《液相色谱法及应用》课件

液相色谱法及应用本课程将带领大家深入了解液相色谱法的基本原理、仪器构造、操作方法以及在药物分析、环境监测、食品安全和生物样品分析等领域的应用，并探讨方法验证和仪器维护等重要内容课程学习目标掌握液相色谱法的基本原理和分类熟悉高效液相色谱仪的构造和操作了解色谱方法的开发、优化和验证学习液相色谱法在不同领域的应用案例液相色谱法的发展历史年19001俄国植物学家茨维特首次成功地利用色谱法分离植物叶绿素年19302色谱法应用于药物分析，标志着色谱法在分析化学领域取得了重大进展年19503气相色谱法诞生，为色谱技术的应用提供了新的发展方向年19704高效液相色谱法问世，极大地提高了色谱分离效率和灵敏度至今5液相色谱法不断发展，并与其他分析技术相结合，应用范围不断扩大液相色谱法的基本原理流动相固定相样品分离流动相是一种液体，它在色谱固定相是一种固体或液体，它样品是指需要进行分离的物质样品中不同组分在固定相上的柱中流动，将样品带入色谱柱被固定在色谱柱中，对样品进，它被注入色谱柱，并被流动保留时间不同，从而实现分离行分离相携带分配色谱的基本概念分配系数保留时间洗脱体积分配系数是指样品在固定相和流动相中保留时间是指样品从进样到检测器的时洗脱体积是指样品从进样到最大浓度峰的浓度比，它反映了样品在固定相上的间，它与样品在固定相上的保留系数有出现的时间，它与样品在固定相上的保亲和力关留系数和流动相的体积有关液相色谱法的分类反相色谱离子交换色谱固定相为非极性，流动相为极固定相带有离子基团，用于分性离带电荷的样品正相色谱凝胶色谱固定相为极性，流动相为非极固定相为多孔材料，用于分离性不同大小的分子2314正相色谱的特点固定相为极性，如硅胶、氧化铝等流动相为非极性，如己烷、二氯甲烷等适用于分离极性物质，如糖类、氨基酸等分离效果受流动相的极性影响较大反相色谱的特点固定相为非极性，如、等C18C8流动相为极性，如水、甲醇、乙腈等适用于分离非极性物质，如药物、脂类等分离效果受流动相的极性、值和有机改性剂的影响pH离子交换色谱的原理离子交换1样品中带电荷的离子与固定相上的离子发生交换分离2不同离子与固定相的亲和力不同，导致分离洗脱3使用适当的洗脱液洗脱，将样品分离凝胶色谱的应用范围分离蛋白质、多糖、核酸等生物大分子测定蛋白质的分子量分离和纯化药物、食品添加剂等分析环境污染物高效液相色谱仪的构造溶剂输送系统进样系统色谱柱检测器提供稳定的流动相压力将样品准确地注入色谱柱固定相所在的区域，进行分离检测样品中各组分的浓度数据处理系统采集、处理和分析色谱数据溶剂输送系统的组成溶剂瓶脱气装置恒流泵梯度洗脱系统存放流动相去除流动相中的溶解气体提供恒定的流动相流速改变流动相组成，提高分离效果恒流泵的工作原理活塞运动活塞在泵体内往复运动，推动流动相通过色谱柱压力控制恒流泵通过压力传感器控制压力，保证流动相流速稳定流量控制恒流泵通过流量计控制流动相的流速，保证分离效果进样系统的类型手动进样自动进样自动进样器的优势提高进样精度和准确性节省人力和时间便于无人值守操作提高分析效率色谱柱的选择固定相1选择合适的固定相，以匹配样品的性质柱长2较长的柱子可以提高分离效率，但会导致分析时间延长内径3较小的内径可以提高灵敏度，但会导致流动相消耗增加颗粒大小4较小的颗粒可以提高分离效率，但会导致流动相压力增加固定相的种类硅胶氧化铝C18C8正相色谱常用的固定相，具有正相色谱常用的固定相，适用反相色谱常用的固定相，适用反相色谱常用的固定相，分离良好的稳定性和分离性能于分离极性物质于分离非极性物质性能与类似C18流动相的选择原则与固定相相匹配对样品有良好的溶解能力具有良好的化学稳定性和光学性质对检测器无干扰能够提供最佳的分离效果流动相的配制方法溶解将所需试剂溶解在纯水中，并进行过滤脱气使用脱气装置去除流动相中的溶解气体混合根据需要，将不同的流动相混合在一起过滤使用滤膜对流动相进行过滤，去除微粒检测器的分类荧光检测器紫外可见检测器-根据物质的荧光特性进行检测21根据物质对紫外可见光的吸收进行检测-示差折光检测器根据物质的折光率差异进行检测35质谱检测器电化学检测器根据物质的质荷比进行检测4根据物质的电化学性质进行检测紫外可见检测器-原理1利用物质对特定波长的紫外可见光的吸收进行检测-特点2灵敏度高，应用广泛应用3适用于检测具有紫外可见吸收的物质-荧光检测器的特点灵敏度高，适合检测痕量物质选择性好，可用于复杂基质中特定物质的检测适用于检测具有荧光特性的物质示差折光检测器适用于检测所有具有折光率差异灵敏度较低，但通用性强的物质适用于检测无紫外吸收或荧光特性的物质电化学检测器12灵敏度选择性高灵敏度，适合检测痕量物质选择性强，适用于检测电活性物质3应用适用于检测药物、环境污染物等质谱检测器的应用数据处理系统数据采集数据处理数据分析检测器将信号传递给数据处理系统数据处理系统将信号转换为色谱图数据处理系统可以进行定性分析、定量分析、峰面积计算等定性分析方法保留时间1根据样品在色谱柱上的保留时间进行定性紫外光谱2利用紫外光谱图的特征吸收峰进行定性质谱3利用质谱图的特征离子进行定性定量分析方法外标法使用已知浓度的标准物质进行定量内标法在样品中加入已知量的内标物质，进行定量标准加入法向样品中加入不同浓度的标准物质，进行定量外标法的操作步骤配制标准溶液使用已知浓度的标准物质配制标准溶液进样分析分别进样分析标准溶液和样品绘制标准曲线以标准溶液的浓度为横坐标，峰面积或峰高为纵坐标，绘制标准曲线计算样品浓度根据样品峰面积或峰高，在标准曲线上查得样品浓度内标法的优势克服进样量误差和仪器条件变化的影响提高分析结果的准确性和可靠性标准加入法的应用适用于基质复杂，难以获得纯标准物质的样品可以消除基质效应的影响，提高分析结果的准确性峰面积法与峰高法峰面积法峰高法计算峰面积，适用于峰形较宽或拖尾的峰计算峰高，适用于峰形较窄或对称的峰分离度的计算公式1Rs=2tr2-tr1/w1+w2参数2和分别为两个峰的保留时间，和分别为两个峰的峰宽tr1tr2w1w2判断3当时，两个峰可以有效分离Rs≥

1.5理论塔板数的测定公式N=16tr/w2参数为峰的保留时间，为峰宽tr w意义理论塔板数越大，分离效率越高保留值的计算保留值是指样品在色谱柱上的保留时间保留值可以用于定性分析和方法验证分离选择性的优化改变固定相1选择更适合样品的固定相，提高分离选择性改变流动相2调节流动相的极性、值或有机改性剂，优化分离选择性pH改变温度3升高温度可以提高分离选择性，但也会降低保留时间流动相值的影响pH影响物质的电离状态，从而影选择合适的值，可以提高分pH响其保留时间离效率需要考虑流动相的缓冲能力和对色谱柱的兼容性有机改性剂的选择甲醇乙腈四氢呋喃极性较强，适用于分离极性物质极性中等，适用于分离中极性物质极性较弱，适用于分离非极性物质梯度洗脱技术原理在分析过程中，逐渐改变流动相的组成，提高分离效率优势可以分离不同极性物质，提高分离效率和分析速度应用适用于分离复杂样品等度洗脱的应用适用于分离简单样品操作简单，易于控制色谱柱温度控制12影响控制温度会影响物质的扩散系数和流动相使用恒温箱控制色谱柱温度，保持稳粘度，从而影响分离效果定的分离条件3应用在温度梯度洗脱中，可以提高分离效率和分析速度样品前处理方法液液萃取利用两种互不相溶的溶剂分离样品固相萃取超声提取利用固体吸附剂分离和富集样品利用超声波振动破坏样品细胞，提取样品213固相萃取技术步骤活化、上样、洗涤、洗脱优势简化样品前处理，提高分析效率和准确性应用广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全等领域液液萃取法利用两种互不相溶的溶剂，将适用于分离脂溶性物质样品从一种溶剂中提取到另一种溶剂中操作简单，但效率较低，易造成溶剂损失超声提取技术利用超声波振动破坏样品细胞，适用于提取植物中的有效成分提高提取效率操作简便，提取时间短系统适用性测试目的1评估色谱系统性能，确保分析结果的可靠性内容2包括分离度、理论塔板数、保留时间、峰形等标准3根据分析方法的要求进行评价方法验证步骤准确度精密度评价方法的准确度，反映方法的真实性21评价方法的精密度，反映方法的重复性线性范围确定方法的线性范围，反映方法的定量3能力5稳定性检测限和定量限评价方法的稳定性，反映方法的可靠性4评价方法的灵敏度精密度测定方法对同一批样品进行多次重复分析指标（相对标准偏差）RSD判断越小，精密度越高RSD准确度评价使用已知浓度的样品进行分析计算回收率，评价方法的准确度回收率越高，准确度越高线性范围确定方法判断应用使用一系列不同浓度的标准溶液进行分析在一定浓度范围内，峰面积或峰高与浓度确定方法的定量能力呈线性关系检测限和定量限12检测限定量限是指仪器可以检测到的最低浓度是指仪器可以准确定量的最低浓度稳定性考察样品稳定性1考察样品在不同时间、温度、光照条件下的稳定性方法稳定性2考察方法在不同时间、不同操作人员、不同仪器下的稳定性重复性测试考察同一操作人员在同一时间、同一仪器上进行多次重复分析的精密度反映方法的短时间内重复性耐用性评价目的考察方法在不同条件下的稳定性和可靠性方法有意改变方法参数，观察分析结果的变化判断方法对参数变化的敏感度药物分析应用实例环境监测应用案例水质监测空气监测土壤监测分析水中各种污染物，如重金属、农药残分析空气中的污染物，如二氧化硫、氮氧分析土壤中的污染物，如重金属、有机污留等化物等染物等食品安全检测检测食品中的农药残留、兽药残留、添加剂等保证食品安全，保障消费者健康生物样品分析血药浓度测定分析血液中的药物浓度，了解药物的药代动力学尿液分析分析尿液中的药物代谢产物，了解药物的代谢过程组织分析分析组织中的药物残留，了解药物的分布和清除仪器维护与保养定期清洁色谱柱、进样定期检查仪器各部件的保持实验室环境清洁，器和检测器性能，及时更换损坏的避免灰尘和腐蚀性气体部件进入仪器故障诊断与排除分析故障现象1观察色谱图，分析故障原因检查仪器2逐一检查仪器各部件，排除故障更换部件3如果必要，更换损坏的部件。