《荧光和发光光度法》课件

荧光和发光光度法光分析技术高灵敏度检测方法应用广泛的分析手段课程概述课程目标掌握荧光和发光光度法基本原理主要内容原理、仪器、方法和应用学习成果能独立进行荧光分析实验第一章光致发光基础基本概念研究历史光能量被物质吸收后重新辐射从斯托克斯发现到现代应用重要性高灵敏检测技术基础光致发光原理

1.1能级图Jablonski能量释放直观展示能量转换过程电子激发激发态回到基态释放光子分子吸收光子跃迁至激发态荧光与磷光的区别

1.2荧光磷光寿命短（纳秒级）寿命长（毫秒至小时）单重态基态跃迁三重态基态跃迁→→光停即灭余辉现象发光材料类型

1.3无机荧光材料2稀土掺杂材料、磷光体有机荧光材料1荧光素、罗丹明等量子点3尺寸可调光谱特性斯托克斯位移

1.4定义影响因素激发波长与发射波长之差溶剂极性、分子结构应用意义减少背景干扰，提高信噪比第二章荧光光谱仪器系统集成各部件协同工作数据处理信号转换与分析控制系统参数设置与反馈核心组件光源、单色器、样品室、检测器荧光光谱仪基本结构

2.1光源1提供稳定激发光单色器2选择特定波长样品室3放置待测物检测器4收集发射光激发光源

2.2氙灯连续光谱，强度高汞灯线状光谱，特定波长强度大激光器单色性好，方向性强单色器类型

2.31nm

0.1nm棱镜单色器光栅单色器利用折射原理衍射分光效率高10nm滤光片简单经济易更换检测器

2.4光电倍增管检测器CCD响应快，灵敏度高二维成像，空间分辨光电二极管阵列同时多波长检测仪器性能参数

2.5第三章荧光光谱测量样品制备溶解、稀释、调节条件参数设置波长、扫描速度、狭缝宽度数据采集光谱记录与分析激发光谱

3.1测量方法监测特定发射波长的强度变化定义固定发射波长，扫描激发波长应用确定最佳激发条件发射光谱

3.2特征1反映分子能量状态分布测量步骤2固定激发波长，扫描发射波长数据解释3峰位置、强度、形状分析同步荧光光谱

3.3原理优势应用实例激发和发射单色器同步扫描谱峰变窄，选择性提高混合物分析，结构表征时间分辨荧光光谱

3.4荧光寿命测量技术数据分析激发态平均存在时间时域法脉冲激发后衰减指数拟合分子环境敏感指标频域法相位差和调制度寿命分布计算荧光偏振

3.5分子旋转运动研究1大分子结合检测偏振度计算2⊥⊥‖‖P=I-I/I+I平行垂直光强测量3偏振片调节光路偏振光激发4选择性激发荧光分子第四章荧光定量分析样品制备标准溶液配制标准曲线绘制信号与浓度关系样品测量荧光信号获取结果计算浓度反推与校正定量分析基础

4.1定律Beer-Lambert低浓度下荧光强度正比于浓度线性范围通常跨越个数量级3-4检出限常达纳摩尔级别标准曲线法

4.2制作步骤系列标准溶液配制与测量注意事项避免内滤效应和仪器漂移误差分析评估线性区间和置信度内标法

4.3原理选择内标物计算方法加入已知浓度内标物与待测物性质相似基于信号强度比值加标法

4.4荧光淬灭分析

4.5静态淬灭动态淬灭方程Stern-Volmer形成非荧光复合物碰撞引起能量损失₀F/F=1+Kq[Q]寿命不变寿命减小线性关系判断淬灭类型第五章化学发光基础化学能转化激发态形成反应释放能量产物分子获能信号检测光子释放无需外部光源激发态弛豫发光化学发光原理

5.1定义能量转换过程与荧光的区别化学反应产生光子辐射化学能电子激发能光能无需外部光源激发→→化学发光类型

5.2间接化学发光能量转移给发光体2直接化学发光1反应产物直接发光电化学发光3电极表面反应发光常见化学发光体系

5.3鲁米诺体系碱性条件下氧化发蓝光草酸酯体系过氧化物氧化发多色光吖啶酯体系高灵敏度标记物影响化学发光的因素

5.4pH8-1025°C值温度pH影响反应速率和量子产率改变反应动力学⁻10⁶M催化剂金属离子或酶促进反应第六章化学发光仪器样品处理系统自动进样和混合检测系统高灵敏度光电转换信号处理系统数据采集与分析化学发光分析仪

6.1结构组成反应池、检测器、进样系统工作原理自动混合试剂产生光信号性能特点高灵敏度、宽线性范围流动注射化学发光系统

6.2系统构成蠕动泵、注射阀、反应管、检测器操作流程样品注入、试剂混合、信号检测应用优势高通量、低试剂消耗电化学发光仪器

6.3电极系统电位控制工作电极、参比电极、辅助电精确施加电压或电流极信号采集3同步光电信号记录生物发光测量仪器

6.4第七章化学发光分析方法反应体系选择1针对不同分析物样品前处理消除基质干扰定量方法应用从信号到浓度直接测定法

7.1原理1样品直接参与发光反应操作步骤2样品与试剂混合后立即测量应用范围3过氧化物、还原剂、金属离子动力学法

7.2初速度法积分法数据处理反应初期发光强度测量整个发光过程光子总数积分面积计算防止产物抑制干扰减少随机波动影响速率常数拟合酶催化化学发光

7.3底物选择2高量子产率发光反应酶标记技术1标记目标生物分子灵敏度提高酶促放大效应免疫化学发光分析

7.4原理标记物选择抗原抗体特异性结合酶、吖啶酯、鲁米诺衍生物临床应用激素、肿瘤标志物检测第八章荧光探针敏感探针离子探针酶活性探针pH可视化酸碱环境变化特异性检测金属离子实时监测生物催化反应荧光探针设计原理

8.1光谱特性调控波长可调和高量子产率结构性能关系-发色团和受体基团设计选择性设计识别基团特异性结合小分子荧光探针

8.2生物大分子荧光探针

8.3核酸探针蛋白质探针荧光原位杂交，序列检测荧光标记抗体，荧光蛋白DNA酶活性探针荧光底物，活性为条件的发光纳米荧光探针

8.4量子点上转换纳米颗粒金属纳米簇尺寸调控发光波长近红外激发可见光发射超小尺寸发光体高亮度耐光漂白深层组织成像低毒性生物兼容第九章应用实例基础研究1分子互作和结构分析医学诊断临床检验和生物成像环境监测污染物快速筛查工业分析质量控制和过程监测环境分析

9.1ppb ng/L重金属检测有机污染物分析荧光淬灭或增强分析荧光指纹图谱识别min水质监测现场快速检测设备生物医学分析

9.2疾病诊断药物筛选生物标志物检测高通量细胞分析生物成像细胞和组织可视化食品安全检测

9.3法医科学应用

9.4血迹检测鲁米诺反应可视化隐藏血迹分析2DNA荧光标记核酸探针毒品检测免疫荧光快速筛查第十章新技术与发展趋势技术创新新型探针与检测方法仪器进步高灵敏度小型化设备应用拓展跨学科融合发展单分子荧光技术

10.1原理仪器要求应用前景检测单个分子发出的荧光信号高数值孔径物镜分子机器研究突破集体平均的限制高灵敏度检测器单细胞分析超分辨荧光显微技术

10.2显微镜技术技术STED PALMSTORM受激发射损耗突破衍射极限光活化定位显微成像随机光学重构显微镜多模态成像技术

10.3荧光-MRI高对比度软组织成像荧光-CT结合分子信息与结构信息荧光光声成像-提高组织穿透深度化学发光新材料

10.4有机金属配合物长余辉材料高量子产率稳定性好持续发光无需外源激发刺激响应材料对外界条件变化发光智能荧光传感

10.5物联网应用可穿戴设备远程实时环境监测体液成分荧光检测环境监测水土气污染物快速预警实验部分荧光测量实践样品制备溶液配制与处理仪器操作参数设置与校准数据采集光谱记录与保存结果分析数据处理与解释实验一荧光光谱测定123仪器操作数据采集结果分析荧光光谱仪使用步骤激发和发射光谱记录峰位置及强度解释实验二化学发光动力学研究反应体系配制鲁米诺和过氧化氢溶液准备动力学曲线测定时间分辨信号采集数据处理方法反应速率常数计算总结与展望技术发展方向灵敏度提高和应用扩展课程回顾基础原理到实际应用应用前景展望多学科交叉融合。