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细胞凋亡的检测方法细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态学特征，人们已经设计了许多不同的1细胞凋亡形态学检测方法、光学显微镜和倒置显微镜观察未染色凋亡细胞体积变小、变形，细胞膜完整但出现发a泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落；染色凋亡细胞常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋b亡的进展情况，常用的特异性染料有有DNA H033342Hoechst33342,H0三种染料与的结合是非嵌入式的，主要结合在的33258Hoechst33258,DAPI DNA DNAo碱基区是与特异结合的活性染料，储存用蒸储水配成的浓度，使A-T Hoechst DNA lmg/ml用时用稀释成终浓度一般为为半通透性，用常规固定细胞的染色储存PBS2-5ug/ml DAPIo液用蒸储水溶解为浓度使用终浓度一般为结果评判细胞凋亡过程中细lmg/ml,
0.5-lug/mlo胞核染色质的形态学改变分为三期期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部I rippledcreased分染色质出现浓缩状态；期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；期细胞核裂解为碎块，Ha Ub产生凋亡小体、透射电子显微镜观察结果评判凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩凋亡期的细磷脂c I结合蛋白（）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于具有高度的结合力因V Annexin V PS此，可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸故利用对有高度亲和力Annexin V PS的,将标记上荧光素（如异硫氨酸荧光素）,同时结合使用拒Annexin V Annexin V FITC PI染法（因坏死细胞亦暴露于细胞膜外测，且对高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞PS PI仪即可检测凋亡细胞、结果判断正常活细胞、均低染；凋亡细胞高染、低染；2Annexin V PI Annexin V PI坏死细胞均高染Annexin V/PI、应用价值细胞发生凋亡时，膜上的外露早于断裂发生，因此联3PS DNA Annexin V合染色法检测早期细胞凋亡较法更为灵敏又联合染色不需固定细PI TUNELAnnexin V PI胞，可避免染色因固定造成的细胞碎片过多及法因固定出现的片段丢失因PI TUNEL DNA此,联合法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法Annexin V PI几点参考♦.大部分凋亡细胞可能并不见得有非常典型的凋亡表型，如电镜的染色体边集、凋亡小体1等，电泳也不见得都有，但对某些指标来说还算稳定，如染色及DNA DNA ladder PI TUNEL法，所以如果某个方法效果不好，可以换用其他方法检测.坏死与凋亡的区分传统上认为是无序与有序的过程，楼上所说的线粒体肿大也是以前的2一个传统认识，但现在有很多人认为坏死的发生也是有序发生的，因此也有了程序化坏死一说，在很大程度上，由于凋亡是时间依赖性的过程，细胞发生凋亡也并非同步化的,凋亡的晚期与坏死进行区分是困难的，而且我认为如果不是对于凋亡或是坏死本身通路进行研究的话，强行区分是没有意义的细胞凋亡检测技术与方法♦细胞凋亡（）又称细胞程序性死亡（）是指Apoptosis,PCD:Programmed CellDeath,细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程它是一个主动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程细胞凋亡概念提出至今还不到年的时间，30但由于它在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键角色，对个体的正常发育及细胞凋亡紊乱在病理学研究中的重要作用，引起了人们对其机制和组分的广泛而深入地研究，成为目前生命科学界最为热门话题之一，也是生命科学界乃至社会各界争相投入的研究领域从近年的SCI排名中我们可以看到，信号传导方面的文章远远超过位于第二位的人类基因组方面的，而信号传导中一个重要的前沿领域就是细胞凋亡的研究随着这方面研究的持续升温，涌现出了大量新的技术和方法对细胞凋亡进行检测，其中不少已经有商品化的产品出现，大大加速了研究的进程具体来说，针对凋亡的不同阶段有以下一些方法（概括如图）:1早期检测
1.）（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测1PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生，可能作为免疫系统的识别标PS志一个钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的再通过简AnnexinV,PS,单的显色或发光系统进行检测由于这是一种凋亡早期的活细胞检测（悬浮细胞和贴壁细胞都适用），可与染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段DNA美国著名生物试剂公司和公司分别开发了多种标记的CLONTECH INTERGENAnnexin V产品，简便快速，分钟就可完成检测其中带荧光标记的10Annexin V-EGFPEnhanced Green及灵敏度高，可作为流式细胞分选方法筛选Fluorescent ProteinAnnexin V-FITC,FACS凋亡细胞的基础由于融合蛋白与的结合比例为还可进行定Annexin V-EGFP,EGFP PS1:1,量检测除此之外，还提供生物素偶联的可通过常用的酶联显色反应来检测另外，Annexin V,公司将磁珠包被可采用磁分选方法筛选凋亡细胞MACS Annexin V,细胞内氧化还原状态改变的检测2这反应了细胞凋亡研究中相对较新的趋势，研究什么样的氧化还原环境引起下游事件的发生公司的通过荧光染料CLONTECH ApoAlertTMGlutathione Detection Kit体外检测凋亡细胞细胞质中谷光甘肽的减少来检测凋亡早期细胞内monochlorobimaneMC氧化还原状态的变化正常状态下，谷光昔肽作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂细胞glutathione:GSH内有毒的氧化物通过被还原而定期去除，氧化型的又可被还原酶迅速还原GSH GSH GSH这一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除在和Jurcat一些其它类型的细胞中，细胞膜中有可被凋亡信号启动的依赖的转移系统当细胞ATP GSH内的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线GSH粒体膜电位的降低，从而使细胞色素三竣酸循环中的重要组分从线粒体内转移到细胞液中，C启动凋亡效应器的级联反应caspase由于与氧化还原作用及线粒体功能密切相关，此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非GSH常有用外，还可用于心脏病、中风等疾病治疗的研究但有些细胞如和HeLa3T3细胞凋亡时没有明显的水平的变化，不能用此法检测GSH细胞色素的定位检测3C细胞色素作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用正常情况下，它存在于C线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，结合Apaf-1后启动级联反应细胞色素apoptotic proteaseactivating factor-1caspase C/Apaf-1复合物激活后者再激活和其它下游caspase-9,caspase-3caspase0细胞色素氧化酶亚单位是定位在线C IVcytochrome coxidase subunitIV:COX4粒体内膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保留在线粒体内，因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志不用超离心，可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离ApoAlertTMCell FractionationKit出高度富集的线粒体部分,再进一步通过杂交用细胞色素抗体和抗体标示细Western C COX4胞色素和的存在位置，从而判断凋亡的发生C COX4线粒体膜电位变化的检测4在凋亡研究的早期，从形态学观测上线粒体没有明显的变化随着凋亡机制研究的深入，发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分，发生很多生理生化变化例如，在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变一个阳离子性的染色剂，MitoSensorTM,对此改变非常敏感，呈现出不同的荧光染色正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光凋亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号公司的CLONTECH就采用这种原理来检测线粒体膜电位的变ApoAlert Mitochondrial Membrane SensorKit化但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化.晚期检测2细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些的底物）在核小体之间剪切核产生大Caspase DNA,量长度在的片段对于这一现象的检测通常有以下两种方法180-200bp DNA）（1TUNEL Terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP）nick-end-labeling通过末端转移酶将带标记的（多为）间接（通过地高辛）或直接接到DNA dNTPdUTP片段的端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果美国公司提供多DNA3-0H Intergen种标记方法，直接荧光标记，地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色，可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测其中，直接标记步骤少，操作简便而间接标记有信号放大的作用，检测灵敏度高）（连接介导的检测）2LM-PCR LadderPCR当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核的变化公司的通过DNA CLONTECHApoAlert®LM-PCR LadderAssay Kit（），连上特异性接头，专一性地扩增核小体的梯度片段，LM-PCR ligation-mediated PCR从而灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段此外，检测是半定量的,因此相同凋LM-PCR亡程度的不同样品可进行比较上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损DNA伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰）（端粒酶检测）3Telemerase Detection这是相对来说推出较早，用得较多的一种方法端粒酶是由和蛋白组成的核蛋白，它RNA可以自身为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得永生化正常体细胞是没有端RNA粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号研究发现，以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性90%公司的在年率先推出它提供特定的Intergen TRAP-eze Telemerase Detection Kit1996寡核甘酸底物，分别与底物及端粒重复序列配对的引物如果待测样本中含有端粒酶活性,就能在底物上接上不同个数的碱基（）端粒重复序列，通6GGTTAG过反应产物电泳检测就可观察到相差六个碱基的现象参见图此外，PCR DNALadder4\公司还提供用酶联免疫法（）检测的试剂盒.Intergen ELISA同样，这种检测方法也不专对细胞凋亡，检测结果也不纯反应细胞凋亡的发生水平的检测
4.mRNA研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法据报道，蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性细胞Fas T（）等靶细胞和（长的）作为抗凋亡（和）的调cytotoxic Tcells Bcl-2bcl-X bcl-2bcl-X节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活一般多采用杂交和Northern RT-PCR走胶对它们进行检测随着近年来荧光定量技术的发展，用定量技术来检测基因表达PCR PCR水平无疑比之前者更快更准确公司的就Intergen Amplifluor™Apoptosis GeneSystems根据这一新技术原理通过检测和（长的）基因的表达水平来进fas,bax-alpha bcl-X mRNA行细胞凋亡的检测以上介绍了针对凋亡不同阶段特征的检测方法，随着凋亡机制研究的深入，近年来还发展了许多针对特定的凋亡途径的检测，如抗体法，酶活性测定等等,公Cell Signelingtechnology司,公司,公司公司都紧跟科研潮流，开发了DAK0Santa-Cruz,CalbiochemOncogene大量的抗体及活性测定产品随着对细胞凋亡的研究和认识的不断深入，对包括肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本的细胞凋亡的检测已成为一种迫切需要目前，多种方法已得到较广泛的应用然而如何选择适当的方法并对检测的结果作出正确的判断及愉如其分的解释仍是值得探讨的问题本文简要评述几种常用的细胞凋亡检测方法
一、细胞凋亡的形态学观察细胞凋亡（）的命名主要是根据某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树叶散apoptosis落般的形态学特征目前对细胞凋亡的认识正不断得到深化，检测凋亡细胞的方法也逐渐增多，但形态改变仍是确定细胞凋亡的最可靠的方法光学显微镜观察凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染，形成致密质块，有时可碎裂在染色的组织HE切片中细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在，凋亡细胞与周围细胞分离，不引起炎症反应本方法简便易行，但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难，常缺乏较为特征的指标，具有较强的主观性，重复性差本方法可用于调亡现象的初步观察，作为分析指标之检测方法细胞涂片或组织石蜡切片作染色或染色，在高倍物镜下观察凋亡HE Giemsa细胞的形态改变，结合显微测量工具可作凋亡细胞计数视频时差显微技术叩video time-1se microscopy本方法用于细胞培养，通过相差显微镜可动态观察细胞凋亡的变化过程，尤其是观察细胞表和外形的变化凋胞与基质分离，胞体变圆、收缩、出泡，有的细胞拉长，出现钉状突起，特续数小时后细胞膜破裂，细胞溶解，通过连续观察，本方法可养壑培养中的凋亡细胞，但不能用于病理组织检测方法收集细胞培胞，置于多孔培养板,加入凋亡诱导剂，在带有自动摄像2x105/ml装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态改变，每隔分钟秒作序列摄影，连续小时如3024同进进行荧光染色，可参荧光晃微镜下观察和摄影电子显微镜观察关于凋亡细胞的超微结构特征，包括透射电镜和扫描电镜下的改变，在许我文献中已有详尽描述凋亡细胞的典型形态改变如胞质的固缩，染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜，核的碎裂和凋亡小体形成等，在透射电镜下得到最佳的体现为凋亡细胞判定提供了最可靠的依据本方法的缺点是样品制作过程较复杂，且仪器、设备的费用昂贵，较难广泛大量开展由于样品范围局限，在凋亡细胞数较少时需进行大量的观察才能观察到典型的凋亡改变还应指出的是，在观察体外培养的凋亡细胞时，常可见到各阶段的改变，并可见到较多典型的凋亡细胞时，常可见到各阶段的改变，并可见到较多典型的凋亡小体很少见到，出现较多的是凋亡初期胞体收缩、染色质边聚和后期凋亡小体或整个凋亡细胞被吞噬和降解的现象一些不典型的改变容易被忽略，在观察时要特别予以注意检测方法透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子又重染色，透射电镜观察扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定,乙醇逐级脱水，临界点干燥，真空喷金，扫描电镜观察C02流式细胞技术流式细胞仪检测凋亡细胞是通过检查其光射特征及荧光参数时行的细胞穿过流式细胞仪的激光束集点时使激光发生散射，分析散射光可以提供细胞大小及结构的信息散射光包括前向散射光和左向角散射光两种，前向散射光的强度与细胞大小、体积相产，右向角射光的强度与细胞结构的析射性、颗粒性granu-larity有关细胞凋亡过程中出现的形态改变如细胞皱缩、胞膜起泡、核浓缩和碎裂等可以使光散射特性发生改变早期凋亡细胞主要表现为前向散射光减弱而右向角散射光增强或不变，前者反映了细胞的皱缩，后者反映了细胞的核逐缩及碎裂晚期凋亡细胞的前向散射光和右向角散射光均减弱由于光散射牧场生并非凋亡细胞的特异性指标，细胞的机械性损伤和细胞坏死也可以使前向散射光减弱因此，只有将光散射特性的检测与荧光参数的检测结合起来才能准确地辨认凋亡细胞细胞凋亡过程中核酸内切酶在分子核小体间的降解，导致小分子漏出，核DNA DNA DNA含量下降，细胞荧光染色后作流式细胞仪分析，可以发现在直方图上正常二倍体细胞的DNA峰前出现一个亚二倍体峰（峰，即峰）代表凋亡细胞Go/Gl xub-Gl AP--apoptotic peak,根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分率此外，流式细胞术还可以通过测定线粒体膜的电位、溶酶体质子泵的活性及细胞总蛋白质比例等方法辨认凋亡细胞DNA/检测方法获取密度细胞左右的细胞悬液，精洗，固定，荧光染料染色，上流1x106/ml式细胞仪分析与检测凋亡的方法比较♦TUNEL ELISA法TUNEL细胞凋亡中，染色体双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性末端，可在脱氧DNA31-0H核糖核昔酸末端转移酶（）的作用下，将脱氧核糖核甘酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸TdT酶或生物素形成的衍生物标记到的末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为DNA3脱氧核糖核甘酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有的断裂，mediated nick end labeling,TUNEL\DNA因而没有形成，很少能够被染色实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方3-0H TUNEL法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用.法测细胞凋亡ELISA胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（）的空泡结构细胞凋亡的晚期，cavitations细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体、磷脂酰丝氨酸外翻分析磷脂酰丝氨酸（）正常位于细胞膜2Phosphatidyllserine,PS的内侧，但在凋亡早期，可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中PS是一种分子量为的依赖性磷脂结合蛋白，能与高亲和力特异性Annexin-V35-36KD Ca2+PS结合将进行荧光素或标记以标记了的作为荧光探Annexin-VFITC.PE biotin Annexin-V针利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生碘化丙唾）是一propidine iodide,PI种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,能够透过细胞膜而PI使细胞核红染因此将与匹配使用，就可以将凋亡早晚期的及死细胞区分开来Annexin-VPI方法、悬浮细胞的染色、将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（）用洗次,加a I
0.5x106PBS2入和标记的（）及（）200plBinding Buffer FITC Annexin-V20ug/ml10pl PI50ug/ml室温避光加入,立即用进行流式细胞术定量检测（一般不超过5|jl,30min,400JJIPBS FACScan小时），同时以不加及的一管作为阴性对照口、贴壁培养的细胞染色1AnnexinV-FITC PI先用的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞印、爬片细胞染色同上，最后用荧
0.25%光显微镜和共聚焦激光显微镜进行观察结果及注意事项整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞；操作时注意避光，反应完毕后尽快在一个小时内检测；、线粒体膜势能（）的检测多种细胞凋亡诱导不同的细胞凋亡时，皆发生线粒体跨3mt膜电位巾的下降，并且发现巾下降是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，在4mt4mt细胞核出现凋亡特征（染色质浓缩、断裂）之前，还发现一量线粒体△崩溃，则细胞DNA ipmt凋亡不可逆转线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如细胞凋亡时离子依赖的内源性核酸内切酶将双链从各核小体间连接区,Ca2+,Mg2+DNA裂断，产生单或寡合甘酸小体，各核小体的与核组蛋白形成紧密的复DNA H2A,H2B,H3,H4合物而对内源性核酸酶有抵抗使之不被内源性核酸酶裂解主要使用单克隆抗抗体和抗组DNA蛋白抗体直接检测和组蛋白DNA几种检测凋亡的方法♦
一、形态学观察方法染色、光镜观察凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表L HE面有出芽现象、丫咤橙（）染色，荧光显微镜观察活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光凋2A0亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体、台盼蓝染色如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死3如果细胞膜完整，细胞不为台吩蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助、透射电镜观察可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形,核4膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出芽及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象
二、凝胶电泳DNA（检测原理―X细胞发生凋亡或坏死，其细胞均发生断裂，细胞内小分子量片断增加，高分子DNA DNA减少，胞质内出现片断但凋亡细胞断裂点均有规律的发生在核小体之间，DNA DNA DNA出现片断，而坏死细胞的断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可180-200bpDNA DNA以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别
（二）结果判断正常活细胞电泳出现阶梯状（）条带;坏死细胞电泳类似血抹片时的DNA LADDERDNA连续性条带
三、酶联免疫吸附法（）核小体测定ELISA凋亡细胞的断裂使细胞质内出现核小体核小体由组蛋白及其伴随的片断组成,DNA DNA可由法检测ELISA（-）检测步骤、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；
1、在微定量板上吸附组蛋白体’
2、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合’
3、加辣过氧化物酶标记的抗抗体使之与核小体上的结合’4DNA DNA、加酶的底物，测光吸收制4
（二）用途该法敏感性高，可检测个凋亡细胞可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测该法5*100/ml不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量
四、流式细胞仪定量分析（-）检测原理细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞（-）应用价值流式细胞仪检测具有以下特点）、检测的细胞数量蝇蛇似淀从橙禾逑赴牡蟒宣刺冉献既）、可以做许多相关性1BR2分析）、结合被检测细胞的含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期3DNA■检测形态学及细胞膜完整性的双染色法Hoechs-PI细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞利用染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoechs-PI染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙咤（）而呈强的红色荧光Hoecha PI片断原位标记法■DNA凋亡细胞片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下,用荧DNA光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（）和末端脱氧核deoxyuridinetriphate,DUTP苗酸转移酶（）相反应与凋亡细胞裂解后的羟基（）端结合，经显色反应后检测TdT3♦-0H裂解点的技术DNA片段原位标记法有二种DNA、原位缺口转移（）技术，它是利用多聚酶将标记1in situnick-translation,ISNT DNAI的核甘酸连接到断裂的端DNA3--0H、原位缺口末端标记技术（）即法,它2in situend labellingtechnique,ISEL,TUNEL是利用将标记的接至」端研究证明法的敏感性远高于尤其TdT DUPTI3-0H,TUNEL ISNT,对早期凋亡的检测，更为合适TUNEL■检测细胞膜成分变化的联合法Annexin VPI、原理在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（）迁移至细胞膜外测1PS磷脂结合蛋白（）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白,它于具有高度的结合力VAnnexin VPS因此，可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸故利用对有高度亲和Annexin VPS力的,将标记上荧光素（如异硫氨酸荧光素）,同时结合使用Annexin VAnnexin VFITC PI拒染法（因坏死细胞亦暴露于细胞膜外测，且对高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细PS PI胞仪即可检测凋亡细胞、结果判断正常活细胞、均低染；凋亡细胞高染、低染；2Annexin VPI Annexin VPI坏死细胞均高染Annexin V/PI、应用价值细胞发生凋亡时,膜上的外露早于断裂发生，因此联合3PS DNAAnnexin V染色法检测早期细胞凋亡较法更为灵敏又联合染色不需固定细胞，PI TUNELAnnexin VPI可避免染色因固定造成的细胞碎片过多及法因固定出现的片段丢失因此，PITUNELDNA联合法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法Annexin VPI几点参考♦.大部分凋亡细胞可能并不见得有非常典型的凋亡表型，如电镜的染色体边集、凋亡小体1等，电泳也不见得都有，但对某些指标来说还算稳定，如染色及DNA DNA ladder PITUNEL法，所以如果某个方法效果不好，可以换用其他方法检测.坏死与凋亡的区分传统上认为是无序与有序的过程，楼上所说的线粒体肿大也是以前的2一个传统认识，但现在有很多人认为坏死的发生也是有序发生的，因此也有了程序化坏死一说，在很大程度上，由于凋亡是时间依赖性的过程，细胞发生凋亡也并非同步化的,凋亡的晚期与坏死进行区分是困难的，而且我认为如果不是对于凋亡或是坏死本身通路进行研究的话，强行区分是没有意义的细胞凋亡检测技术与方法♦细胞凋亡（）又称细胞程序性死亡（）是指Apoptosis,PCD:Programmed CellDeath,细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程它是一个主动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程细胞凋亡概念提出至今还不到年的时间，30但由于它在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键角色，对个体的正常发育及细胞凋亡紊乱在病理学研究中的重要作用，引起了人们对其机制和组分的广泛而深入地研究，成为目前生命科学界最为热门话题之一，也是生命科学界乃至社会各界争相投入的研究领域从近年的SCI排名中我们可以看到，信号传导方面的文章远远超过位于第二位的人类基因组方面的，而信号传导中一个重要的前沿领域就是细胞凋亡的研究随着这方面研究的持续升温，涌现出了大量新的技术和方法对细胞凋亡进行检测，其中不少已经有商品化的产品出现，大大加速了研究的进程具体来说，针对凋亡的不同阶段有以下一些方法（概括如图）:1早期检测
1.）（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测1PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生，可能作为免疫系统的识别标PS志一个钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的再通过简AnnexinV,PS,单的显色或发光系统进行检测由于这是一种凋亡早期的活细胞检测（悬浮细胞和贴壁细胞都适用），可与染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段DNA美国著名生物试剂公司和公司分别开发了多种标记的CLONTECH INTERGENAnnexin V产品，简便快速，分钟就可完成检测其中带荧光标记的10Annexin及灵敏度高，可作为V-EGFPEnhanced GreenFluorescent ProteinAnnexinV-FITC,流式细胞分选方法筛选凋亡细胞的基础由于融合蛋白与FACSAnnexinV-EGFP,EGFP PS的结合比例为还可进行定量检测除此之外,还提供生物素偶联的可通过常用的1:1,AnnexinV,酶联显色反应来检测另外，公司将磁珠包被可采用磁分选方法筛选凋亡MACS AnnexinV,细胞细胞内氧化还原状态改变的检测2这反应了细胞凋亡研究中相对较新的趋势，研究什么样的氧化还原环境引起下游事件的发生公司的通过荧光染料CLONTECH ApoAlertTMGlutathione DetectionKit体外检测凋亡细胞细胞质中谷光昔肽的减少来检测凋亡早期细胞内monochlorobimaneMC氧化还原状态的变化正常状态下，谷光昔肽作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂细胞glutathione:GSH内有毒的氧化物通过被还原而定期去除,氧化型的又可被还原酶迅速还原这GSHGSHGSH一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除在和一Jurcat些其它类型的细胞中，细胞膜中有可被凋亡信号启动的依赖的转移系统当细胞内ATP GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒GSH体膜电位的降低，从而使细胞色素三竣酸循环中的重要组分从线粒体内转移到细胞液中，启C动凋亡效应器的级联反应caspase由于与氧化还原作用及线粒体功能密切相关，此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非GSH常有用外，还可用于心脏病、中风等疾病治疗的研究但有些细胞如和细胞凋亡时HeLa3T3没有明显的水平的变化，不能用此法检测GSH细胞色素的定位检测3C细胞色素作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用正常情况下，它存在于C线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，结合Apaf-1后启动级联反应细胞色素apoptotic proteaseactivating factor-1caspase C/Apaf-1复合物激活后者再激活和其它下游caspase-9,caspase-3caspaseo细胞色素氧化酶亚单位是定位在线C IVcytochrome coxidase subunitIV:COX4粒体内膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保留在线粒体内，因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志不用超离心，可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离ApoAlertTMCell FractionationKit出高度富集的线粒体部分，再进一步通过杂交用细胞色素抗体和抗体标示细Western CCOX4胞色素和的存在位置，从而判断凋亡的发生CCOX4线粒体膜电位变化的检测4在凋亡研究的早期，从形态学观测上线粒体没有明显的变化随着凋亡机制研究的深入，发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分，发生很多生理生化变化例如，在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变一个阳离子性的染色剂，MitoSensorTM,对此改变非常敏感，呈现出不同的荧光染色正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光凋亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号公司的CLONTECH就采用这种原理来检测线粒体膜电位的变ApoAlert MitochondrialMembrane SensorKit化但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化.晚期检测2细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些的底物）在核小体之间剪切核产生大Caspase DNA,量长度在的片段对于这一现象的检测通常有以下两种方法180-200bp DNA）（1TUNEL Terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP）nick-end-labeling通过末端转移酶将带标记的（多为）间接（通过地高辛）或直接接到DNA dNTPdUTP片段的端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果美国公司提供多DNA3,-0H Intergen种标记方法，直接荧光标记，地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色，可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测其中，直接标记步骤少，操作简便而间接标记有信号放大的作用，检测灵敏度高）（连接介导的检测）2LM-PCR LadderPCR当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核的变化公司的通过DNA CLONTECHApoAlert®LM-PCR LadderAssay Kit（），连上特异性接头，专一性地扩增核小体的梯度片段，LM-PCR ligation-mediated PCR从而灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段此外，检测是半定量的,因此相同凋LM-PCR亡程度的不同样品可进行比较上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如DNA机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰）（端粒酶检测）3TelemeraseDetection这是相对来说推出较早，用得较多的一种方法端粒酶是由和蛋白组成的核蛋白，它RNA可以自身为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得永生化正常体细胞是没有端RNA粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号研究发现，以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活90%性公司的在年率先推出它提供特Intergen TRAP-eze TelemeraseDetectionKit1996定的寡核甘酸底物，分别与底物及端粒重复序列配对的引物如果待测样本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同个数的碱基（）端粒重复序列，通6GGTTAG过反应产物电泳检测就可观察到相差六个碱基的现象参见图此外，PCR DNALadder4X公司还提供用酶联免疫法（）检测的试剂盒Intergen ELISA同样，这种检测方法也不专对细胞凋亡，检测结果也不纯反应细胞凋亡的发生水平的检测
4.mRNA研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法据报道，蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性细胞Fas T（）等靶细胞和（长的）作为抗凋亡（和）的调cytotoxic Tcells Bcl-2bd-X bd-2bcl-X节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活一般多采用Northern、Rhodamine1233,3-Dihexyloxacarbocyanine、odide[DiOC63]echloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-l]等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱Tetramethyl rhodaminemethylesterTMRM说明线粒体内膜电负性的增高或降低方法将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为终浓度为卬平衡Rhodamine123lpM DiOC625jjM,JC-lM,TMRMQ00|jM,37oC流式细胞计检测细胞的荧光强度结果及注意事项始终保持平衡染液中值的一致30min,PH性，因为值的变化将影响膜电位与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部PH分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化、片断化检测细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩,染色质在核4DNA DNA小体单位之间的连接处断裂，形成长的大片断或整数倍的寡核50-300kbp DNA180-200bp昔酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱细胞经处理后，采用常规方法分DNAladderX离提纯后，进行琼脂糖凝胶和浸化乙咤染色，在凋亡细胞群中则可观察到典型的DNA DNA如果细胞量很少，还可在分离提纯后，用和脱氧核糖核酸末端转移酶ladder DNA32P-ATPo使标记,然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中的形成、TdTDNA DNAladder a大分子染色体片段的测定细胞凋亡的早期，染色体断裂成为长的DNA5O-3OOkbp DNA大片段，所有超过一定分子量大小的双链分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同线性DNA DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时，即达到分辨力的极限此时凝胶不再按分子量大小来筛分DNA,像通过弯管一样，以其一凋指向电声一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为爬行因此，DNA细胞凋亡早期产生的长的大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离通常50-300kbp DNA彩脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场每当电场方向改变后，大的分子便滞流在爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续向DNA前移动分子量越大，这种重排所需要的时间就越长当分子变换方向的时间小电脉DNA DNA冲周期杂交和走胶对它们进行检测随着近年来荧光定量技术的发展，用定量RT-PCR PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确公司的PCR IntergenAmplifluor™就根据这一新技术原理通过检测和长的Apoptosis GeneSystems fas,bax-alpha bcl-X基因的表达水平来进行细胞凋亡的检测mRNA以上介绍了针对凋亡不同阶段特征的检测方法，随着凋亡机制研究的深入，近年来还发展了许多针对特定的凋亡途径的检测，如抗体法，酶活性测定等等，公Cell Signelingtechnology司,公司,公司公司都紧跟科研潮流，开发了DAK0Santa-Cruz,CalbiochemOncogene大量的抗体及活性测定产品随着对细胞凋亡的研究和认识的不断深入，对包括肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本的细胞凋亡的检测已成为一种迫切需要目前，多种方法已得到较广泛的应用然而如何选择适当的方法并对检测的结果作出正确的判断及愉如其分的解释仍是值得探讨的问题本文简要评述几种常用的细胞凋亡检测方法
一、细胞凋亡的形态学观察细胞凋亡的命名主要是根据某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树叶散落apoptosis般的形态学特征目前对细胞凋亡的认识正不断得到深化，检测凋亡细胞的方法也逐渐增多，但形态改变仍是确定细胞凋亡的最可靠的方法光学显微镜观察凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染，形成致密质块，有时可碎裂在染色的组织HE切片中细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在，凋亡细胞与周围细胞分离，不引起炎症反应本方法简便易行，但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难，常缺乏较为特征的指标，具有较强的主观性，重复性差本方法可用于调亡现象的初步观察，作为分析指标之检测方法细胞涂片或组织石蜡切片作染色或染色，在高倍物镜下观察凋亡HE Giemsa细胞的形态改变，结合显微测量工具可作凋亡细胞计数视频时差显微技术叩video time-1se microscopy本方法用于细胞培养，通过相差显微镜可动态观察细胞凋亡的变化过程，尤其是观察细胞表和外形的变化凋胞与基质分离，胞体变圆、收缩、出泡，有的细胞拉长，出现钉状突起，特续数小时后细胞膜破裂，细胞溶解，通过连续观察，本方法可养壑培养中的凋亡细胞，但不能用于病理组织检测方法收集细胞培胞，置于多孔培养板,加入凋亡诱导剂，在带有自动摄像2x105/ml装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态改变，每隔分钟秒作序列摄影，连续小时如3024同进进行荧光染色，可参荧光晃微镜下观察和摄影电子显微镜观察关于凋亡细胞的超微结构特征，包括透射电镜和扫描电镜下的改变，在许我文献中已有详尽描述凋亡细胞的典型形态改变如胞质的固缩，染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜，核的碎裂和凋亡小体形成等，在透射电镜下得到最佳的体现为凋亡细胞判定提供了最可靠的依据本方法的缺点是样品制作过程较复杂，且仪器、设备的费用昂贵，较难广泛大量开展由于样品范围局限，在凋亡细胞数较少时需进行大量的观察才能观察到典型的凋亡改变还应指出的是，在观察体外培养的凋亡细胞时，常可见到各阶段的改变，并可见到较多典型的凋亡细胞时，常可见到各阶段的改变，并可见到较多典型的凋亡小体很少见到，出现较多的是凋亡初期胞体收缩、染色质边聚和后期凋亡小体或整个凋亡细胞被吞噬和降解的现象一些不典型的改变容易被忽略，在观察时要特别予以注意检测方法透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子又重染色，透射电镜观察扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定,乙醇逐级脱水，临界点干燥，真空喷金，扫描电镜观察C02流式细胞技术流式细胞仪检测凋亡细胞是通过检查其光射特征及荧光参数时行的细胞穿过流式细胞仪的激光束集点时使激光发生散射，分析散射光可以提供细胞大小及结构的信息散射光包括前向散射光和左向角散射光两种，前向散射光的强度与细胞大小、体积相产，右向角射光的强度与细胞结构的析射性、颗粒性granu-larity有关细胞凋亡过程中出现的形态改变如细胞皱缩、胞膜起泡、核浓缩和碎裂等可以使光散射特性发生改变早期凋亡细胞主要表现为前向散射光减弱而右向角散射光增强或不变，前者反映了细胞的皱缩，后者反映了细胞的核逐缩及碎裂晚期凋亡细胞的前向散射光和右向角散射光均减弱由于光散射牧场生并非凋亡细胞的特异性指标，细胞的机械性损伤和细胞坏死也可以使前向散射光减弱因此，只有将光散射特性的检测与荧光参数的检测结合起来才能准确地辨认凋亡细胞细胞凋亡过程中核酸内切酶在分子核小体间的降解，导致小分子漏出，核DNA DNA DNA含量下降，细胞荧光染色后作流式细胞仪分析，可以发现在直方图上正常二倍体细胞的DNA峰前出现一个亚二倍体峰（峰，即峰）代表凋亡细胞Go/Gl xub-Gl AP--apoptotic peak,根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分率此外，流式细胞术还可以通过测定线粒体膜的电位、溶酶体质子泵的活性及细胞总蛋白质比例等方法辨认凋亡细胞DNA/检测方法获取密度细胞左右的细胞悬液，精洗，固定，荧光染料染色，上流1x106/ml式细胞仪分析
二、细胞凋亡的细胞化学测定细胞凋亡的细胞化学测定包括细胞表面（细胞膜）的结构和通透性改变的测定和细胞核DNA改变的测定根据应用的范围，又可分为细胞群休和单个细胞测定两种，以下仅介绍其中几种较为常用的方法碘化丙碇（）检测propidium iodide,PI早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与结合的荧光染料（如）DNA PI不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如或等）仍能Hoechest334233258被细胞摄取应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内出现DNA Hoechest标记而不出现标记的为凋亡细胞3342PI检测方法获取细胞的细胞悬液，先用染色，再行11x106/ml PI Hoechest3342染色，进行流式细胞仪分析或荧光显微镜观察及均使用紫外线激PIHoechest3342340nm发，前者荧光为红色后者荧光为蓝色正常细胞蓝色最强早期凋亡细胞由620nm480nm X于的漏出蓝色稍弱并有少量的红色荧光，晚期凋亡细胞红色荧光加强坏死细胞红色荧光DNA最强膜联蛋白annexin V标记正常细胞的细胞膜磷脂分布是不对称的，磷脂酰丝氨酸位于细phosphatidylserine,PS胞膜内侧，在细胞凋亡时转至细胞膜外表面，这一改变被认为是特导性的，并且可作为凋亡细胞表面改变的标记表面化发生于凋早期，其机制尚不清，可能是一种导致机体吞噬凋亡细胞PS的信号膜联蛋白是依赖的磷脂结合蛋白对具有高度亲和力,荧光标记的膜联蛋白V2+PS V与细胞表现结合，再用显微镜或流式细胞仪进行检测，可以观察凋亡过程中细胞膜的表PS PS面化结合染色进行双参数检测尚能区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细PI胞正常细胞膜联蛋白早期凋亡细胞膜联蛋白晚期凋亡细胞和坏死细胞V-PI-,V+PI-,膜联蛋白有研究表明膜联蛋白标记仅有不到三分之一的凋亡细胞出现阳性标VPI+X V+记，其原因尚不明同时需注意度的是凋亡后期溶解阶段，细胞碎片也可出现明显的阳性着色检测方法细胞细胞悬液，先后用膜联蛋白及染色，流式细胞仪分1x106/ml V-FITC PI析，获得由四个象限组成的细胞直方图cytogram,每个象限的细胞数目就是在检测细胞总数在所点的组份左下象限代表正常细胞，右下象限代表早期凋亡细胞右上象An-PI-An+PI-,限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞，左上象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞An+PI+用生物素标记膜联蛋白还可以作体内试验将生物素标记膜联蛋白注射小鼠体An-PI+X VV内，分钟后处死,迅速取出要研究的组织置于甲醛内固定，然后，常规石蜡切片，脱蜡、水化，30用亲和素标记的过氧化物酶程程序孵育，显DAB色，光镜下观察凋亡细胞琼脂凝胶电泳法DNA细胞凋亡时，在内源性核酸内切酶的作用下，在核小体间被切割成整数DNA180-200bp倍的单或寡核甘酸片段，在电泳时表现为特征性的梯形带自把内源性核酸内切酶降Wyllie解产生梯形带与细胞凋亡相联系以来，梯形带被作为细胞凋亡的一个重要的生化指标尽管有报道指出，实验中出现典型的形态改变时可不伴有核小体间的降解，对这一指标提出质DNA疑，本方法仍被广泛应用但此方法敏感性不高，大量凋亡细胞同时存在时才出现典型的结果，且只能被用于细胞群体，不能用于组织的原位检测检测方法培养细胞清洗、离心，加入细胞裂解液裂解，高速离心，取上清液用酚/氯仿抽提二次，酶消化，然后加到含漠已锭的的琼脂糖凝胶的样品的孔中进行电泳，最RNA1%-2%后在紫外线灯下观察和摄影裂解的原位检测DNA在细胞水平检测裂解的原位标记技术已越来越多地被用于组织切片和培养细胞,细胞DNA凋亡时，由于的裂解，形成单或寡核小体的双链相对分子质量小的片段及在相对分子质量DNA大的上形成单的继裂缺口，此类断裂可用生物素、地高辛或荧光素标记的核苗酸DNA nickX在端予以显示通常采用的酶是聚合酶或未端脱氧核苗酸转移酶前者使3-0H DNAI TdT,核甘酸结合于缺口，需要模板存在，标记方法通常被称为原位缺口平移insitunick后者使核甘酸在双链的断端延伸，不需要模板的存在,其方法被称为未端记translation,ISNT、加尾法或end labelingtailing reactionTUNEL TdT-mediated dUTPnick end上述方法，尤其是的应用已很广泛,其优点是可用于原位标记，可用于病理组labeling\TUNEL织，并可进行定量分析值得注意的是坏死期由于内源性核酸内切酶和蛋白质酶的何等用，DNA被切割成大小不等的片段，也可出现阳性反应组织或细胞外理不当时可出现假阳性因而，等方法对凋亡细胞的标记是选择性的而不是特异性的，或其他裂解原TUNEL TUNELDNA位标记的分析应结合阳性细胞的形态，尤其是核的特征，细胞的分布和有无炎症反应，除外非凋亡的阳性反应检测方法石蜡切片常规脱蜡、水化，蛋白质酶消化，酶和核甘酸混合液孵育,显色K TdT（辣根过氧化物酶标记可用显色，碱性磷酸酶标可用显色），复染，脱水，DAB NBT+BCIP封片凋亡细胞核呈现蓝色（显色）或者棕黄色（显色NBT+BCIP DAB1凋亡蛋白质酶（）及其底物的检测Caspase-3凋亡蛋白质酶是一类半胱氨酸蛋白质酶，具有特异性水解底物分子天冬氨酸（）残七Asp C端肽键功能，是近年随着调亡研究的深入而发现的重要凋亡分子迄今已有个分子得到命名，13分别为凋亡蛋白质酶基中凋亡蛋白质是被认为在多种组织、细胞类型中最常涉及的凋1-13-3亡效应分子活化的凋亡蛋白质酶仅在凋亡细胞中发现，因此，检测凋亡蛋白质酶的活性-3-3有助于发现早期的凋亡细胞一般采用人工合成四肽荧光底物如,凋亡蛋白质酶DEVD-AMC-3在与之间水解，释放荧光物质、,后者在紫外线激发下发出波长为D AMCAMC430-460nm的荧光，通过流式细胞仪或分光光度计对其强度进行定量，从而测定凋亡蛋白质酶的活性-3由于醛对凋亡蛋白质酶的水解活性抑制作用,因此同时加入含醛四肽如可以抑制-3DEVD-CHO凋亡蛋白质酶-对的水解，不产生荧光这样的抑制试验可作为对照，使凋亡蛋3DEVD-AMC白质酶的活性分析更有特异性但是，上述方法不适用于组只切片，因此有人尝试采用针对-3活化的凋亡蛋白质酶-亚基的抗体，通过免疫组化显示凋亡细胞，然而其敏感性及特异性尚不3能令人满意检测方法培养细胞（也可以预先作凋亡诱导并在不同时段收集细胞）在裂解液内裂解、离心、去上清液加入凋亡蛋白质酶的底物（如）孵育，同时用不加底物的样品-3DEVD-AMC作对照，流式细胞仪检测，加有底物的样品释放出的荧光强度样对照样品明显增强如加入时再加入,样品释放的荧光强度与对照样品无差异DEVD-AMC DEVD-CHO凋亡蛋白质酶导致细胞凋亡是通过水解或灭活一些细胞关键蛋白质实现的，因此检测凋-3亡蛋白质酶底物的改变也有助于辨认细胞的凋亡是第一个被认识的凋亡蛋白质酶-3PARP-3底物，它的相对分子质量为,水解后形成相对分子质量为及相对分子质量为11600085000的两个片段，用运载相对分子质量为片段的抗体可以观察细胞是否发生凋亡细2500085000胞骨架蛋白中的被凋亡蛋白质酶水解后，在其端的第位氨基酸残基形成CK-18-3C387-396一个新的抗原表位，用抗此表位的抗体可以在组织切片上辨认凋亡细胞另外一种细胞骨架蛋白质肌动蛋白（）被水解后产生一种称为的片段，在凋亡早期出现，并认为与细胞actin fractin膜的起泡有关，可能有助于早期凋亡细胞的辨认总之，随着对凋亡蛋白质酶及其底物的进一步研究，将会发现更有价值的有助于检测凋亡细胞的方法
三、展望除了以上介绍的几种较常用检测细胞凋亡的方尖，还有一些尚未被列入的检测方法，新的方法正将出现尽管用于检测细胞凋亡的方法较多，但形态学观察，尤其是透射电镜观察仍具有不可替代的作用，只是其应用受到一定限制在细胞化学检测方法中，迄今没有任何一种方法具有足够的敏感性和特异性，尤其在病理组织中要作出准确定量分析仍较为因难在目前情况下标本和病变的特点，选择多种适当的方法进行综合检测，常可行到较准确结果，同样重要的是，要充分理解各种方法的原理及应范围，并对结果作出合理的分析和判断随着对细胞凋亡认识的深化和有关技术的进展，期待更敏感、更特异的方法面世，这对于病理状态（包括肿瘤）中细胞凋亡的研究将具有重要意义有关细胞爬片♦处理细胞爬片用灭菌的去离子水将多聚赖氨酸配成处理载玻片过夜即可
1.O.lmg/ml,用前再用去离子水漂洗一次，就可直接接种细胞！.热疗对细胞内热休克蛋白的诱导270陈必良,安晓汾辛晓燕,王德堂,郭慧玲（第四军医大学西京医院妇产科，12,1111陕西西安第四军医大学吉林军医学院附属医院妇产科，吉林省吉林市，710032;2）132011【摘要】目的探讨肿瘤细胞（以人卵巢癌细胞为例）在受热不同时间、不同间隔后细胞内热休克蛋白表达的异同；明确人卵巢癌细胞对热耐受的敏感程度方法体外培养人卵巢癌细70胞,制成细胞爬片加热温度设为℃实验分成两部分
①加热时间分别设为、HO-891042,
15、、、、,加热后立即固定细胞；
②将细胞加热后，置于（细306090120150min120min37胞培养箱中复温不同时间，收集复温后、、、、、、、、lh4h6h12h24h48h72h96h120h,144h后的细胞爬片固定然后将两组细胞爬片行的免疫组化染色，观察热疗前后的HSP70HSP70不同表达结果未加热细胞仅有少量的表达，随加热时间延长，的表达逐渐增HSP70HSP70多；加热后不同间隔的表达不同，间隔的表达最强，随后逐渐减少,天HSP706h HSP705-6后，恢复至未加热状态结论
①温和加热时间过长可诱导的大量产生，从而使肿瘤细胞对热疗产生热耐受作用；
②卵巢癌HSP70细胞对加热有较强的耐受性HO-8910关键词热休克蛋白;免疫组织化学；热耐受；卵巢癌；70随着科学技术和医学科学的发展，对癌症的诊断和治疗有了长足的进步高温治疗也称热疗（又叫温热疗法），以其无手术痛苦、无术后并发症及无化疗及放疗带hyperthermia,HT,来的副反应而发展成为癌症治疗的有一种有效方法［］高温可导致肿瘤细胞死亡或者生长抑1制，同时高温还可提高肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性，因为肿瘤细胞对于高温的敏感性明显高于正常细胞但在应用过程中也发现，随热疗重复次数的增加，热疗效果反而下降，会出现所谓热耐受（）现象，即第次加温可影响第次加温的生物学效应这说明thermotolerance12在热疗过程中，肿瘤细胞内生成了某些物质可降低其对热的敏感性研究表明⑵，该现象与热休克蛋白家族尤其与热休克蛋白（）的关系密切本研究利用人卵巢癌细胞70HSP70HO-8910受热后进行免疫组化染色，以了解在该细胞中的表达与加热之间的关系HSP70HSP70材料和方法1材料人卵巢癌细胞系为分化差的卵巢浆液性囊腺癌细胞，由第四军医大学
1.1HO-8910西京医院实验室提供成套免疫组化试剂盒（产品编号）及显色试剂盒HSP70SA2077DAB（产品编号）均购自武汉博士德生物工程有限公司ED1022方法
1.2加热处理将细胞接种于含热灭活的小牛血清及双抗的（
1.
2.115%RPMI1640Gibco时，就可以按其分子量大小分开、测定方法:收获细胞沉淀DNA bDNAladderQx107一细胞裂解液收集上清和℃一蛋白酶T13000rpm,5min,T1%SDS RnaseA5mg/ml56,2h℃体积醋酸钠和倍体积的冷无水乙醇沉淀过夜K
2.5mg/ml37,2h^l/103M
2.5DNA,4C-最后将沉淀溶解在中加琼脂糖凝14000rpm,15minT TEbuffer DNAloading Buffer-
1.2%胶电泳,染色并照相、凋亡细胞含量的流式细胞计分析:方法收集细胞冷乙醵EB CDNA-70%℃固定过夜洗涤℃消化in PBS4-PBS,1000rpm,10min-Rnase A
0.5ug/ml37，室温避光分析亚二倍体的形成及细胞周期30min^PI50ug/ml^fe15min-FACScan DNA的变化、检测参考提供的方法D ApoalertTMLM-PCR LadderCOLNTECH、法细胞凋亡中，染色体双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性5TUNELDNA3-0H末端，可在脱氧核糖核昔酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成和衍生物标记到的-末端，从而进行凋亡细胞的检测这类方法称为脱氧核糖核昔酸末端转移酶介导的DNA3缺口末端标记法terminal deoxynucleotidyltransferase mediated nickend由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有的断裂，因而没有形labeling,TUNEL XDNA3-0H成,很少能够被染色法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个TUNEL凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用、活性的检测家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，6Caspase-3Caspase其中为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能Caspase-3Caspase-3正常以酶原的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段,它被激活，活化形式的32KDCaspase-3由两个大亚基和两个小亚基组成，裂解相应的17KD12KD）培养液中,常规培养取对数生长期的细胞，经胰酶消化后制成细胞悬液，细BRL,USA
0.25%胞密度为将大小的盖玻片置于孔板中，每孔加入的细胞悬液，lxl05/ml lcmx1cm241ml制成细胞爬片后，将孔板置于培养箱中分别进行两种实验处理
①加热时间12h2442°C分别设个时间点,即、、、、和,加热后的细胞即刻用615306090120150min
0.01M PBS洗涤次，用多聚甲醛固定细胞,制成细胞爬片后置于℃冰箱中保存备用；
②将细24%40min4胞加热后，置于细胞培养箱中复温不同时间，收集复温后、、、、、120min37V
1461224、、、及后的细胞爬片按照上述步骤处理细胞固定后备用487296120144h表达的免疫组化染色检测将细胞爬片置于中室温孵育
1.
2.2HSP703%H2O210min,以蒸储水洗涤后次滴加正常山羊血清封闭液室温放置、滴加小鼠抗的抗体℃20min HSP
70371、滴加二抗及试剂室温下各放置,最后以显色染色时间统一设为h SABC20min DAB5min后终止再经苏木素轻度复染、常规脱水、透明和封片后，于显微镜下观察并照相阳性细胞胞浆/胞核染成棕黄色统计学处理采用等级资料的秩和检验
1.
2.3结果2
①在℃条件下，加热不同时间，卵巢癌细胞细胞内的表达见表42HO-8910HSP7010未加热的细胞内（见图）有少量的表达，表现为胞浆内有极淡的淡黄染色；当℃1A,HSP7042加温时细胞内的表达与正常细胞相比较无明显改变加热后（见图,15min HSP7030min1可见胞浆内的染色略增强，但颜色仍较淡，仅限于胞浆，但胞浆染色数量增加；无胞核HSP70染色；加温时（见图）可见胞浆内的表达增强，表现为胞浆染色加深呈深60min1C,HSP70黄色，染色细胞接近，但未见核染色；加温时（见图100%90min）胞浆内染色进一步加强呈棕黄色，偶尔可见核染色；加温时（见图）胞浆内ID,120min1E,染色表现为明显的棕黄色，核染色的细胞增多；加温时（见图）,胞浆内呈深棕黄150min1F色，核染色细胞数进一步增多表细胞温和加热不同时间的免疫组化染色1HO-8910组别例数染色分级胞浆染色的细胞数核染色的细胞数第一组（淡黄色）〜10I40%50%0第三组（淡黄色）20I80%〜90%0第二组（淡黄色）〜15I40%50%0第五组（棕黄色）20m100%5%第六组（棕黄色）20m〜100%10%15%第四组（深黄色）20H100%0第七组（深棕黄色）〜20IV100%20%30%X P
0.05注:
①第一组为未加热细胞；第二组为（加热;第三组为（加热4215min4230min;第四组为加热;第五组为（加热;第六组为（加热42C60min4290min42120min;第七组为℃力口热42120min
②免疫组化细胞染色分级标准——淡黄色级；深黄色口级；棕黄色级；深棕黄色级I mIV
②细胞加热后，间隔不同时间进行免疫组化染色，结果表明，加热后HO-8910120min,细胞染色呈深棕黄色仍保持强阳性（级），未见明显淡化；加热后（见图）在1h IV4h2A,所有染色的细胞爬片中，细胞染色表现为最强级，核染色的细胞约占;加热后几乎IV50%6h,维持原水平；加热后可见胞浆染色有所淡化呈级棕黄色，但核染色未见明显减少（见12h,HI图;加热后染色程度呈级，染色细胞数量仍保持但胞核染色明显减少，（见224h,m100%,图）;加热后,核染色全部消失，胞浆染色明显变淡呈口级深黄色（见图）2C48h2D;72h后，的表达进一步减少，细胞染色呈黄色（图）随后，细胞染色每隔即有明HSP702E,24h显淡化趋势，后，细胞恢复至正常状态120h讨论3肿瘤热疗学是近年来迅速发展起来的一门新兴学科，为肿瘤患者的治疗带来了一线生机20［］在临床应用过程中，发现肿瘤细胞可出现对热的耐受现象，尤其是当加热温度低于℃343（温和热疗）或加热时间过长时，更易发生热耐受［］热耐受不是细胞固有的特性、不遗传，4是一种暂时现象，可能是热疗过程中肿瘤细胞产生的某些物质降低了其对热的敏感性研究表明，肿瘤细胞在热应激发生后，最根本的变化是蛋白质谱的改变，表现为合成了一组特殊的高度保守的蛋白质——或称为应激蛋白［］,而正常蛋白质合成却被抑制是高热诱导的一种HSP5HSP适应性蛋白，属于一种分子伴侣，主要功能在于当细胞处于应激状态时，可纠正新合成蛋白质的折叠和空间构象错误，协助转运蛋白质，抵抗应激原引起的变性，维持生理平衡，从而降低高热诱导的细胞凋亡⑹在家族的众多成员中，是最出色的热耐受预测因子口加热过HSP70HSP程中，伴随水平的升高，正常蛋白质的合成受到不同程度的抑制加温后半小时无蛋白HSP70质的合成，随着的产生,蛋白质的生物合成逐渐恢复，肿瘤细胞的自我保护机制开始启HSP70动，从而引起肿瘤细胞对热的敏感性下降卵巢癌是威胁女性健康的生殖器三大恶性肿瘤之一，死亡率高，年生存率不到由于550%o耐药及抵抗放疗效果的肿瘤细胞出现，为卵巢癌的治疗带来了新问题随着热疗学理论的日趋成熟，已有研究将其应用于卵巢癌的临床治疗［］为了更好的将这一理论应用于临床，有必要8了解卵巢癌细胞对热疗的敏感性本实验结果表明
①人卵巢癌细胞在未加热状态下，即有少量的表达，HO-8910HSP70当给予温和加热（即加热温度为℃）时，短时间内，诱导产生的未见明显增加力42HSP70口热时间后，尤其是加热时间超过后,的表达明显增加，表现为随260min120min HSP70加热时间的延长而胞浆的染色加深，而且核染色阳性的细胞数量明显增多，这一结果表明细胞的热耐受已启动
②当细胞受热后，停止加热，在最初的几个小时内（）120min1~4h,HSP70的表达保持加热当时的水平,后,的生成达高峰，表现为染色程度最强，核染色细胞4h HSP70数量最多，说明此时细胞对热的敏感性最差如再次加热，高温对该细胞的细胞毒作用最低此后，随着时间的推移，的表达明显减少，后恢复至正常水平从实验结果还可HSP705~6d看出，卵巢癌细胞对的表达有一定的时间依赖性，这也是临床上肿瘤热疗间HO-8910HSP70隔需的原因之一此外，虽然可通过提高加热温度来减少的表达，但毕竟3~4d HSP7039（乙的温度对于人体来说是能够承受的温度，因而，可考虑通过抑制热疗过程中的~42HSP生成而提高热疗的效率，国外已有相关的文献报道［］9一般而言，肿瘤细胞受热温度偏低，时间越长，越易形成热耐受［］人卵巢癌细胞10细胞在受热后，就已有明显的的表达，而该细胞的恢复过程时间却HO-891060min HSP70长达,这就提示我们肿瘤细胞对加热有一定程度的耐受性，而且热耐受因细胞不同而有5~6d不同的表现因此，在临床应用过程中需要考虑到这一要素
[11],细胞坏死与细胞凋亡♦细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法
一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法光学显微镜和倒置显微镜1未染色细胞凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期1可见凋亡小体贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落染色细胞常用姬姆萨染色、瑞氏染色等凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、2染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜2一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况常用的特异性染料有:（）（DNA H033342Hoechst33342,HO33258Hoechst）三种染料与的结合是非嵌入式的，主要结合在的碱基区紫33258,DAPI DNADNAA-T0外光激发时发射明亮的蓝色荧光是与特异结合的活性染料，储存液用蒸储水配成的浓度，使用时HoechstDNAlmg/ml用稀释成终浓度为〜PBS25mg/ml为半通透性，用于常规固定细胞的染色储存液用蒸储水配成的浓度,使用DAPI lmg/ml终浓度一般为〜
0.5lmg/ml结果评判细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期期的细胞核呈波纹状I（）或呈折缝样（）部分染色质出现浓缩状态；期细胞核的染色质高度rippled creased,Ha凝聚、边缘化；期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体（图）Ub lo透射电子显微镜观察3结果评判凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩凋亡期（）的细胞I pro-apoptosis nuclei核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（）的空泡结构（图）期细胞cavitations2;Ha核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体
二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（法）AnnexinV磷脂酰丝氨酸正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，Phosphatidylserine,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中图是一种分PS3Annexin-V子量为的依赖性磷脂结合蛋白，能与高亲和力特异性结合将35~36KD Ca2+PS Annexin-V进行荧光素、或标记，以标记了的作为荧光探针，利用流式细胞FITC PEbiotinAnnexin-V仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生碘化丙碇是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中propidine iodide,PI晚期的细胞和死细胞，能够透过细胞膜而使细胞核红染因此将与匹配使用，PI Annexin-VPI就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来方法悬浮细胞的染色将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞〜用洗次,力口
10.51x106PBS2入和标记的室温避光,100ul BindingBufferFITCAnnexin-V20ug/ml lOul,30min再力口入,避光反应后,力口入立即用PI50ug/ml5ul5min400ul BindingBuffer,进行流式细胞术定量检测一般不超过同时以不加及的一管FACScan lh,AnnexinV-FITC PI作为阴性对照贴壁培养的细胞染色先用的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞
20.25%爬片细胞染色同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察3结果[图、图45]注意事项整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞
1..操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测2
三、线粒体膜势能的检测线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，DYmt它发生在细胞核凋亡特征染色质浓缩、断裂出现之前，一旦线粒体崩溃，则细胞DNA DYmt凋亡不可逆转线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如、Rhodamine1233,]、3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC63Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol等可结合到线carbocyanineiodide[JC-l]Tetramethyl rhodaminemethyl esterTMRMx粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低方法将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为或Rhodamine123ImM终浓度为℃平衡流式细胞计DiOC625nM,JC-1ImM,TMRMlOOnM,3730min,检测细胞的荧光强度注意事项始终保持平衡染液中值的一致性，因为值的变化将影响膜电位
1.pH pH与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料
2.的浓度，引起假去极化胞浆胞核底物在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，的活性明Caspase-3显下降、分析测定的大小亚基及对底物多聚（核糖）聚合a Westernblot Caspase-3ADP-酶（）等的裂解、荧光分光光度计分析方法收[poly ADP-ribose polymerase,PARP]b获细胞正常或凋亡细胞洗涤一抽提细胞裂解液一加（四肽荧-PBS Ac-DEVD-AMC Caspase-3光底物）℃反应荧光分光光度计（）分析荧光强度（激发光波长发射-37lh-polarstar380nm,光波长为、流式细胞术分析方法收获正常培养或凋亡细胞洗涤一加430-460nm\c-PBS反应流式细胞计分析阳性细胞数和平均荧光强度Ac-DEVD-AMC—37°C lh-UV Casspase-3检测细胞凋亡的实验方法比较与检测凋亡的方法比较♦TUNEL ELISA法TUNEL细胞凋亡中，染色体双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性末端，可在脱氧DNA3--0H核糖核昔酸末端转移酶（）的作用下，将脱氧核糖核昔酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷TdT酸酶或生物素形成的衍生物标记到的末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称DNA3为脱氧核糖核昔酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有transferasemediatednickendlabeling,TUNEL X的断裂，因而没有形成，很少能够被染色实际上是分子生物学与形态学DNA3--0H TUNEL相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用.法测细胞凋亡ELISA细胞凋亡时，离子依赖的内源性核酸内切酶将双链从各核小体间连接Ca2+,Mg2+DNA区裂断，产生单或寡合甘酸小体，各核小体的与核组蛋白形成紧密的DNA H2A,H2B,H3,H4复合物而对内源性核酸酶有抵抗使之不被内源性核酸酶裂解主要使用单克隆抗抗体和抗DNA组蛋白抗体直接检测和组蛋白DNA几种检测凋亡的方法♦
一、形态学观察方法、染色、光镜观察凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞1HE表面有“出芽现象、丫口定橙（）染色，荧光显微镜观察活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光凋2A0亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体、台盼蓝染色如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死3如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助、透射电镜观察可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形,核4膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出芽及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象
二、凝胶电泳DNA（检测原理―X细胞发生凋亡或坏死，其细胞均发生断裂，细胞内小分子量片断增加，高分子DNADNA减少，胞质内出现片断但凋亡细胞断裂点均有规律的发生在核小体之间，DNADNADNA出现片断，而坏死细胞的断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可180-200bpDNA DNA以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别
（二）结果判断正常活细胞电泳出现阶梯状（）条带;坏死细胞电泳类似血抹片时的DNA LADDERDNA连续性条带
三、酶联免疫吸附法（）核小体测定ELISA凋亡细胞的断裂使细胞质内出现核小体核小体由组蛋白及其伴随的片断组成，DNADNA可由法检测ELISA（-）检测步骤、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；
1、在微定量板上吸附组蛋白体’
2、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合’
3、加辣过氧化物酶标记的抗抗体使之与核小体上的结合4DNADNA、加酶的底物，测光吸收制4
（二）用途该法敏感性高，可检测个凋亡细胞可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测该法5*100/ml不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量
四、流式细胞仪定量分析（-）检测原理细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞
（二）应用价值流式细胞仪检测具有以下特点）、检测的细胞数量嵋蛇似泥从橙禾逑赴牡蟒宣刺冉献既）、可以做许多相关性1BR2分析）、结合被检测细胞的含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期3DNA■检测形态学及细胞膜完整性的双染色法Hoechs-PI细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞利用染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoechs-PI染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙咤（）而呈强的红色荧光Hoecha PI片断原位标记法■DNA凋亡细胞片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下,用荧DNA光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（）和末端脱氧核deoxyuridinetriphate,DUTP甘酸转移酶（）相反应与凋亡细胞裂解后的羟基（）端结合，经显色反应后检测TdT3•-0H裂解点的技术DNA片段原位标记法有二种DNA、原位缺口转移（）技术，它是利用多聚酶将标记1in situnick-translation,ISNT DNAI的核苗酸连接到断裂的端DNA3•-0H、原位缺口末端标记技术（）即法，它2in situend labellingtechnique,ISEL,TUNEL是利用将标记的接到端研究证明法的敏感性远高于尤其对TdT DUPT3-0H,TUNEL ISNT,早期凋亡的检测，更为合适TUNEL■检测细胞膜成分变化的联合法AnnexinVPI、原理在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（）迁移至细胞膜外测1PS。
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