《病原微生物免疫组织化学技术》课件

病原微生物免疫组织化学技术一种用于检测和定位组织中病原微生物的特殊染色技术结合免疫学和组织学原理，提供高特异性和敏感性课程概述基本原理免疫组织化学的基础知识技术方法样本处理与染色步骤应用案例细菌、病毒、真菌及寄生虫检测质量控制结果分析与质量保证第一章免疫组织化学基础基本概念定义和基本原理发展历程技术演变与里程碑应用范围临床与研究应用领域技术优势特异性、敏感性和可视化免疫组织化学的定义技术内涵检测目的可视化手段利用抗原抗体特异性结合原理定位和鉴定组织中的特定抗原通过标记物使结合复合物可视化免疫组织化学的发展历史年11941首次利用荧光标记抗体检测组织抗原Coons年21966酶标记抗体技术开发成功年代31970单克隆抗体技术出现年代至今41990自动化和多重染色技术发展免疫组织化学的应用领域临床诊断基础研究肿瘤分型、感染性疾病检测细胞和组织中蛋白质分布研究药物开发微生物学靶点验证及药物作用机制研究病原体检测与定位第二章免疫组织化学原理抗原抗体反应1特异性结合机制信号放大2增强检测灵敏度显色系统3实现可视化观察抗原抗体反应-特异性结合结合力可逆性抗体与相应抗原表位结合非共价键相互作用可被环境因素影响类似锁与钥匙的关系氢键、范德华力、离子键等值、离子强度、温度等pH抗原的概念和特性外源性来自外界的物质免疫原性能刺激机体产生免疫应答特异性与特定抗体结合多样性蛋白质、多糖、核酸等抗体的结构和功能形结构可变区恒定区Y由两条重链和两条轻链位于部分，决定抗位于部分，决定生物Fab Fc组成原特异性学功能多样性有、、、IgG IgMIgA、五类IgD IgE免疫组织化学的检测方法直接法标记一抗直接与抗原结合间接法一抗结合抗原，标记二抗识别一抗酶标记法利用酶催化底物显色荧光标记法利用荧光物质发光特性直接法和间接法直接法间接法优点步骤简单，背景低优点灵敏度高，成本低缺点灵敏度低，成本高缺点步骤多，背景干扰可能增加适用快速检测适用常规检测酶标记法常用酶类底物系统信号放大辣根过氧化物酶、、、生物素链霉亲和素系HRP DABAEC-碱性磷酸酶等统、聚合物系统AP NBT/BCIP荧光标记法荧光团种类、、、系列FITC TRITCCy3Alexa检测方式荧光显微镜下观察特定波长发光优势特点多重标记、定位精确、背景低局限性需特殊设备、荧光衰减、自发荧光干扰第三章样本制备组织固定保持组织形态和抗原性包埋切片石蜡或冰冻切片制作抗原修复恢复抗原表位活性切片处理脱蜡、水化、内源性封闭组织固定方法固定剂特点适用情况福尔马林保存形态好常规固定首选乙醇蛋白质变性细胞学标本戊二醛固定迅速电镜样本冷丙酮保留酶活性酶组织化学石蜡包埋技术脱水梯度乙醇浓度处理组织脱水透明二甲苯等透明剂置换乙醇浸蜡石蜡浸透组织包埋将组织包埋于石蜡中定向切片切成厚度切片3-5μm冰冻切片技术优势特点制备方法保留抗原性好组织包埋OCT制备速度快℃冰冻-20避免石蜡干扰冰冻切片机切片适用情况快速诊断脂类研究热敏感抗原抗原修复技术热修复法酶消化法高压锅、微波炉、水浴加热胰蛋白酶、胃蛋白酶等或柠檬酸缓冲液℃消化分钟EDTA3710-30℃加热处理适用于膜蛋白等特定抗原95-125第四章免疫组织化学染色步骤切片准备脱蜡、水化、抗原修复抗体孵育一抗、二抗结合信号检测发色反应显示结果观察评价复染、封片和镜检切片脱蜡和水化二甲苯处理次各分钟35梯度乙醇100%→95%→85%→75%流水冲洗自来水分钟5浸泡PBS缓冲液分钟pH

7.45内源性过氧化物酶封闭原理目的避免组织中内源性酶干扰结果常用方法过氧化氢溶液处理分钟3%10其他封闭剂叠氮化钠、苯肼、高温处理等注意事项时间过长可影响抗原活性抗原修复°分钟85-95C10-30修复温度修复时间最适合抗原表位恢复的温度范围根据不同抗原和方法调整

6.0-

9.0值范围pH修复液酸碱度对效果的影响一抗孵育稀释比例孵育条件不等℃过夜或室温小时1:50-1:50041-2根据抗体说明书和优化结果确定湿盒中防止干燥关键因素抗体特异性浓度适宜孵育时间充分二抗孵育选择原则孵育条件常见系统与一抗种属匹配室温分钟标记二抗30-60HRP标记方式适合湿盒环境生物素链霉亲和素系统-灵敏度要求避光（荧光标记时）聚合物检测系统发色反应显色DAB棕褐色沉淀稳定持久，可长期保存显色AEC红色沉淀水溶性，需水性封片反应时间分钟不等1-10显微镜下观察控制复染和封片复染苏木精轻度复染细胞核洗涤流水冲洗去除多余染料脱水梯度乙醇处理透明二甲苯处理封片中性树胶封片保存第五章病原微生物免疫组织化学病毒检测真菌检测病毒抗原或包涵体菌丝和孢子结构细菌检测寄生虫检测革兰阳性和阴性细菌各种发育阶段形态病原微生物的分类原核生物细菌、支原体、衣原体等1真核生物2真菌、寄生虫非细胞生物3病毒、朊病毒细菌免疫组织化学常见靶标检测方法细胞壁成分多克隆抗体荚膜多糖单克隆抗体鞭毛蛋白抗菌株特异抗体特异性毒素特殊处理预消化处理抗原修复强化信号放大系统病毒免疫组织化学检测靶标技术要点常见应用病毒衣壳蛋白高特异性抗体传染性疾病诊断病毒包涵体信号放大处理病毒感染细胞类型确定病毒编码蛋白抗原修复优化病毒复制动态研究真菌免疫组织化学检测靶标细胞壁多糖成分形态特征菌丝、孢子、芽生结构技术难点抗原表位暴露困难优势应用与组织形态学结合鉴定真菌种类寄生虫免疫组织化学复杂生命周期抗原变异鉴别诊断不同发育阶段形态表面抗原可发生变区分相似形态的不迥异异同种类背景干扰宿主组织反应可能影响检测第六章常见病原微生物的免疫组织化学检测结核分枝杆菌检测检测靶标形态特点抗酸细菌表面脂质杆状菌体分泌蛋白肉芽肿病变MPT64特殊处理临床应用蛋白酶消化肺结核热修复增强结核性脑膜炎肠结核幽门螺杆菌检测抗体选择形态分布临床意义抗多克隆抗体胃黏膜表面和腺窝内慢性胃炎诊断H.pylori抗或抗体螺旋状或弯曲杆菌消化性溃疡CagA VacA胃癌风险评估人类免疫缺陷病毒（）检测HIVp24gp41主要靶标包膜蛋白核心蛋白，感染早期即可检测病毒包膜跨膜糖蛋白HIVgp120表面蛋白与受体结合的糖蛋白CD4乙型肝炎病毒检测HBsAg表面抗原，细胞质和膜染色HBcAg核心抗原，主要核染色主要靶细胞肝细胞，偶见胆管上皮诊断价值病毒复制状态评估人乳头瘤病毒检测第七章多重免疫组织化学技术单一切片在同一切片上检测多个抗原多种抗体使用不同种属或亚型抗体不同标记采用各种发色系统或荧光团图像分析多通道采集和分析数据多重染色的原理抗体特异性标记区分1不同抗体结合各自特定抗原不同显色底物或荧光团区分信号信号采集染色顺序特定波长或颜色分离获取图像合理安排染色步骤避免干扰多重染色的方法连续染色法混合染色法多色荧光法完成一轮染色后进行下一轮同时使用多种一抗使用不同荧光团标记可使用抗体剥离或漂白技术分别使用不同显色系统荧光显微镜不同通道观察适合常规显微镜观察需控制背景和交叉反应可实现多达种抗原同时检测7多重染色的应用混合感染宿主相互作用免疫反应检测多种病原体共感染病原体与宿主细胞关系病原体引起的局部免疫应答第八章免疫组织化学结果分析定性分析阳性与阴性判断半定量分析阳性程度分级评估定量分析精确数值测量和统计定性分析阳性判断特定结构出现特征性染色阴性判断目标结构无特异性染色定位评估细胞核、细胞质或膜定位形态观察与病原体形态特征对比半定量分析评分等级阳性率染色强度无阳性细胞无染色-＜弱染色+25%中等染色++25%-50%＞强染色+++50%定量分析100%0-255H-Score阳性率光密度值综合评分阳性细胞占总细胞百分比染色强度的数字化表示阳性率与染色强度的综合计算图像分析软件的应用图像分割颜色分离自动计数区分阳性和阴性区域分离不同染色信号精确统计阳性细胞数量第九章免疫组织化学质量控制结果评估阳性阴性对照验证技术控制2试剂质量和操作规范实验室管理标准操作流程和人员培训阳性对照和阴性对照阳性对照阴性对照已知含有目标抗原的组织替代一抗的缓冲液或非免疫血清确认检测系统有效性评估非特异性背景染色内部或外部阳性对照排除假阳性干扰抗体特异性验证抗原吸收试验抗体与纯化抗原预孵育阳性组织验证已知表达目标的样本测试阴性组织验证已知不表达目标的样本测试确认Western blot确认抗体识别正确分子量蛋白多抗体比对不同抗体克隆结果比较背景染色的控制常见原因控制方法内源性酶活性过氧化氢处理非特异性抗体结合血清封闭内源性生物素生物素封闭试剂组织自发荧光抗体适当稀释缓冲液选择高质量漂洗液添加低浓度去垢剂值适宜调整pH结果重复性的保证标准操作规程环境控制1详细记录每个步骤参数温度、湿度等条件稳定设备校准试剂质量定期维护和校准实验设备3保质期内使用并适当保存第十章免疫组织化学在病原微生物研究中的应用病原微生物的定位和分布研究器官分布细胞定位亚细胞定位确定病原体感染的器官和组织鉴定病原体感染的特定细胞类型病原体在细胞内的精确位置病原微生物与宿主相互作用研究受体结合细胞响应免疫反应病原体与宿主细胞受体感染后细胞形态和功能宿主免疫细胞对病原体相互作用变化的应答组织损伤病原体引起的组织病理学改变病原微生物致病机制研究毒力因子表达检测细菌毒素或病毒蛋白侵袭能力病原体穿透生物屏障能力免疫逃逸病原体逃避宿主免疫识别组织损伤直接细胞毒性或免疫病理损伤新发传染病的快速诊断小时24-4890-95%检测周期特异性从取样到结果的时间正确鉴定病原体的能力85-90%敏感性检出低浓度病原体的能力总结与展望技术创新多重标记和自动化分析临床应用2快速精准诊断传染病研究价值揭示病原体与宿主相互作用参考文献中文文献1张志谦等《免疫组织化学技术及应用》中国医药科技出版社..,

2018.英文文献2Taylor CR,et al.Immunohistochemical techniques.MethodsMol Biol.2018;1312:1-

10.网络资源3美国病理学会免疫组织化学指南www.cap.org期刊杂志4《》相关文章Journal ofHistochemistryCytochemistry。