概念对后续实验技术的学习至关重要实验室安全与仪器使用生物安全等级常用仪器介绍•BSL-1适用于非致病性微生物实•PCR仪用于DNA扩增验•离心机用于样品分离•BSL-2适用于中等危害性病原体•电泳仪用于核酸和蛋白质分离实验•超净工作台提供无菌环境•BSL-3适用于通过呼吸途径传播的病原体•BSL-4适用于致命病原体实验操作注意事项•实验前穿戴防护装备•严格遵循操作规程•实验废弃物妥善处理•发生意外立即报告核酸提取技术

（一）提取DNA洗涤与溶解DNA沉淀使用70%乙醇洗涤DNA沉淀，去除盐类，蛋白质去除加入乙醇或异丙醇沉淀DNA，离心收集最后溶于TE缓冲液或水中细胞裂解通过酚-氯仿提取或蛋白酶K消化去除蛋使用物理或化学方法破坏细胞膜和核膜，白质污染释放DNADNA提取是分子生物学实验的基础步骤，常用方法包括传统酚-氯仿法、柱层析法、磁珠法等不同方法各有优缺点酚-氯仿法得率高但操作复杂且有毒；柱层析法操作简便但成本较高；磁珠法适合自动化但提取效率受样品类型影响提取后DNA质量控制主要通过紫外分光光度计测定OD260/OD280比值（纯DNA约为

1.8）和琼脂糖凝胶电泳检测完整性高质量的DNA应无降解条带，无RNA和蛋白质污染核酸提取技术

（二）提取RNA样品准备与裂解使用含有异硫氰酸胍的裂解液快速裂解细胞并灭活RNase相分离加入氯仿后离心，形成水相（含RNA）、中间相和有机相（含DNA和蛋白质）RNA沉淀从水相中加入异丙醇沉淀RNA，离心收集沉淀洗涤与溶解使用75%乙醇洗涤，去除盐类，溶于无RNase的水中RNA提取最大的挑战是防止RNA降解，因为RNase几乎无处不在且极其稳定在RNA实验中，必须采取严格的防RNase措施使用DEPC处理的水和试剂，灭菌的无RNase塑料器皿，全程佩戴手套，并使用RNase抑制剂提取后RNA质量检测通常包括OD260/OD280比值测定（纯RNA约为

2.0）、琼脂糖凝胶电泳检查完整性（可见清晰的28S和18S rRNA条带，理想比例为2:1）和RNA完整性数值（RIN值）测定，RIN值范围为1-10，值越高表示RNA完整性越好，一般实验要求RIN7核酸定量技术荧光定量法利用特异性荧光染料与核酸结合后发光紫外分光光度法基于核酸在260nm处有最大吸收的原理电泳法通过与已知浓度的标准品比较估算浓度紫外分光光度法是最常用的核酸定量方法，基于核酸碱基在260nm波长处有最大吸收的原理一般而言，1OD260相当于50μg/ml双链DNA、40μg/ml单链DNA或RNA该方法简便快速，但无法区分不同类型核酸，且蛋白质污染会影响测定结果荧光定量法灵敏度更高，可以检测低至1ng/ml的核酸浓度常用的荧光染料包括PicoGreen（用于dsDNA）、RiboGreen（用于RNA）等这种方法的优点是特异性高，几乎不受蛋白质或其他污染物的影响，但需要专门的荧光计和标准曲线电泳法通过与已知浓度的DNA标准品比较来估算样品浓度，虽然精确度不如其他方法，但可同时评估核酸的质量和完整性琼脂糖凝胶电泳原理与应用实验步骤结果分析基于带负电荷的DNA分制备琼脂糖凝胶（

0.8%-通过与DNA分子量标准子在电场作用下向正极2%），加入核酸染料物（Marker）比较，确移动，移动速率与DNA（EtBr或SYBR Green），定目的片段大小清晰大小成反比用于分离将DNA样品与加样缓冲单一条带表示样品纯度不同大小的DNA片段，液混合后点样，在恒压高；弥散或多条带可能检测PCR产物，评估条件下电泳，最后在紫表示降解或非特异性扩DNA质量和完整性外灯下观察结果增聚丙烯酰胺凝胶电泳原理与应用实验步骤聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，形成具制备胶液（调节丙烯酰胺浓度控制孔径大小），加入TEMED和有特定孔径的网状结构与琼脂糖凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶具APS引发聚合，灌胶，待凝固后加样，电泳，最后用银染或考马斯有更高的分辨率，适用于分离小片段核酸（5-500bp）和蛋白质亮蓝染色显示条带对于DNA样品，可在电泳前加入变性剂（如尿素）形成变性胶，主要应用于DNA序列分析、蛋白质电泳（SDS-PAGE）、DNA足迹用于单碱基分辨率的分离对于蛋白质，通常采用SDS-PAGE技术分析和单链构象多态性分析等结果分析与注意事项聚丙烯酰胺凝胶电泳可实现极高的分辨率，甚至可分辨单碱基差异或小分子量蛋白质但操作中需注意丙烯酰胺单体有神经毒性，操作时必须戴手套；凝胶聚合过程中避免氧气干扰；电泳过程中注意控制电压和电流，防止过热导致凝胶变形限制性内切酶技术原理与分类限制性内切酶是一类可识别特定DNA序列并切割的酶，源自细菌的防御系统根据识别序列和切割方式分为I型、II型和III型，其中II型最常用于分子生物学实验常用限制性内切酶2EcoRI（G↓AATTC）、BamHI（G↓GATCC）、HindIII（A↓AGCTT）等酶的命名规则首字母代表细菌属，第2-3位代表种，第4位代表菌株，罗马数字表示同一菌株中分离的酶的顺序操作条件每种酶有其最适反应条件（温度、pH、离子强度等）通常在37℃条件下反应1-4小时，反应体系包括DNA、酶、特定缓冲液和BSA（提高酶稳定性）应用实例DNA指纹分析、基因克隆、载体构建、基因分型和限制性片段长度多态性（RFLP）分析等领域广泛应用连接技术DNA1:316°C插入片段:载体比例最适连接温度连接反应中理想的摩尔比，可根据片段大小调整平末端连接的推荐温度，黏性末端可在室温进行1-4连接反应时间小时黏性末端连接时间，平末端可延长至overnightDNA连接是分子克隆中的关键步骤，通过T4DNA连接酶催化DNA片段之间的磷酸二酯键形成T4DNA连接酶源自T4噬菌体，能够催化具有5-磷酸基团和3-羟基末端的DNA片段连接，需要ATP提供能量连接反应分为黏性末端和平末端两种类型黏性末端连接效率高，反应条件温和；平末端连接效率较低，通常需要更高浓度的连接酶和更长的反应时间提高连接效率的策略包括调整插入片段与载体的摩尔比（通常为3:1至5:1）；使用PEG增加DNA局部浓度；适当延长反应时间；对载体进行去磷酸化处理防止自连接克隆载体系统噬菌体载体利用噬菌体生命周期特点，如λ噬菌体和M13噬菌体•装载容量大（可达20kb）人工染色体载体质粒载体•适合构建基因文库用于克隆大片段DNA，包括YAC、BAC和PAC最常用的克隆载体，如pUC系列、pBR322等•可用于单链DNA制备•YAC酵母人工染色体，可克隆200-2000kb•复制起点控制拷贝数•BAC细菌人工染色体，可克隆100-300kb•抗性标记筛选转化子•PAC P1噬菌体人工染色体，容量介于两者之•多克隆位点便于插入片段间3大肠杆菌感受态细胞制备培养细菌在SOB或LB培养基中培养至对数生长期（OD600约为

0.4-

0.6）冰浴处理置于冰浴中30分钟，降低细胞膜流动性CaCl₂处理在冰浴中用含CaCl₂的缓冲液洗涤，改变细胞膜通透性冷冻保存添加甘油，分装后速冻，-70℃长期保存感受态细胞是指能够吸收外源DNA的细胞，是分子克隆的重要工具大肠杆菌感受态细胞制备原理是通过低温和二价阳离子处理，改变细菌细胞壁和细胞膜的通透性，使其能够吸收外源DNA分子感受态细胞制备质量的检测通常通过转化效率来评估，计算方法为每微克质粒DNA产生的转化子数量高效感受态细胞的转化效率通常在10⁸-10⁹CFU/μg DNA影响转化效率的因素包括菌株种类（常用DH5α、JM109等）、细菌生长阶段、CaCl₂浓度和处理时间、操作温度控制等质粒转化技术DNA与感受态细胞混合将质粒DNA与感受态细胞在冰上混合，孵育30分钟热激处理42°C热激30-90秒，促进DNA进入细胞冰浴回复迅速转回冰浴，孵育2分钟培养回复加入SOC培养基，37°C振荡培养1小时平板筛选涂布在含抗生素的琼脂平板上，培养过夜质粒转化是将外源质粒DNA导入宿主细胞的过程，是分子克隆的核心步骤热激法是最常用的转化方法，其原理是通过热处理暂时增加细胞膜通透性，促进DNA进入细胞电转法是另一种高效转化方法，通过短暂的高压电脉冲在细胞膜上形成临时孔洞，使DNA进入细胞与热激法相比，电转法转化效率更高（可达10¹⁰-10¹¹CFU/μg DNA），但需要专门的电穿孔仪器和去离子处理的DNA样品转化效率的计算公式为转化子数量÷DNA量（μg）×稀释倍数=CFU/μg DNA质粒小量提取DNA菌体收集与裂解离心收集菌体，用含SDS和NaOH的缓冲液裂解细胞中和与除蛋白加入酸性缓冲液中和，使变性的染色体DNA和蛋白质形成沉淀质粒DNA纯化离心去除沉淀，从上清中用异丙醇或乙醇沉淀质粒DNA碱裂解法是最常用的质粒DNA小量提取方法，基于质粒DNA和染色体DNA在碱性条件下变性和复性行为的差异NaOH和SDS溶液裂解细胞并使DNA变性，随后的酸性中和使小分子的质粒DNA能够快速复性并保持溶解状态，而大分子染色体DNA和蛋白质则形成不溶性沉淀被去除商业化的质粒小提试剂盒通常采用硅胶膜柱吸附DNA的原理，在高盐条件下DNA吸附于柱子，经过洗涤后用低盐或无盐缓冲液洗脱质粒DNA质量检测包括紫外分光光度计测定浓度和纯度（OD260/OD280比值）、琼脂糖凝胶电泳评估完整性和纯度、限制性内切酶酶切验证质粒结构聚合酶链式反应（）原理PCR退火50-65°C，引物与模板DNA互补结合变性94-98°C加热，使双链DNA分离为单链延伸72°C，DNA聚合酶合成新链聚合酶链式反应（PCR）是体外扩增特定DNA片段的技术，通过温度循环和热稳定DNA聚合酶实现指数级扩增PCR反应体系包括模板DNA、一对引物、热稳定DNA聚合酶（通常是Taq聚合酶）、dNTPs、Mg²⁺和适当的缓冲液引物设计是PCR成功的关键，一般遵循以下原则引物长度通常为18-25个核苷酸；G+C含量40-60%；3端避免连续3个以上的G或C以防止非特异性扩增；避免引物自身或引物间互补序列形成二级结构；两引物Tm值相近（不超过5°C差异），通常为55-65°CPCR反应条件优化主要考虑退火温度（通常设为Tm-5°C）、Mg²⁺浓度（影响聚合酶活性和特异性）、退火和延伸时间、循环数（通常25-35个循环）等因素仪器与耗材PCRPCR仪器类型反应管选择酶与缓冲液传统PCR仪通过加热金属块实现温度变化，单管（

0.2ml或

0.5ml）适用于少量样品；DNA聚合酶种类Taq聚合酶（最常用，无常见型号有Bio-Rad T

100、Applied8连管或12连管便于多样品操作；96孔板校对功能）；高保真聚合酶（如Pfu、Q5等，Biosystems2720等梯度PCR仪可在一高通量实验首选材质通常为薄壁聚丙烯，具有3-5校对功能）；热启动聚合酶（降低次反应中设置不同退火温度，用于条件优化以确保热传导效率对于荧光定量PCR，需非特异性扩增）PCR缓冲液通常含有Tris-实时荧光定量PCR仪除温度控制外，还配选用透明度高或特定荧光兼容的专用管/板HCl、KCl、MgCl2等，不同聚合酶对应专用备荧光检测系统，可进行实时监测缓冲液，不可混用常见技术

（一）普通PCR PCR实验设计操作步骤目标片段选择根据研究目的确定扩增区域，•准备PCR反应体系（总体积通常为25或通常控制在5kb以内50μl）引物设计使用Primer Premier、Oligo等软•设置PCR程序初始变性（95°C，2-5分钟）件设计特异性引物，考虑退火温度、GC含量等因素•25-35个循环变性（95°C，30秒）→退火（55-65°C，30秒）→延伸（72°C，阳性对照选择已知能够扩增的模板作为阳1分钟/kb）性对照•最终延伸（72°C，5-10分钟）阴性对照不加模板的反应体系，用于检测•4°C保存污染结果分析通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物单一特异性条带表示扩增成功；多条带表示引物特异性不足；无条带可能是引物设计不当或反应条件不适通过与DNA标准物（Marker）比较确定PCR产物大小，判断是否为目标片段常见技术

（二）巢式PCR PCR目标片段第二轮PCR扩增的特异性片段内引物第二轮PCR使用，结合在第一轮产物内部外引物第一轮PCR使用，扩增较大区域巢式PCR是一种高灵敏度、高特异性的PCR技术，通过两轮连续的PCR反应实现第一轮使用外引物对大片段进行扩增，第二轮使用内引物（位于第一轮产物序列内部）进行再次扩增这种设计显著提高了扩增的特异性和灵敏度，可检测极低浓度的目标序列巢式PCR主要应用于检测低丰度目标序列（如病毒DNA检测）；特异性扩增复杂样品中的目标序列；提高扩增特异性，降低非特异性扩增实验设计注意事项两对引物要相互兼容，避免形成引物二聚体；第一轮PCR循环数通常少于常规PCR（15-25个循环）；第二轮PCR使用第一轮产物的稀释液作为模板，避免污染；设置适当对照，特别是阴性对照，监控交叉污染最大的风险是污染问题，需严格分区操作，并使用UNG系统等抗污染措施常见技术

（三）反转录PCR PCRRNA样品准备提取高质量的总RNA或mRNA，避免RNase污染反转录反应利用反转录酶将RNA转换为cDNAPCR扩增使用特异性引物扩增目标cDNA片段结果分析通过琼脂糖凝胶电泳或实时荧光定量分析反转录PCR（RT-PCR）是研究基因表达的重要技术，通过反转录酶将RNA转化为cDNA，再进行PCR扩增反转录反应使用的引物有三种类型随机引物（可反转录所有RNA类型，但特异性较低）；OligodT引物（特异结合mRNA的polyA尾巴，不适用于降解的RNA）；基因特异性引物（只反转录目标RNA，特异性最高但效率较低）常用的反转录酶包括M-MLV反转录酶（低RNase H活性，适合合成长cDNA）；AMV反转录酶（热稳定性好，适合结构复杂的RNA模板）；SuperScript系列（工程改造酶，性能更稳定）反转录反应体系包括RNA模板、引物、dNTPs、反转录酶、RNase抑制剂和适当的缓冲液RT-PCR广泛应用于基因表达分析、克隆全长cDNA、检测RNA病毒和微小RNA研究等领域结果分析时需设置反转录阴性对照（不加反转录酶）排除基因组DNA污染的干扰常见技术

（四）实时荧光定量PCR PCR产物纯化技术PCR凝胶回收法柱层析法将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳利用硅胶膜在高盐条件下特异性分离，切取目标条带，使用溶胶吸附DNA的原理，直接将PCR产试剂溶解琼脂糖，再通过硅胶膜物与结合缓冲液混合，通过硅胶柱吸附DNA并洗脱适用于存在柱纯化操作简便，回收率高多条带的PCR产物，可获得高纯（70-90%），但不能去除与目标度的目标片段，但操作复杂且回片段大小相近的非特异性产物收率较低（通常50-70%）常用于单一条带PCR产物的快速纯化磁珠法利用带正电荷的磁性微球在PEG存在下特异性吸附DNA，通过磁力分离和洗涤去除杂质操作方便，易于自动化，回收率高，可选择性去除引物和dNTPs随着自动化设备的普及，磁珠法正成为高通量实验的首选方法测序技术

（一）测序DNA Sanger原理介绍实验流程与应用Sanger测序，又称链终止法，基于DNA聚合过程中掺入双脱氧核实验流程包括模板制备（质粒DNA或PCR产物）→测序反应（包苷酸（ddNTPs）终止DNA合成的原理在反应体系中同时含有含模板、引物、DNA聚合酶、dNTPs和荧光ddNTPs）→产物纯化dNTPs和荧光标记的ddNTPs，当ddNTP随机掺入新合成的DNA链（去除未掺入的dNTPs和ddNTPs）→毛细管电泳分离→数据采集时，合成反应终止，形成不同长度的DNA片段与分析通过毛细管电泳分离这些片段，根据它们的长度和荧光颜色，可Sanger测序主要应用于基因克隆验证、PCR产物测序、单核苷以确定DNA序列现代自动化Sanger测序仪使用四种不同荧光标酸多态性（SNP）分析、基因突变检测等尤其适合于中小规模记的ddNTPs，可在单一反应管中完成全部反应测序项目和需要高准确性的应用场景Sanger测序的局限性单次读长有限（通常为700-900bp）；通量低，成本高，不适合全基因组测序；对混合样本敏感性差，难以检测低频率变异；模板要求高，不适合高GC含量或具有复杂二级结构的区域尽管有这些局限，Sanger测序因其高准确度（错误率低于

0.001%）仍被视为DNA测序的金标准，常用于验证其他测序技术的结果测序技术

（二）高通量测序DNAIllumina测序平台长读长测序技术文库构建与数据分析基于边合成边测序原理，使用可逆终止的代表有PacBio SMRT技术和Oxford文库构建是高通量测序的关键步骤，包括荧光标记核苷酸特点是读长短（通常75-Nanopore技术PacBio利用单分子实时测DNA片段化、末端修复、接头连接、PCR扩300bp）但产出高，每次运行可产生数百Gb序，读长可达数万bp；Nanopore通过检测增等步骤数据分析流程通常包括原始数数据，错误率约

0.1%，主要是替换错误DNA通过纳米孔时的电流变化确定碱基，理据质控→比对到参考基因组→变异检测→功适用于重测序、转录组、外显子组等应用论上读长无上限这些技术适用于基因组组能注释数据可视化随着测序数据量增加，→装、结构变异检测等领域生物信息分析已成为测序项目的瓶颈原核表达系统原核表达系统是生产重组蛋白最常用的系统，主要基于大肠杆菌（E.coli）常用表达载体包括pET系列（受T7启动子控制，表达量大）、pGEX系列（GST融合表达）、pMAL系列（MBP融合表达）和pBAD系列（阿拉伯糖诱导）等表达调控元件包括启动子（决定表达强度和调控方式）、核糖体结合位点（RBS，影响翻译效率）、终止子（转录终止信号）和复制起点（控制质粒拷贝数）宿主菌株选择考虑因素表达能力（BL21系列适合高水平表达）；抑制状态（DE3菌株含有T7RNA聚合酶基因）；蛋白折叠和修饰能力（Origami菌株有利于二硫键形成；Rosetta菌株含有稀有tRNA基因）原核表达系统的优势是生长快、成本低、操作简便、表达量高；但缺点是无法进行复杂的翻译后修饰，蛋白可能形成包涵体真核表达系统哺乳动物细胞表达系统酵母表达系统常用细胞系包括HEK

293、CHO、主要基于酿酒酵母（S.cerevisiae）COS等优势产生的蛋白具有完整和甲醇营养型酵母（P.pastoris）的翻译后修饰（糖基化、磷酸化等）；兼具原核生物生长快和真核生物能进蛋白折叠正确；适合膜蛋白和分泌蛋行翻译后修饰的优势P.pastoris系白表达缺点培养成本高；生长周统使用甲醇诱导的AOX1启动子，表期长；表达量相对较低；操作复杂达量高，适合大规模发酵生产适用常用载体含有CMV、SV40等强启动于分泌蛋白和膜蛋白表达，已广泛应子，以及新霉素或嘌呤霉素等筛选标用于工业和药物蛋白生产记昆虫杆状病毒表达系统利用杆状病毒（如苜蓿多角体病毒）感染昆虫细胞（Sf

9、Sf21或High Five）表达外源蛋白表达载体含有强力的多角体蛋白启动子，在感染后期驱动大量表达优势表达量高；翻译后修饰接近哺乳动物；适合多亚基复合物表达广泛用于结构生物学研究和疫苗开发重组蛋白表达诱导与优化IPTG诱导自动诱导系统与表达优化IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）是乳糖的类似物，用于诱导lac自动诱导系统是一种不需要监测菌液浓度和人工添加诱导剂的表启动子或其衍生物（如T7启动子）控制的基因表达与乳糖不同，达方法培养基中同时含有葡萄糖、乳糖和甘油，菌体优先利用IPTG不会被细胞代谢，因此可维持稳定的诱导效果葡萄糖，当葡萄糖耗尽后，自动转向代谢乳糖，从而诱导目标蛋白表达优点是操作简便，产量稳定，特别适合高通量表达筛选典型的IPTG诱导流程培养菌液至对数生长期（OD600约

0.6-

0.8）→加入IPTG（终浓度通常为

0.1-

1.0mM）→在适当温度继续培养数小时→收集菌体IPTG浓度过高可能导致蛋白过度表达形成包表达条件优化策略降低培养温度（如16-30°C）可减少包涵体形涵体成；调整诱导剂浓度和诱导时间；优化培养基成分（如添加稀有氨基酸）；考虑使用分子伴侣共表达；选择合适的融合标签增加蛋白可溶性重组蛋白纯化

（一）亲和层析95%6-8单步纯化效率常用His标签长度亲和层析法可实现的典型蛋白纯度N端或C端融合的组氨酸残基数量26kDaGST标签大小谷胱甘肽-S-转移酶标签的分子量亲和层析是基于目标蛋白与特定配体之间的特异性相互作用进行纯化的技术，是重组蛋白纯化的最常用方法His标签纯化是最广泛应用的亲和纯化方法，基于组氨酸残基与镍离子或钴离子的特异性结合纯化步骤包括平衡柱子→上样→洗涤去除非特异性结合蛋白→使用咪唑竞争洗脱目标蛋白此方法操作简便，可在变性或非变性条件下进行，但有时可能影响蛋白活性GST标签纯化利用谷胱甘肽-S-转移酶与谷胱甘肽的高亲和力GST融合蛋白可与固定化的谷胱甘肽特异性结合，使用过量谷胱甘肽洗脱GST标签较大（26kDa），可增加融合蛋白的可溶性，但可能影响目标蛋白的功能，通常需要通过蛋白酶切除抗体亲和纯化利用抗原与抗体的特异性结合，是纯化天然蛋白的理想选择抗体通常固定在蛋白A、蛋白G或CNBr活化的琼脂糖凝胶上这种方法特异性极高，但成本较高，且酸性洗脱条件可能影响部分蛋白的活性重组蛋白纯化

（二）离子交换层析选择离子交换介质根据蛋白等电点选择阳离子或阴离子交换树脂平衡柱子使用低盐起始缓冲液平衡色谱柱样品上样确保样品pH和离子强度适合蛋白结合洗涤与洗脱逐渐增加盐浓度进行梯度洗脱离子交换层析是基于蛋白质表面电荷与带相反电荷的固相介质之间的可逆结合根据固相介质的电荷性质分为阳离子交换（负电荷介质结合带正电荷的蛋白）和阴离子交换（正电荷介质结合带负电荷的蛋白）蛋白质表面电荷取决于其等电点（pI）和溶液pH当pHpI时，蛋白带负电荷，适合阴离子交换操作通常选择pH值比目标蛋白pI低2个单位（阳离子交换）或高2个单位（阴离子交换）的缓冲液离子交换层析的优化包括调整起始缓冲液pH和离子强度；选择合适的洗脱梯度（线性或阶梯式）；调节流速和样品载量作为高分辨率的纯化方法，离子交换层析常用于进一步纯化亲和层析后的样品，去除杂质蛋白和内毒素重组蛋白纯化

（三）凝胶过滤层析样品浓缩将样品浓缩至总体积不超过柱床体积的2%样品过滤使用

0.22μm滤膜过滤样品，去除不溶性颗粒上样小心上样到预平衡的凝胶过滤柱洗脱使用恒定流速洗脱，根据洗脱体积收集蛋白峰凝胶过滤层析（又称分子筛层析或体积排阻层析）是根据分子大小分离蛋白质的方法其原理是大分子无法进入填料多孔结构内部，因此通过较短路径快速洗脱；而小分子可以进入孔隙，通过较长路径缓慢洗脱这一特性使得蛋白质按分子量大小依次洗脱大分子先出，小分子后出凝胶过滤介质种类丰富，如Sephadex（交联葡聚糖）、Sepharose（琼脂糖）和Superdex（葡聚糖与琼脂糖的复合物）等，可根据分离需求选择不同孔径范围的介质Superdex75适合分离分子量10-70kDa的蛋白，Superdex200适合分离30-600kDa的蛋白凝胶过滤不仅用于蛋白纯化的最后抛光步骤，还广泛应用于分子量测定；蛋白复合物形成分析；缓冲液交换（脱盐）；去除小分子杂质和聚集体操作要点是控制样品体积（不超过柱体积的2%）和保持恒定低流速（通常为

0.5-1ml/min），以获得最佳分辨率蛋白质电泳技术

（一）SDS-PAGE染色与分析电泳考马斯亮蓝染色或银染后观察蛋白条带胶的制备恒压条件下（通常80-120V）进行电泳样品制备配制分离胶（通常8-15%）和浓缩胶（通常与含SDS和β-巯基乙醇的上样缓冲液混合并5%）煮沸SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是最常用的蛋白质分析方法，基于变性条件下蛋白质按分子量分离的原理SDS作为强阴离子去垢剂，可破坏蛋白质的非共价键，并以恒定比例（约

1.4g SDS/g蛋白）结合蛋白质，使蛋白带有均一的负电荷同时，β-巯基乙醇或DTT还原二硫键，进一步破坏蛋白质的三级结构在这种条件下，蛋白质分子的电荷与质量比基本恒定，电泳迁移率主要取决于分子量大小通常采用不连续电泳系统pH

6.8的浓缩胶使蛋白在电场作用下形成窄带；pH

8.8的分离胶根据分子量大小分离蛋白结果分析与分子量标准物比较确定目的蛋白分子量；条带清晰度反映蛋白纯度；染色强度可进行半定量分析显色方法包括考马斯亮蓝染色（简便但灵敏度较低，检测下限约

0.1-

0.5μg蛋白）；银染（灵敏度高，可检测纳克级蛋白）；荧光染料（如SYPRO Ruby，兼具高灵敏度和宽线性范围）蛋白质电泳技术

（二）等电聚焦电泳等电聚焦电泳（IEF）是根据蛋白质等电点（pI）不同进行分离的技术，利用两性电解质在电场中形成稳定pH梯度的原理每种蛋白质都有特定的等电点，当蛋白质迁移到pH值等于其pI的位置时，蛋白质净电荷为零，停止迁移并被聚焦现代IEF通常使用固定pH梯度（IPG）胶条，相比传统两性电解质载体两性电解质的方法，IPG胶条提供更稳定的pH梯度和更高的重复性实验步骤包括IPG胶条复水（含样品和两性电解质）→电聚焦（通常需要10-24小时，先低压后高压）→平衡处理（用含SDS和还原剂的缓冲液处理，为第二向电泳做准备）IEF不仅是二维电泳的第一向分离，还广泛应用于蛋白质纯度检测（单一蛋白应聚焦为单一条带）；蛋白等电点测定；蛋白亚型和翻译后修饰分析（如磷酸化会改变pI值）；蛋白质分离纯化（制备型IEF）蛋白质电泳技术

（三）二维电泳原理与流程样品制备图像分析二维电泳结合了等电聚关键步骤是有效溶解蛋使用专业软件（如焦（第一向，按等电点白质并去除干扰物质PDQuest、分离）和SDS-PAGE样品裂解液通常含有脲ImageMaster等）分析（第二向，按分子量分（8M）和硫脲（2M）凝胶图像蛋白质斑点离），实现蛋白质在两作为变性剂，CHAPS作检测→匹配不同凝胶间个独立参数上的分离为去垢剂，DTT作为还的斑点→定量分析→鉴这种正交分离方式具有原剂，以及IPG缓冲液定差异表达斑点差异极高的分辨率，理论上前处理方法包括TCA-丙斑点可切胶回收，经胰可分辨数千种蛋白质酮沉淀和兼容试剂盒法蛋白酶消化后，用质谱等技术鉴定蛋白质身份技术Western blot蛋白质分离SDS-PAGE分离蛋白质混合物转膜电转法将蛋白从凝胶转至PVDF或硝酸纤维素膜封闭用BSA或脱脂牛奶阻断非特异性结合抗体孵育与检测一抗和二抗孵育，ECL或其他方法显影Western blot（蛋白质印迹法）是一种特异性检测复杂样品中目标蛋白的技术，结合了SDS-PAGE的分离能力和抗原-抗体反应的特异性转膜步骤通常采用半干法或湿转法，将凝胶中的蛋白质转移到固相膜上常用膜有PVDF膜（疏水性强，蛋白结合力高，适合后续分析）和硝酸纤维素膜（背景低，适合ECL检测）抗体孵育包括一抗（特异识别目标蛋白）和二抗（结合一抗，通常偶联HRP或荧光团）两步检测方法主要有化学发光法（ECL，最常用，灵敏度高）；比色法（如DAB显色，直观但灵敏度低）；荧光法（多重检测优势，定量准确性高）结果分析与优化条带分子量与预期一致表明检测特异；信号强度可进行相对定量分析（通常需内参如β-actin或GAPDH校正）常见问题及解决方案背景高（增加封闭时间或洗涤强度）；无信号（检查抗体浓度和孵育条件）；多条带（优化抗体稀释或更换特异性更高的抗体）免疫沉淀技术样品制备抗体孵育1非变性条件下裂解细胞或组织加入特异性抗体与目标蛋白结合洗涤与洗脱蛋白A/G捕获去除非特异性结合蛋白，洗脱目标蛋白加入蛋白A/G磁珠或琼脂糖沉淀抗体-蛋白复合物免疫沉淀（IP）是利用抗原-抗体特异性反应从复杂样品中分离特定蛋白的技术其基本原理是特异性抗体与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物，再通过蛋白A/G（能结合大多数IgG的Fc段）将复合物沉淀，实现目标蛋白的富集和纯化免疫沉淀关键步骤包括选择高特异性抗体（单克隆通常特异性更高）；优化裂解条件（应保持蛋白质天然构象和相互作用）；控制抗体用量（过多会增加非特异性，过少则沉淀不完全）；严格的洗涤条件（平衡特异性沉淀和背景降低）IP广泛应用于蛋白质相互作用研究（共免疫沉淀，Co-IP）；蛋白质翻译后修饰分析（如磷酸化IP）；蛋白质纯化和富集；染色质免疫沉淀（ChIP，研究蛋白质与DNA的相互作用）；RNA免疫沉淀（RIP，研究蛋白质与RNA的相互作用）酶联免疫吸附测定（）ELISA直接法ELISA将抗原直接包被于微孔板，加入酶标记的特异性抗体，发色底物显色操作最简便但灵敏度较低，抗体需标记酶间接法ELISA将抗原包被于微孔板，依次加入一抗和酶标二抗，发色底物显色灵敏度较高，可使用相同的酶标二抗检测不同一抗，但步骤较多夹心法ELISA将捕获抗体包被于微孔板，加入样品后再加入酶标检测抗体，发色底物显色特异性和灵敏度最高，适合检测复杂样品中的抗原，但需要两种识别不同表位的抗体竞争法ELISA样品中抗原与已知量的酶标抗原竞争有限的抗体结合位点，信号强度与样品中抗原量成反比适合检测小分子抗原或低浓度样品细胞培养基础无菌操作技术所有细胞培养操作应在超净工作台中进行，操作前用75%酒精消毒工作台表面和物品培养基和试剂应进行灭菌或无菌过滤，避免交叉污染操作培养基选择2者应穿隔离服，戴手套，熟练掌握无菌技术和防污染措施常用基础培养基包括DMEM、RPMI

1640、MEM等，根据细胞类型选择完全培养基通常添加10%胎牛血清（FBS）、1%抗生素（青霉素-链霉素）细胞传代与冻存和其他特定生长因子无血清培养基适用于特定实验需求，可减少血清成3分带来的干扰贴壁细胞传代通常使用胰蛋白酶-EDTA消化，悬浮细胞可直接分装传代比例和频率根据细胞生长特性确定细胞冻存通常使用含10%DMSO的培养基，采用程序降温或细胞冻存盒，最终存储于液氮中复苏时应快速解冻并立即稀释DMSO，以减少细胞毒性细胞转染技术脂质体转染电穿孔法与病毒介导转染利用阳离子脂质体与带负电荷的核酸形成复合物，促进其穿过细电穿孔法是通过短暂的高压电脉冲在细胞膜上形成瞬时孔洞，使胞膜代表产品有Lipofectamine系列、FuGENE HD等优点是操核酸进入细胞适用于难转染细胞类型，如淋巴细胞、干细胞和作简便，效率较高，适用于多种细胞类型；缺点是对某些细胞原代细胞优点是效率高，可同时转染多种核酸；缺点是需要专（如原代细胞）效率较低，且脂质体可能有细胞毒性门设备，且可能造成较高细胞死亡率操作步骤细胞铺板（通常50-70%汇合度）→DNA/RNA与转染试病毒介导转染利用病毒的感染机制将外源基因导入细胞，包括腺剂分别稀释→混合并孵育形成复合物→加入细胞→培养24-72小时病毒、慢病毒和逆转录病毒系统优势是转导效率高，可实现稳检测表达转染效率可通过荧光蛋白（如GFP）或报告基因系统评定整合和长期表达，适用于几乎所有细胞类型；缺点是制备复杂，估安全要求高，载量有限制慢病毒包装与感染质粒准备包括含目的基因的转移质粒和包装质粒包装细胞转染通常使用HEK293T细胞共转染所有质粒病毒收集转染后48-72小时收集培养上清病毒浓缩与滴定超速离心浓缩病毒并确定滴度靶细胞感染使用适当MOI感染靶细胞慢病毒源自HIV-1，被改造为基因传递的有效工具与其他病毒载体相比，慢病毒能够感染分裂和非分裂细胞，可容纳较大插入片段（约8kb），且能实现长期稳定表达现代慢病毒系统是第三代自灭活系统，包括三个或四个独立质粒转移质粒（含目的基因和病毒包装信号）；包装质粒（提供结构蛋白Gag-Pol）；包膜质粒（提供VSV-G包膜蛋白）；调控质粒（在四质粒系统中提供Rev蛋白）病毒滴度确定方法包括p24ELISA法（定量病毒核心蛋白）；荧光标记法（使用荧光蛋白报告基因）；qPCR法（定量病毒基因组）感染效率优化策略添加聚阳离子（如聚凝胺）促进病毒吸附；使用适当MOI（感染复数，通常为1-10）；向培养基添加protamine sulfate降低带负电荷的多糖对病毒的排斥流式细胞术荧光显微镜技术原理介绍样品制备荧光显微镜利用特定波长光激发荧光细胞固定通常使用4%多聚甲醛（保持分子，再收集其发射的较长波长荧光细胞结构）或甲醇/丙酮（增加膜通关键组件包括光源（汞灯、氙灯或透性）免疫荧光染色包括封闭非LED）；激发滤光片（选择特定波长特异性位点→一抗孵育→荧光标记二激发光）；二向色镜（将激发光反射抗孵育→核染料（如DAPI）染色→抗到样品，允许发射光通过）；发射滤淬灭封片剂封片活细胞成像要求保光片（仅允许特定波长荧光通过）；持合适的温度、pH和气体环境，常使探测器（眼睛、相机或CCD）用特殊的活细胞成像培养室图像采集与分析多通道荧光成像要注意避免荧光通道串扰，选择光谱分离良好的荧光团Z-stack成像可获得三维信息，与时间序列结合可实现4D成像图像分析软件（如ImageJ、CellProfiler等）可实现细胞计数、荧光强度测量、共定位分析和形态学分析等功能定量分析时注意背景校正和阳性/阴性对照设置共聚焦显微镜技术原理介绍应用领域图像处理技巧共聚焦显微镜的核心原理是使用针孔光阑，共聚焦显微镜最大的优势是能获取高质量的共聚焦图像处理常用操作包括去卷积（提只允许来自焦平面的光通过，排除了焦平面光学切片，通过Z轴扫描可重建样品的三维高分辨率和信噪比）；背景校正（去除自发外的模糊信号激光激发光聚焦到样品的单结构广泛应用于细胞内蛋白定位和共定荧光和非特异信号）；三维重建（通过Z-一点，发射光通过针孔后被光电倍增管检测位分析；活细胞动态过程成像；基于荧光的stack序列构建3D模型）；线扫描分析（测通过扫描获取整个视野的像素点信息，形成分子互作研究（如FRET、FRAP）；组织和量荧光强度分布）；共定位分析（定量两种高分辨率的光学切片图像器官的三维结构成像；多色荧光标记的复杂荧光信号的重叠程度）应避免过度增强对样品观察比度导致图像失真细胞凋亡检测技术细胞凋亡是一种程序性细胞死亡过程，特征包括细胞皱缩、膜磷脂翻转、DNA断裂和凋亡小体形成等Annexin V/PI双染法是最常用的凋亡检测方法，基于磷脂酰丝氨酸（PS）在凋亡早期从细胞膜内侧翻转到外侧的特性Annexin V能特异结合PS，而PI只能进入膜完整性受损的细胞通过流式细胞术分析可区分正常细胞（Annexin V-/PI-）、早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）、晚期凋亡/死亡细胞（Annexin V+/PI+）TUNEL（TdT-mediated dUTPNick-End Labeling）法检测凋亡过程中产生的DNA断裂，利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）将标记的dUTP添加到DNA断裂的3-OH末端该方法适用于组织切片和细胞涂片，可通过荧光显微镜、流式细胞术或酶联免疫检测进行分析特点是灵敏度高，但特异性不如Annexin V法Caspase活性检测是基于凋亡过程中Caspase蛋白酶级联激活的原理常用方法包括荧光底物法（使用含荧光基团的特异性底物）；Western blot检测Caspase切割；免疫组化/免疫荧光法检测活化的Caspase；抑制剂实验验证Caspase在凋亡中的作用细胞周期分析细胞增殖与毒性检测3-51-4小时小时MTT法典型的孵育时间CCK-8法典型的孵育时间2小时EdU法典型的掺入时间细胞增殖与毒性检测是评价细胞生长状态和药物/化合物对细胞影响的重要方法MTT法基于活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能将水溶性黄色MTT还原为不溶性蓝紫色甲臜的原理实验步骤细胞培养→加入待测物质处理→加入MTT溶液（通常

0.5mg/ml）→孵育3-5小时→加入DMSO溶解甲臜→测定490nm吸光度MTT法简便经济，但终点检测需终止实验，不适合连续监测CCK-8法（又称WST-8法）原理类似于MTT，但产生的甲臜是水溶性的，无需溶解步骤，操作更简便其优点是灵敏度高（约为MTT的10倍），反应时间短（1-4小时），产物稳定性好特别适合高通量筛选和连续监测细胞状态EdU掺入法检测DNA合成活性，是评价细胞增殖的直接方法基于5-乙炔基-2-脱氧尿苷（EdU）作为胸腺嘧啶类似物掺入新合成DNA的原理，通过点击化学反应将荧光染料与EdU共价结合相比传统的BrdU方法，EdU检测无需DNA变性，操作更简便，信号更清晰可通过荧光显微镜、流式细胞术或酶标仪定量分析EdU阳性细胞比例染色体制备与核型分析细胞培养与处理培养处于分裂期的细胞，通常使用PHA刺激淋巴细胞分裂中期阻断加入秋水仙碱阻断细胞在中期分裂相低渗处理使用低渗溶液（如

0.075M KCl）处理，使染色体分散G显带与分析胰蛋白酶处理后Giemsa染色，形成特征性条带染色体核型分析是细胞遗传学的基础方法，用于研究染色体数目和结构异常中期分裂相制备是关键步骤，因为此时染色体高度压缩，便于观察秋水仙碱通过阻断微管形成，使细胞停留在中期低渗处理使细胞吸水膨胀，染色体分散更易观察固定液（通常为甲醇:冰醋酸=3:1）能保存染色体结构并增加染色效果G显带技术是最常用的染色体分带方法，通过胰蛋白酶轻度消化染色体，然后用Giemsa染料染色，产生特征性的明暗相间条带异染色质（富含AT的基因贫乏区）显深色，常染色质（富含GC的基因富集区）显浅色其他分带技术包括C显带（显示着丝粒异染色质）；Q显带（喹啉类荧光染料分带）；R显带（G显带的反转图像）核型分析通常按照染色体大小、臂比、显带模式将染色体对排列，检测数目和结构异常人类正常核型为46,XX（女性）或46,XY（男性）常见异常包括数目异常（如三体、单体）；结构异常（如易位、缺失、倒位、重复等）现代核型分析常结合FISH和分子细胞遗传学技术，提高分辨率和检测特定异常的能力荧光原位杂交（）FISH原理介绍探针设计与实验步骤荧光原位杂交（FISH）是利用荧光标记的核酸探针与目标DNA或常用探针类型包括全染色体涂抹探针（识别整条染色体）；着RNA序列特异性杂交的技术探针结合到样品中的互补序列后，丝粒探针（识别特定染色体着丝粒）；座位特异性探针（靶向特通过荧光显微镜观察基本原理包括样品变性（双链DNA分离定基因或DNA序列）；端粒探针（识别染色体末端）；BAC克隆为单链）探针杂交（探针与目标序列互补结合）洗涤（去除探针（覆盖较大基因组区域）探针标记方法主要有直接标记→→非特异性结合）荧光检测（通常在荧光显微镜或数字成像系统（荧光团直接连接到核酸）；间接标记（先结合标签如生物素或→下观察）地高辛，再通过荧光标记的抗体或链霉亲和素检测）FISH的分辨率范围从整条染色体到单一基因，取决于探针设计和样品制备通常包括细胞固定、染色体铺片或组织切片制备、必要检测系统的预处理（如蛋白酶K消化）FISH广泛应用于细胞遗传学和分子生物学研究染色体异常检测（数目和结构异常）；基因定位和染色体图谱构建；基因扩增和缺失检测；基因融合检测（如癌症中的融合基因）；mRNA表达和定位分析（RNA-FISH）；细菌和病毒检测多色FISH通过使用不同荧光标记的探针，可同时检测多个目标定量FISH（Q-FISH）可测量如端粒长度等特征现代FISH技术与其他细胞和分子技术结合，如免疫荧光-FISH、光学显微解剖等，提供了更详细的基因表达和调控信息基因敲除技术靶点选择与设计1选择合适的基因区域，设计sgRNA或同源臂导入细胞转染或病毒转导将基因编辑系统导入细胞筛选抗生素筛选或荧光分选富集编辑细胞验证PCR、测序、Western blot等方法验证敲除效果基因敲除是指通过分子生物学技术完全消除基因功能的方法传统的同源重组技术利用细胞内源性的DNA修复机制，通过设计含有同源序列的敲除载体，使目的基因被选择标记替换或中断虽然特异性高，但效率低（通常1%），筛选过程复杂，主要用于小鼠等模式生物的基因敲除CRISPR/Cas9系统革命性地简化了基因敲除过程其核心组件包括Cas9核酸酶和单导向RNA（sgRNA）sgRNA引导Cas9酶结合到特定DNA序列并切割，产生双链断裂细胞通过非同源末端连接（NHEJ）修复这一断裂，常常引入小的插入或缺失突变（indels），导致阅读框移位和基因功能丧失与传统方法相比，CRISPR/Cas9具有效率高、操作简便、可同时靶向多个基因（多重敲除）等优势敲除效果验证方法包括基因组PCR和测序（检测基因组水平的变化）；RT-PCR和qPCR（检测mRNA水平变化）；Western blot（检测蛋白水平变化）；功能分析（验证表型变化）常见的筛选策略包括抗生素筛选、荧光蛋白报告、限制性酶切分析和T7E1酶切分析等基因敲入技术同源重组介导CRISPR/Cas9介导供体DNA设计传统的基因敲入方法，利结合CRISPR/Cas9和HDR供体DNA设计是敲入成功用细胞同源重组修复机制（同源定向修复）的敲入的关键常用形式包括需设计含长同源臂（通常策略Cas9在特定位点切双链DNA载体（适合大片1kb）的敲入载体，包含割DNA产生双链断裂，同段插入）；单链寡核苷酸目的基因和选择标记优时提供含目的序列和短同（适合小修饰，如点突点是特异性高，精确插入；源臂（通常50-200bp）的变）；双链寡核苷酸缺点是效率低（通常供体DNA作为修复模板（PCR产物，平衡效率和1%），构建载体复杂相比传统方法效率提高5-大小）设计要点同源主要用于生成转基因动物10倍，且操作更简便可臂长度合适，避开sgRNA和稳定细胞系通过优化sgRNA设计、增切割位点，考虑添加选择加供体浓度和抑制NHEJ通标记和筛选策略无痕敲路进一步提高效率入需要设计去除选择标记的策略，如Cre/loxP系统条件性基因敲除技术组织特异性敲除1在特定组织中实现基因功能缺失时间可控性敲除在特定发育阶段激活基因敲除系统性基因功能研究3解决传统完全敲除的胚胎致死问题条件性基因敲除技术是解决常规基因敲除导致胚胎致死或全身表型干扰的重要手段，允许研究者在特定时间和特定组织中敲除目的基因Cre/loxP系统是最常用的条件性基因敲除工具Cre重组酶来源于P1噬菌体，能够识别loxP序列（34bp特异性序列）并介导其间的DNA片段重组通常将目的基因的关键外显子用两个同向loxP位点包围（floxed），当Cre表达时，loxP之间的序列被切除，导致基因失活实现条件性敲除的策略包括组织特异性启动子驱动Cre表达（如Alb-Cre特异在肝脏表达）；诱导型Cre系统（如CreER与他莫昔芬联合使用，实现时间控制）；病毒介导的Cre表达（如AAV-Cre通过局部注射实现部位特异性敲除）Flp/FRT系统基于类似原理，来源于酵母，是Cre/loxP的替代或补充工具诱导型基因表达调控系统主要包括Tet-On/Tet-Off系统（四环素控制）；ER-LBD系统（雌激素受体配体结合域，通过他莫昔芬调控）；化学诱导的二聚体系统（如Shield系统）这些系统在条件性敲除、过表达和基因治疗研究中发挥重要作用，使研究者能够精确控制基因表达的时空模式干扰技术RNAsiRNA介导shRNA介导化学合成的短双链RNA（通常21-23nt），短发夹RNA，通过质粒或病毒载体表达，直接转染细胞，迅速产生沉默效果（24-在细胞内被Dicer酶处理为siRNA优点72小时）优点是设计简便，效果迅速；是可持续表达，适合稳定敲低和长期实缺点是持续时间短，适合短期实验和高验；缺点是构建和筛选过程较复杂常通量筛选可通过化学修饰增强稳定性用表达系统包括U6/H1启动子驱动的组和降低脱靶效应成功的siRNA设计考虑成型表达；Tet调控的诱导型表达；组织因素GC含量平衡（30-60%）；3端稳特异性启动子驱动的条件表达病毒载定性；避免重复序列；避免已知miRNA体（如慢病毒、腺病毒）增强转导效率种子序列实验设计与效果评估关键控制实验阴性对照（非靶向序列或scramble序列）；阳性对照（已知有效的siRNA）；未处理对照；验证多个靶向不同区域的siRNA敲低效果评估RT-qPCR检测mRNA水平（通常要求70%敲低）；Western blot检测蛋白水平；功能性实验验证表型变化常见问题包括脱靶效应、免疫反应和敲低效率不足，可通过优化设计、剂量控制和递送系统改进解决基因组编辑技术TALEN技术CRISPR/Cas9技术转录激活因子样效应物核酸酶TALENs是一种融合蛋白，由DNA CRISPR/Cas9源自细菌获得性免疫系统，由Cas9蛋白和单导向结合结构域和FokI核酸酶结构域组成TALE结构域源自植物致病RNAsgRNA组成sgRNA含有与靶序列互补的20个核苷酸和菌，含有重复序列，每个重复识别一个特定碱基设计TALEN需Cas9结合所需的骨架结构靶位点选择仅需满足PAM序列通常为构建特定的重复阵列，通常使用Golden Gate克隆法NGG要求TALEN工作原理是两个TALEN单体以相反方向结合DNA，使FokI CRISPR/Cas9因其简便性、多靶点编辑能力和高效率迅速成为主二聚化产生双链断裂特点是特异性高，脱靶效应少，但构建复流编辑工具改良版包括Cas9昵酶单链切割、dCas9失活杂，蛋白较大，转染效率受限Cas9，用于基因调控、高保真Cas9降低脱靶和小型Cas9提高递送效率Base editing技术是基因组编辑的新方向，无需产生双链断裂，直接在DNA或RNA水平上实现碱基转换主要包括胞嘧啶碱基编辑器CBE，C→T转换、腺嘌呤碱基编辑器ABE，A→G转换和质子RNA编辑器对RNA进行编辑这些技术在治疗单碱基突变疾病方面显示出巨大潜力，大大降低了基因编辑的风险单细胞测序技术单细胞分离通过流式分选、微流控芯片或手工挑取获得单个细胞细胞裂解与核酸扩增裂解单细胞并进行全基因组/转录组扩增文库构建制备适合测序平台的DNA/RNA文库高通量测序使用次世代测序平台进行深度测序生物信息分析数据处理、细胞聚类、差异基因分析等单细胞测序技术突破了传统混池测序的局限，能够揭示细胞间的异质性样品制备是关键环节，常用单细胞分离方法包括流式细胞分选法（FACS，高通量但可能损伤细胞）；微流控技术（如10x Genomics平台，兼顾通量和细胞完整性）；激光捕获显微切割（高精度选择但通量低）；限制稀释法（简便但效率低）单细胞RNA测序（scRNA-seq）是最成熟的单细胞组学技术，主流方法有Smart-seq2（全长转录本覆盖但成本高）；10x GenomicsChromium（高通量、成本适中，但仅测3末端）；Drop-seq（液滴法，极高通量）；Seq-Well（微孔阵列，适合少量珍贵样本）单细胞文库构建通常需要特殊设计，如独特分子标识符（UMI）用于消除PCR扩增偏好，细胞条形码用于区分不同细胞来源生物信息学基础

（一）序列比对多序列比对分析保守区域和变异位点BLAST使用查找序列相似性和同源性进化树构建研究序列间进化关系BLAST（Basic LocalAlignment SearchTool）是生物信息学最基础的序列相似性搜索工具，用于在数据库中查找与查询序列相似的序列常用BLAST变种包括blastn（核酸对核酸）、blastp（蛋白质对蛋白质）、blastx（核酸翻译后对蛋白质）、tblastn（蛋白质对核酸翻译产物）BLAST结果解读重点关注E-value（期望值，越小表示匹配越可靠）；相似度和覆盖度（评估匹配质量）；比对图形（直观展示匹配区域）多序列比对是同时分析多个序列的保守性和差异性的方法主流工具包括ClustalW/ClustalO（进渐进比对算法，平衡速度和准确性）；MUSCLE（迭代优化，速度和准确性较高）；T-Coffee（整合多种方法，准确性高但计算量大）多序列比对可视化常用Jalview或MEGA等工具，可展示序列保守性、氨基酸物理化学性质等信息进化树构建方法主要有距离法（如UPGMA、邻接法，计算序列间距离构建树）；最大简约法（寻找需要最少进化变化的树）；最大似然法（评估不同树拓扑结构下观察到给定序列的概率）；贝叶斯法（整合先验知识评估树的后验概率）常用软件包括MEGA、PHYLIP、MrBayes等进化树评估通常使用自展法（bootstrap）检验树的可靠性生物信息学基础

（二）基因功能注释基因功能注释是理解基因组和转录组数据生物学意义的关键步骤基因本体论（GO）是一种描述基因产物属性的结构化词汇库，包含三个方面分子功能（MF，分子水平活性）、生物过程（BP，生物学目标）和细胞组分（CC，位置）GO分析工具包括DAVID（在线综合分析平台）；PANTHER（蛋白质功能分类系统）；BiNGO（Cytoscape插件，可视化GO网络）；clusterProfiler（R包，提供丰富的可视化和统计分析）KEGG（京都基因与基因组百科全书）是系统分析基因功能的重要数据库，整合了代谢通路、信号传导和疾病相关基因网络等信息KEGG通路分析能揭示基因集在生物通路中的富集情况，帮助理解生物学过程相关工具包括KEGG Mapper（在线通路映射工具）；PathView（R包，可视化和个性化通路图）；KAAS（KEGG自动注释服务器，基于BLAST比对进行功能预测）蛋白质结构预测是理解蛋白功能的重要途径常用方法包括同源模建（基于已知结构的同源蛋白）；从头预测（基于物理化学原理）；机器学习方法（如AlphaFold2）主流工具有SWISS-MODEL（基于模板的结构预测服务器）、I-TASSER（整合多种方法的结构预测系统）和Rosetta（从头预测软件包）结构预测质量评估通常使用RMSD（均方根偏差）、TM-score（拓扑匹配评分）等指标生物信息学基础

（三）转录组数据分析实验设计与数据分析1实验组设计样本量计算科学实验设计遵循对照原则、随机化原适当的样本量保证统计检验的效力计则和重复原则对照组设计包括阴性算样本量需要考虑预期效应大小、统对照（不期望有反应）、阳性对照（确计检验的类型、显著性水平（通常认实验系统有效）、空白对照（检测背α=

0.05）和期望的统计效力（通常景影响）、载体对照（针对重组表达系β=

0.8）常用的样本量计算工具包括统）和同工控制（内参基因或蛋白）G*Power、R语言的pwr包和在线计算器随机化通过随机分配样本到不同处理组，过小的样本量可能导致假阴性结果，而减少偏差分组设计应考虑研究目的、过大的样本量则浪费资源对于探索性变量类型和资源限制研究，可采用先导实验获取效应大小估计统计方法选择统计方法选择取决于数据特性和研究问题参数检验（如t检验、ANOVA）适用于正态分布数据；非参数检验（如Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis检验）适用于非正态分布数据相关分析评估变量间关系，回归分析探索因变量与自变量间的定量关系多重比较校正（如Bonferroni、FDR）防止错误发现率增加使用GraphPad Prism、SPSS或R进行统计分析和可视化实验室管理与质量控制实验记录规范良好的实验记录是科学研究的基础，应详细、准确、及时实验记录本应使用硬封面装订本，每页连续编号，不得撕页记录内容包括日期、实验目的、材料方法、原始数据、结果、分析和结论错误更正应划线而非涂抹，并签名注明日期电子实验记录系统应具备数据安全性、版本控制和审计追踪功能试剂管理试剂管理对实验结果的可靠性至关重要建立完善的试剂标签系统，包括名称、浓度、制备日期、有效期和责任人关键试剂应进行功能验证，并记录批号以追踪潜在问题制定合理的库存管理策略，定期盘点和更新危险化学品应按规定存放，并建立安全数据表（SDS）档案试剂共享平台可提高资源利用效率质量控制体系实验室质量控制体系确保结果可靠性和可重复性关键要素包括标准操作程序（SOP）的制定和执行；仪器设备的定期校准和维护记录；关键试剂和耗材的质控；实验内和实验间的重复性检验；阳性和阴性对照的设置；定期能力验证和盲样测试实验室信息管理系统（LIMS）可辅助质量控制体系的实施，提高实验室效率和数据质量生物实验伦理人类受试者保护涉及人类受试者的研究需获得伦理委员会（IRB）批准和受试者知情同意知情同意过程应充分告知研究目的、程序、潜在风险和益处维护受试者个人信息保密，数据匿名化处动物实验伦理理特殊群体（儿童、孕妇、精神障碍患者等）需额外保护基因编辑伦理问题措施人体样本采集和使用必须符合伦理规范，明确所有权动物实验应遵循3R原则替代（Replacement，尽可能用非基因编辑技术（尤其是CRISPR/Cas9）引发了深刻的伦理讨和用途限制临床试验应在官方平台注册，保证透明度动物模型替代）、减少（Reduction，减少实验动物数量）论体细胞基因编辑（不遗传给后代）与生殖系基因编辑和优化（Refinement，改善实验方法减轻痛苦）任何动（可遗传）区别对待人类胚胎基因编辑研究受严格限制，物实验必须事先获得机构动物伦理委员会（IACUC）批准，世界多国禁止将编辑胚胎植入子宫科学界呼吁建立国际监实验设计应科学合理，避免不必要的痛苦研究人员应接受管框架，规范基因编辑应用研究者应考虑生物安全风险适当培训，熟悉动物福利相关法规和规范详细记录实验过（如基因驱动），以及技术滥用和基因歧视等社会伦理问题程中的动物状况，发现异常应及时采取措施3课程总结与展望知识点回顾前沿技术介绍本课程系统介绍了分子生物学实验的基分子生物学技术正经历快速革新，未来本原理和技术，从核酸提取、PCR、基因发展趋势包括单细胞多组学集成分析，克隆到蛋白质表达纯化，再到细胞培养揭示细胞异质性；基因编辑新工具（如和基因编辑等前沿技术我们强调了实碱基编辑器、质子编辑器），实现精确验设计的科学性、操作的精确性和结果基因修饰；空间转录组学，保留组织空解释的客观性通过理论讲解和实验操间信息同时分析基因表达；微流控技术作相结合，帮助学生建立扎实的技术基与人工智能的结合，实现高通量自动化础和严谨的科学思维方式实验；合成生物学工具的拓展，创造新功能生物系统学习资源推荐推荐经典教材《分子克隆实验指南》（Molecular Cloning）、《细胞与分子生物学实验技术》和《Current Protocols》系列在线学习资源Nature Protocol、JoVE（科学视频期刊）、Coursera和edX上的分子生物学课程专业数据库NCBI、Ensembl、UniProt等研究工具Benchling（在线实验设计平台）、IGV（基因组浏览器）和各种R/Python生物信息学包加入专业社群和参加学术会议，保持对领域前沿的了解。