《临床免疫学检测技术》课件

临床免疫学检测技术免疫学检测技术是现代医学诊断的重要支柱本课程探讨免疫学原理与临床应用方法课程概述理论基础免疫学基本概念与原理检测方法常用免疫学实验技术临床应用免疫检测在疾病诊断中的应用新兴技术前沿免疫检测方法介绍第一章免疫学基础免疫防御免疫识别保护机体免受病原体侵袭区分自身与非自身成分免疫记忆免疫调节形成对特定病原体的长期记忆维持免疫反应平衡免疫系统概述免疫器官免疫细胞免疫分子•中枢器官骨髓、胸腺•T淋巴细胞•抗体•外周器官脾脏、淋巴结•B淋巴细胞•补体巨噬细胞细胞因子•••树突状细胞•MHC分子抗原的概念和特性免疫原性诱导免疫应答能力特异性与特定抗体结合分子量通常道尔顿10,000化学复杂性结构越复杂免疫原性越强抗体的结构和功能抗体基本结构抗体类型形分子血清中最丰富•Y•IgG•两条重链和两条轻链•IgM原发免疫应答•可变区和恒定区•IgA黏膜防御过敏反应•IgE细胞表面•IgD B抗体功能特异性结合抗原•中和毒素和病毒•激活补体•促进吞噬作用•补体系统经典途径抗原抗体复合物激活-替代途径微生物表面直接激活凝集素途径甘露糖结合凝集素激活膜攻击复合物形成细胞膜孔道细胞因子白细胞介素干扰素调节免疫细胞活动肿瘤坏死因子抗病毒作用促进炎症反应生长因子趋化因子促进细胞生长分化吸引免疫细胞迁移第二章抗原抗体反应识别结合抗原表位与抗体结合位点特异结合复合物形成形成免疫复合物效应反应清除抗原或激活免疫效应抗原抗体反应的基本特征特异性互补性抗体只与特定抗原结合抗原与抗体结构互补可逆性可视化非共价键连接，受环境影响可通过各种方法检测显示影响抗原抗体反应的因素温度最适温度通常为37°C值最适通常为pH pH

7.0-

7.4离子强度影响分子间静电作用抗原抗体浓度需保持适当比例反应时间足够长以达到平衡抗原抗体反应的应用疾病诊断科学研究药物筛选检测特定抗原或抗体研究蛋白质结构和功筛选和评价药物活性能疗效监测监测治疗效果第三章免疫学检测的基本原理12抗原抗体特异结合标记物信号转换免疫学检测基础将结合事件转化为可测信号34信号检测系统数据分析处理测量和记录产生的信号计算并解释检测结果免疫学检测技术概述经典技术标记技术沉淀、凝集、免疫扩散等放射免疫、酶免疫、荧光免疫等分子技术细胞技术

4、基因芯片等流式细胞术、免疫组织化学等PCR标记物的种类和选择标记物选择需考虑灵敏度、特异性、稳定性、安全性和成本因素信号放大系统高灵敏度检测微量样本检测酶促放大一个酶分子催化多个底物生物素亲和素系统-高亲和力结合聚合物载体一个分子携带多个标记第四章经典免疫学技术沉淀反应抗原抗体形成不溶性沉淀凝集反应颗粒抗原形成可见聚集免疫扩散在凝胶中形成沉淀带免疫电泳结合电泳和免疫沉淀免疫沉淀反应原理可溶性抗原与抗体形成网状复合物方法环状沉淀、层次沉淀、定量沉淀应用检测血清中特定抗原或抗体优缺点简单但灵敏度低凝集反应颗粒性抗原红细胞、细菌、乳胶颗粒等抗体桥联抗体连接颗粒形成网状结构肉眼可见形成可见的凝集物临床应用血型鉴定、细菌感染检测补体结合试验原理步骤应用基于抗原抗体复合物结合补体的能力抗原抗体结合补体感染性疾病诊断

1.•加入指示系统自身免疫病检测

2.•通过指示系统检测剩余补体活性观察溶血情况

3.免疫扩散技术单向扩散双向扩散免疫电泳一种成分在凝胶中扩散两种成分在凝胶中相互扩散结合电泳和免疫扩散免疫电泳技术分离阶段蛋白质混合物在电场作用下分离扩散阶段加入抗体溶液沉淀阶段形成弧形沉淀线结果分析根据沉淀线位置和形态判断第五章免疫标记技术放射免疫分析使用放射性同位素标记酶免疫技术使用酶作为标记物荧光免疫技术使用荧光物质标记化学发光免疫技术使用发光物质标记放射免疫分析原理标记物优缺点基于放射性标记物与未标记物对抗体优点灵敏度高•125I•结合位点的竞争缺点放射性危害•131I•缺点试剂保存期短通过测量放射性确定抗原含量•3H••14C酶免疫技术酶标记检测方法辣根过氧化物酶酶联免疫吸附测定•HRP•ELISA碱性磷酸酶酶免疫测定•AP•EIA半乳糖苷酶酶桥联免疫测定•β-•EMIT优点灵敏度高•安全性好•试剂稳定•可自动化•荧光免疫技术荧光标记、、等荧光物质FITC TRITCPE激发与发射特定波长光激发产生荧光荧光检测通过荧光显微镜或流式细胞仪应用领域4细胞表面标志检测、组织切片分析化学发光免疫技术第六章酶联免疫吸附试验（）ELISA临床诊断金标准广泛应用于医学诊断优良性能2高灵敏度、高特异性、高通量多种类型3直接法、间接法、夹心法、竞争法广泛应用4感染性疾病、自身免疫病、肿瘤标志物检测的基本原理ELISA固相载体抗原或抗体吸附在固相载体上特异性结合样品中待测物与固相上组分特异结合酶标记物结合酶标记的抗原或抗体与复合物结合底物显色加入底物后在酶催化下显色结果判读通过颜色深浅或吸光度值判断的主要类型ELISA直接法间接法夹心法竞争法ELISA ELISA ELISAELISA酶标记抗体直接与固相抗原一抗结合抗原后再与酶标二抗原夹在两种抗体之间标记与未标记抗原竞争抗体结合抗反应结合位点的操作步骤ELISA包被抗原或抗体吸附在微孔板上封闭封闭未结合位点避免非特异结合加样加入待测样品加酶标抗体加入酶标记的特异性抗体底物反应加入底物显色终止与测定终止反应并读取结果的应用领域ELISA感染性疾病自身免疫疾病、肝炎病毒、新冠病毒等检测自身抗体检测HIV食品安全肿瘤标志物农药残留、抗生素检测、、等检测CEA AFPPSA4过敏原检测激素测定特异性抗体检测甲状腺素、胰岛素等测定IgE第七章技Western blot术蛋白质分离膜转移抗体杂交根据分子量用电泳将蛋白质从凝胶转特异性抗体与膜上分离蛋白质移到膜上蛋白结合信号检测通过底物显色或化学发光检测的原理Western blot电泳分离转膜免疫检测凝胶电泳分离蛋白质电转或半干转将蛋白转至硝酸纤维素特异性抗体与目标蛋白结合SDS-PAGE或膜PVDF蛋白质按分子量大小分离二抗与一抗结合并产生可检测信号保持凝胶上蛋白质分离模式的实验步骤Western blot样品制备裂解细胞或组织提取蛋白凝胶电泳SDS-PAGE分离蛋白质转膜电转至硝酸纤维素或PVDF膜封闭用BSA或脱脂奶粉封闭非特异结合位点一抗孵育与目标蛋白特异结合二抗孵育与一抗结合并提供检测信号显影检测化学发光或显色底物检测的应用Western blot蛋白质表达检测蛋白修饰研究评估基因表达水平磷酸化••比较不同条件下蛋白表达糖基化••差异泛素化•临床诊断确证试验•HIV朊病毒相关疾病检测•自身免疫疾病抗体谱分析•第八章流式细胞术1000+每秒分析细胞数高通量分析20+同时检测参数多参数分析能力

0.5μm最小可检测颗粒高灵敏度99%细胞分选纯度高精度分选流式细胞术的基本原理细胞标记用荧光抗体标记细胞表面或内部分子流体聚焦使细胞单个通过激光束光信号产生散射光和荧光信号信号检测光电转换器接收光信号数据分析软件处理并展示数据流式细胞仪的结构流动系统光学系统检测系统将细胞送入检测区域激光源和光学滤光片光电倍增管接收散射光和荧光数据处理系统分选系统信号处理和数据显示部分仪器带有细胞分选功能流式细胞术的应用第九章免疫组织化学技术概念特点应用利用抗原抗体反应在组织切片上定位保留组织形态学信息病理诊断••特定抗原直观显示目标分子定位肿瘤分型••可半定量分析表达水平科学研究通过显色系统使抗原位置可视化••免疫组织化学的基本原理组织固定切片制备保存组织形态和抗原性制作薄组织切片显色反应抗体结合通过酶促反应产生可见沉淀特异性抗体与目标抗原结合免疫组织化学的主要方法不同方法各有优缺点，选择取决于样本类型、目标抗原和实验要求免疫组织化学的应用肿瘤诊断与分型病原体检测蛋白表达研究通过特异性标志物鉴定肿瘤类型直接在组织中定位病原微生物分析蛋白在组织中的分布与表达水平第十章分子免疫学技术核酸水平分析1研究免疫相关基因蛋白质水平研究2分析免疫分子功能细胞功能评估测定免疫细胞活性技术在免疫学中的应用PCR免疫相关基因检测分型、免疫球蛋白基因重排HLA病原体核酸检测2病毒、细菌、真菌DNA/RNA基因表达分析细胞因子基因表达定量免疫缺陷基因突变检测原发性免疫缺陷病基因诊断基因芯片技术原理应用优势基于互补碱基配对原理免疫细胞基因表达谱分析高通量••疾病分子分型全面性••一次检测成千上万个基因表达免疫相关药物开发定量准确••第十一章新型免疫检测技术时间分辨荧光表面等离子体共振纳米技术利用稀土元素长寿命利用纳米材料提高检荧光无标记实时监测分子测性能相互作用微流控技术芯片上实现样品处理和检测时间分辨荧光免疫技术原理标记物•稀土螯合物标记•铕Eu•长寿命荧光发射•钐Sm•时间窗口检测•铽Tb镝•Dy优势高灵敏度•低背景干扰•宽线性范围•多重检测能力•表面等离子体共振技术原理基于金属表面电子共振现象特点无需标记，实时监测分子相互作用测量参数结合动力学、亲和力常数应用抗原抗体相互作用、药物筛选纳米技术在免疫检测中的应用金纳米颗粒量子点磁性纳米颗粒侧流免疫层析、放大信号荧光标记，高亮度，窄发射谱分离浓缩，提高灵敏度第十二章临床免疫学检验自身抗体检测免疫功能检测2自身免疫性疾病诊断评估免疫系统整体功能细胞因子检测3评估免疫反应状态过敏原检测肿瘤标志物过敏性疾病诊断肿瘤诊断与监测免疫功能检测体液免疫细胞免疫吞噬细胞功能免疫球蛋白定量淋巴细胞计数吞噬能力••••补体成分测定•T细胞亚群分析•杀菌能力特异性抗体水平淋巴细胞增殖试验呼吸爆发试验•••细胞因子分泌能力•自身抗体检测抗核抗体ANA系统性红斑狼疮、混合结缔组织病类风湿因子RF类风湿关节炎抗CCP抗体类风湿关节炎抗dsDNA抗体系统性红斑狼疮抗Sm抗体系统性红斑狼疮抗SSA/SSB抗体干燥综合征ANCA小血管炎细胞因子检测肿瘤标志物检测甲胎蛋白癌胚抗原前列腺特异抗原AFP CEAPSA肝癌、生殖细胞肿瘤消化道肿瘤、肺癌前列腺癌CA125CA19-9卵巢癌胰腺癌、胆道肿瘤过敏原检测皮肤试验皮肤点刺试验、皮内试验血清特异性检测IgE酶联免疫法或化学发光法分子诊断过敏原组分检测激发试验4食物激发试验、药物激发试验细胞反应试验嗜碱性粒细胞活化试验第十三章免疫学检验的质量控制持续改进1不断完善质量管理体系设备校准与维护确保设备准确可靠试剂质量控制3监控试剂稳定性和可靠性标准操作规程统一规范的操作流程人员培训与考核提高技术人员专业水平质量控制的基本概念实施制定计划按照标准流程操作2建立质量控制体系监控收集质控数据5改进分析评估持续优化检测流程4分析质控结果总结与展望技术基础掌握免疫学检测理论与方法临床应用灵活运用于疾病诊断与监测技术创新跟踪新技术发展趋势多学科融合与分子生物学、人工智能结合。