《基因的克隆与表达》课件

基因的克隆与表达本课程将深入探讨基因克隆与表达技术从基础概念到前沿应用通过系统学习掌握分子生物学核心技能基因克隆与表达的背景意义医药应用疫苗研发与抗体药物生产农业应用抗虫作物与高产品种培育基础研究遗传学与分子生物学根基什么是基因克隆基本定义分子克隆分离特定DNA片段并在宿主中利用载体系统在微生物中复制进行扩增目标基因区别要点与生物体克隆不同，仅复制特定基因序列什么是基因表达转录翻译功能实现DNA转换为RNA RNA转换为蛋白质蛋白质执行生物学功能分子生物学基本工具限制性内切酶DNA连接酶识别特定DNA序列并切割连接DNA片段形成新分子凝胶电泳分离并鉴定DNA片段大小载体简介质粒载体噬菌体载体其他载体环状双链DNA分子容纳更大片段人工染色体易于操作与纯化感染效率高穿梭载体常用于常规克隆适合基因组文库构建表达载体质粒的基本结构抗性基因多克隆位点用于筛选含质粒的菌落含多种限制酶识别序列复制起点ORI目的基因控制质粒在宿主中复制插入的外源基因区域限制性内切酶的识别与切割酶名识别序列切割方式EcoRI G↓AATTC粘性末端BamHI G↓GATCC粘性末端SmaI CCC↓GGG平末端连接酶的作用机制DNA底物结合DNA连接酶识别DNA断裂位点ATP激活ATP提供能量形成酶-腺苷酰基复合物磷酸二酯键形成连接DNA片段的5磷酸与3羟基分子的提取与纯化技术DNA酚/氯仿法硅胶柱法磁珠法经典方法，去除蛋快速高效，低污染易自动化，适合高白质通量自动化平台标准化程度高，减少人为误差聚合酶链式反应（）PCR退火55-65°C，引物结合变性95°C，DNA解旋成单链延伸72°C，DNA聚合反应体系与条件PCR1模板DNA引物1-10ng基因组DNA或1-5ng质粒DNA正反向各

0.2-1μMDNA聚合酶dNTPs1-

2.5单位Taq或高保真酶各

0.2mM，提供延伸所需核苷酸反转录（）PCR RT-PCRmRNA提取从样品中分离总RNA反转录利用逆转录酶合成cDNAPCR扩增扩增目标cDNA片段结果分析检测基因表达水平基因克隆的基本流程基因片段获取PCR扩增或限制酶切载体准备限制酶切开并纯化连接将目的基因插入载体转化导入宿主细胞筛选鉴定获取重组子外源基因的获取方式cDNA文库筛选PCR扩增合成寡核苷酸法从已构建的cDNA文库中筛选目标基设计特异性引物扩增目标序列人工合成整个基因序列因快速高效可引入定点突变适合已知序列的基因获取需要已知部分序列信息成本较高但完全定制化高通量但耗时片段的修饰与标记DNA243端修复类型常用标记分子加尾方法平末端和粘性末端处理荧光素、生物素、放射性同位素A尾、T尾、适配器连接基因载体构建策略设计选择合适载体和连接方式限制酶消化产生兼容末端连接反应T4DNA连接酶催化重组技术同源重组或位点特异性重组克隆载体的转化化学转化法电转化法CaCl₂处理细胞电脉冲形成膜孔热激促进DNA进入DNA快速进入细胞操作简便，成本低高效率转化效率中等设备要求高重组子鉴定方法抗性筛选利用载体抗性基因在选择培养基上筛选蓝白斑筛选基于lacZα肽互补作用与X-gal底物显色菌落PCR直接以菌落为模板进行PCR验证质粒提取与酶切分析提取质粒进行限制性内切酶鉴定分子鉴定实验限制酶切分析PCR验证测序验证根据片段大小确认插入特异引物扩增验证插入序列确定插入序列的精确碱基组成基因表达载体设计要素表达系统选择原核或真核表达系统启动子选择组成型或诱导型融合标签便于检测与纯化终止子转录终止信号选择标记筛选阳性转化子原核表达系统（大肠杆菌）优势局限性常用菌株/载体•生长迅速•缺乏真核翻译后修饰•BL21DE3•遗传背景清晰•易形成包涵体•Rosetta™•表达量高•内毒素污染•pET系列•操作简便•大蛋白表达困难•pGEX系列•成本低廉真核表达系统简介系统优势主要应用酵母高产量，可分泌简单蛋白，疫苗昆虫高效翻译后修饰复杂蛋白研究哺乳动物最接近天然修饰抗体，糖蛋白蛋白表达调控原理启动子强度抑制/诱导系统2决定转录起始效率控制表达开关核糖体结合位点mRNA稳定性影响翻译效率影响蛋白产量4表达载体的选择与优化选择性标记抗性基因便于筛选多克隆位点多种酶切位点便于克隆表达控制元件强启动子与有效终止子宿主兼容性载体与宿主系统匹配标签融合蛋白的构建标签类型大小纯化方法主要用途His标签6-10个组氨镍亲和层析快速纯化酸GST标签26kDa谷胱甘肽亲增加溶解性和层析MBP标签42kDa麦芽糖亲和提高溶解性层析FLAG标签8个氨基酸抗体亲和层蛋白检测析基因表达的检测方法转录水平检测翻译水平检测•RT-PCR分析mRNA•Western Blot•北方杂交•ELISA•RNA-seq测序•质谱分析诱导蛋白表达实验设计培养至适宜密度1OD600达

0.6-

0.8加入诱导剂2IPTG终浓度

0.1-1mM调整培养条件温度16-37°C优化诱导时间2-16小时蛋白表达产物的纯化细胞裂解超声波或化学裂解释放蛋白初步纯化离心分离去除细胞碎片亲和层析利用标签特异性结合深度纯化离子交换或凝胶过滤蛋白表达分析案例菌体表达蛋白纯化功能验证GFP在大肠杆菌中表达His标签亲和纯化荧光显微镜下观察难溶蛋白的表达策略降低诱导强度降低IPTG浓度，减缓表达速率降低培养温度16-25°C低温培养，促进正确折叠改变宿主菌株选用专门菌株如Origami或Arctic Express融合可溶性标签使用MBP、SUMO、Trx等增加溶解性分泌蛋白表达方案信号肽设计导向蛋白分泌分泌表达蛋白进入胞外培养基收集收集含目标蛋白上清纯化处理从培养基中分离蛋白表达产物的功能验证42主要验证方式结构分析方法结构、活性、互作与体内功能X射线晶体学和冷冻电镜3活性检测酶学分析和结合力测定裂解重组蛋白的回收与纯化细胞破碎超声、高压或酶法裂解离心分离去除细胞碎片柱层析纯化亲和、离子交换和凝胶过滤浓缩与透析4去盐并提高蛋白浓度基因工程在疫苗研发中的应用基因克隆在药物制造领域的价值100+$270B重组蛋白药物市场规模全球市场已批准品种数量2022年生物药物全球市场12%年增长率生物技术药物市场增速农业基因工程表达实例克隆与表达在生物传感器中的创新荧光蛋白报告系统生物发光系统细胞内感应系统GFP/YFP/RFP标记荧光素酶报告基因转录因子耦合报告实时监测基因表达高灵敏度检测特异性识别目标分子无需添加底物低背景信号信号放大检测基因编辑与表达平台结合CRISPR/Cas9CRISPRa CRISPRi基因组筛选精准基因组编辑基因表达激活基因表达干扰高通量功能基因组学基因合成与定制表达基因设计DNA合成密码子优化与功能元件自动化寡核苷酸合成2表达验证基因组装测试功能并优化片段连接成完整序列高通量克隆与表达技术自动化液体处理系统大幅提高克隆效率机器人菌落挑取器可同时处理数千样本高通量表达系统支持并行蛋白生产新一代表达系统发展植物表达系统低成本高安全性昆虫细胞工厂高效复杂蛋白表达无细胞表达系统快速原型表达人工染色体大片段基因组操作合成生物学中的基因表达调控基因线路设计设计特定功能的基因网络标准化元件可重用模块化生物元件遗传开关精准控制基因表达开关生物振荡器周期性基因表达系统数据驱动的克隆策略优化生物信息学辅助AI设计平台•序列同源性分析•深度学习预测表达水平•启动子强度预测•自动化引物设计•转录终止效率评估•酶切位点优化排布•密码子使用偏好性优化•表达条件智能推荐基因克隆与表达面临的挑战知识产权壁垒专利保护限制技术转移与应用伦理争议基因操作引发社会伦理问题技术挑战大片段基因克隆与复杂蛋白表达生物安全风险基因扩散与意外生物效应行业政策及监管框架国际标准中国政策法规合规要求世界卫生组织WHO生物安全指南《基因工程安全管理办法》实验室认证与备案经合组织OECD生物技术规范《人类遗传资源管理条例》生物安全等级评估国际生物安全议定书《农业转基因生物安全管理条例》项目伦理审查未来发展趋势与展望全自动化平台整合克隆表达全流程定制化表达系统根据蛋白特性选择最佳方案全基因组编辑技术创建具有新功能的生物体人工智能辅助设计优化克隆与表达效率重点回顾基因克隆与表达要点应用领域医药、农业、工业与环境关键技术基因编辑、高通量与人工智能表达系统原核、真核与无细胞系统实验方法PCR、酶切连接与转化基础概念分子生物学核心原理复习与思考题目小组讨论题实验设计题选择题如何设计最优表达策略？针对特定蛋白设计克隆方案限制酶、载体与表达调控课程总结与互动答疑实践建议拓展思考方向参与实验室项目积累实际经学习成果检验探索前沿领域与新兴技术验知识点总结能独立设计基因克隆与表达理解基因克隆与表达的核心实验概念与技术。