《病原生物实验技术与方法》课件

病原生物实验技术与方法探索微观世界的关键技术与方法掌握病原体研究的实验技能确保实验安全与结果准确课程概述课程目标主要内容掌握病原生物实验基本技能实验安全、培养技术、鉴定方法学习要求理论与实践相结合第一章实验室安全与生物安全个人防护防护服、面罩等装备操作规程标准流程与安全操作风险管控危险评估与应急处理实验室安全基本原则个人防护环境安全实验服、手套、护目镜通风、消毒、隔离紧急处理操作安全应急预案、事故报告规范流程、避免交叉感染生物安全等级BSL-1低风险微生物，开放工作台BSL-2中等风险病原体，生物安全柜BSL-3高风险病原体，气密性实验室BSL-44最高风险病原体，全身正压防护个人防护装备（）PPE防护服手套口罩和呼吸器一次性或可重复使用，防止污染乳胶、丁腈、防穿刺防飞沫、气溶胶防护生物安全柜原理HEPA过滤、气流屏障保护类型Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类安全柜使用前开启15分钟，紫外消毒使用后表面消毒，整理工作区实验室废弃物处理固体废弃物液体废弃物锐器废弃物•专用黄色垃圾袋•漂白剂处理•硬质防刺容器•高压蒸汽灭菌•存放30分钟•不超过3/4容量•封口标记•专用下水道排放•专业机构回收实验室消毒与灭菌物理方法化学方法适用场景•高压蒸汽灭菌（121℃，15-30分钟）•75%酒精（表面消毒）•工作台面75%酒精•干热灭菌（160-180℃，2小时）•含氯消毒剂（广谱杀菌）•培养基高压蒸汽•紫外线照射（30-60分钟）•甲醛熏蒸（空间消毒）•玻璃器皿干热灭菌第二章微生物培养技术培养基制备培养条件营养物质配比温度、湿度、气体观察方法接种技术菌落特征鉴别无菌操作、均匀分布培养基制备常用培养基类型普通培养基、选择培养基、鉴别培养基制备步骤配料、溶解、调pH、分装、灭菌质量控制无菌测试、pH值检测、生长支持力测试无菌操作技术70%15cm酒精浓度火焰高度表面消毒最佳浓度酒精灯最佳工作高度°分钟10-1530试管角度预热时间最佳操作倾斜角度生物安全柜使用前预热细菌培养方法平板划线分离单菌落倾注平板测细菌数量液体培养获得大量菌体真菌培养方法特殊培养基沙氏培养基、马铃薯葡萄糖培养基培养条件25-28℃，湿度50-60%培养时间3-7天观察菌落生长病毒培养技术厌氧培养技术厌氧培养系统厌氧指示剂操作要点厌氧罐、厌氧培养箱、厌氧袋亚甲蓝、甲酚红指示氧气存在快速操作，减少氧气接触时间第三章显微镜技术荧光显微镜电子显微镜特殊标记，观察活性超高倍率，观察超微结构光学显微镜常规观察，100-1000倍光学显微镜结构和原理目镜、物镜、聚光镜、反光镜组成光路系统调节和使用方法低倍物镜对焦，逐步转高倍，调节光圈日常维护镜头纸清洁镜片，防尘罩保护，干燥环境保存油镜使用技术油镜特点100倍，分辨率

0.2μm使用步骤低倍对焦，加油，转油镜清洁保养镜头纸擦净油脂荧光显微镜原理和应用样品制备•激发特定波长，发射荧光•荧光染料标记•观察标记的特定结构•荧光抗体结合•活菌/死菌区分•荧光蛋白表达观察技巧•暗室环境•控制曝光时间•防止荧光淬灭电子显微镜扫描电镜（）透射电镜（）样品制备SEM TEM观察表面结构观察内部结构固定戊二醛、锇酸分辨率达10nm分辨率达

0.1nm脱水乙醇梯度样品需金属喷涂样品需超薄切片包埋环氧树脂显微镜下的细菌形态观察革兰氏染色鉴别G+/G-细菌抗酸染色结核分枝杆菌检测荚膜染色观察保护性结构第四章微生物分离与纯化技术纯种获得单一菌种培养分离技术从混合物中获得目标微生物采样处理样品收集与前处理分离培养技术稀释平板法划线分离法挑取单菌落逐级稀释，降低菌浓度四区划线法分离单菌落接种环取独立菌落纯化技术反复划线法单菌落分离法纯度检查分子验证连续3-5次划线分离挑取独立菌落转接形态观察，生化特性PCR或测序确认特殊微生物的分离第五章微生物鉴定技术形态学鉴定1最基础的鉴定方法生化鉴定代谢特性分析血清学鉴定抗原抗体特异反应分子生物学鉴定4基因水平精确鉴定形态学鉴定菌落特征显微形态染色特性大小、形状、颜色、质球菌、杆菌、螺旋菌革兰氏、抗酸性、荚膜地、边缘生理生化鉴定试验糖发酵试验酶活性测定IMViC•吲哚试验•葡萄糖•过氧化氢酶•甲基红试验•乳糖•氧化酶•VP试验•蔗糖•尿素酶•枸橼酸盐试验•甘露醇•明胶酶血清学鉴定凝集试验沉淀试验可见的抗原抗体聚集可溶性抗原与抗体反应•载玻片法•环状沉淀•试管法•免疫扩散技术ELISA酶标记检测微量物质•直接法•间接法分子生物学鉴定技术测序PCR DNA特异性引物扩增目标序列16S rRNA基因序列分析基因芯片分子指纹图谱高通量基因表达分析RFLP、RAPD、PFGE自动化鉴定系统系统系统质谱鉴定API VITEK微量生化反应条带全自动生化反应和数据分析蛋白质指纹图谱快速鉴定第六章抗微生物药物敏感性试验琼脂稀释法肉汤稀释法金标准MIC测定液体培养测定MIC纸片扩散法方法E-test最常用的筛查方法梯度扩散技术纸片扩散法（法）K-B原理抗生素从纸片扩散形成抑菌圈操作步骤制备平板，铺菌，放置纸片，孵育结果判读测量抑菌圈直径，对比标准表琼脂稀释法测定1MIC最低抑菌浓度，金标准方法操作方法药物梯度稀释，加入琼脂，倾注平板优缺点精确但耗时，多样本同时测试肉汤稀释法操作步骤液体培养基系列稀释加菌标准菌液接种孵育16-24小时培养判读观察浑浊度确定MIC方法E-test天1-2实验周期快速获得精确MIC值

0.016最低浓度μg/ml，高灵敏度256最高浓度μg/ml，宽测试范围种15同时测试单平板可测多种抗生素自动化药敏系统VITEK系统快速结果，2-18小时Phoenix系统高准确性，多样本处理MicroScan全自动接种，标准化结果第七章血清学实验技术应用诊断病原体特异性检测1检测方法2凝集、沉淀、ELISA技术抗原抗体反应特异性结合是核心原理抗原抗体反应基础特异性亲和力反应类型抗体只与特定抗原结合结合强度，决定反应灵敏度凝集、沉淀、中和互补结构决定结合位点结合常数Kd表示补体结合、免疫荧光凝集反应直接凝集间接凝集颗粒性抗原与抗体直接反应可溶性抗原先与载体结合结果判读操作要点4肉眼或显微镜观察凝集现象3适宜pH和离子强度沉淀反应环状沉淀试验双向免疫扩散试验•试管中形成沉淀环•琼脂凝胶中形成沉淀线•适用于抗原浓度测定•Ouchterlony法免疫电泳•电场中分离蛋白质•形成特异性沉淀弧线补体结合试验技术ELISA直接法酶标记抗体直接检测抗原间接法一抗结合，二抗检测夹心法两种抗体夹住抗原竞争法样品抗原与标记抗原竞争免疫荧光技术直接法间接法应用范围荧光素标记抗体直接与抗原结合未标记一抗与荧光标记二抗组合病原体定位，自身抗体检测第八章分子生物学实验技术核酸提取1获取纯净DNA/RNA扩增PCR特异性放大目标基因测序分析确定核酸序列信息核酸提取技术提取提取质量控制DNA RNA•裂解SDS、蛋白酶K•裂解含RNase抑制剂•浓度OD260/280测定•纯化酚氯仿法•纯化异硫氰酸胍方法•纯度比值

1.8-

2.0•沉淀乙醇或异丙醇•保存-80℃，加RNase抑制剂•完整性琼脂糖凝胶电泳技术PCR°94C变性温度DNA双链分离°55-65C退火温度引物结合目标区域°72C延伸温度DNA聚合酶合成新链次30-40循环次数指数级扩增目标片段Real-time PCR原理和优势实时监测扩增，定量分析探针类型SYBR Green、TaqMan、分子信标数据分析Ct值、标准曲线、熔解曲线仪器要求实时监测荧光，精确温度控制基因测序技术Sanger测序单一片段，高准确性高通量测序海量数据，平行处理第三代测序长读长，实时分析基因克隆技术目标基因获取载体选择PCR扩增或酶切质粒、噬菌体、BAC转化与筛选连接反应抗生素或蓝白斑筛选T4DNA连接酶第九章病毒学实验技术病毒培养病毒滴定病毒检测细胞系、鸡胚、动物模测定病毒浓度形态学、免疫学、分子型生物学中和试验抗体特异性检测病毒分离与培养细胞培养基础病毒接种方法观察CPE•原代细胞•吸附法•细胞融合•传代细胞系•直接添加法•细胞变圆•悬浮细胞•贴壁细胞消化法•空泡形成•细胞裂解病毒滴定技术空斑计数法法TCID50•单个病毒形成可见空斑•半数组织培养感染剂量•计算PFU/ml•稀释度系列观察CPE•适用于裂解性病毒•Reed-Muench法计算血凝滴定•病毒凝集红细胞•计算HAU值•流感、麻疹等病毒病毒中和试验结果判读操作步骤观察CPE抑制，计算中和抗体滴度原理血清稀释，加入病毒，孵育，接种细胞特异性抗体中和病毒感染能力病毒核酸检测病毒载量RT-PCRRNA病毒检测金标准定量PCR测定拷贝数1基因型鉴定快速检测测序分析病毒变异等温扩增技术第十章免疫学实验技术功能分析免疫细胞活性测定1分子检测2细胞因子、抗体测定细胞分离获取纯化免疫细胞淋巴细胞分离技术细胞因子检测技术法ELISA单一因子定量检测流式细胞术细胞内因子检测蛋白芯片多种因子同时检测RT-PCR细胞因子mRNA表达课程总结知识回顾从基础安全到高级检测技术技能要点精准操作，方法选择，数据分析安全再强调生物安全是一切实验的基础继续学习新技术不断涌现，保持学习态度。