生物化学实验复习课件

生物化学实验复习课件欢迎来到生物化学实验复习课程本课件旨在帮助同学们系统回顾本学期所学的生物化学实验知识，巩固实验技能，为即将到来的考试做好准备本课程将涵盖从基础实验规则、仪器使用、试剂配制到各类生物大分子的分析方法，以及前沿技术应用等内容希望通过这次复习，能够使大家对生物化学实验有更加全面和深入的理解学习生物化学实验不仅是掌握基本实验技能，更是培养科学思维和解决问题能力的过程让我们一起开始这段复习之旅吧！绪论生物化学实验的意义学科基石能力培养研究基础生物化学实验是生物化学理论知识的验通过实验操作，培养学生的动手能力、掌握生物化学实验技术是开展生命科学证和延伸，通过实验可以直观理解生命观察能力和创新思维实验过程中遇到研究的必备条件从蛋白质分离纯化到活动的分子机制它是连接理论与实际的问题及其解决方案，锻炼了学生的逻酶活性测定，从核酸操作到免疫分析，应用的桥梁，为医学、农业、环境科学辑思维和分析能力，这些能力对未来研这些基础实验技能构成了现代生物医学等领域提供了重要支撑究工作至关重要研究的技术支撑体系生物化学实验室规则人员管理规定仪器使用规定实验室内必须穿着实验服，佩戴使用仪器前必须阅读使用说明书防护眼镜和手套禁止在实验室并接受培训精密仪器须在专人内饮食、吸烟或化妆长发必须指导下操作，使用后及时清洁并束起，不得穿凉鞋或高跟鞋进入填写使用记录禁止擅自拆卸或实验室实验完成后必须洗手，改装仪器设备贵重仪器必须预严禁将实验用品带出实验室约使用并记录操作过程试剂管理规定化学试剂必须按类别存放，标签清晰可见危险品必须专柜保存并有专人管理使用试剂时须做好记录，并按要求处理废弃物禁止将未标记的试剂带入或带出实验室，避免交叉污染基础安全知识个人防护实验服、护目镜、手套、口罩消防安全灭火器位置、火灾应对、疏散路线应急设施洗眼器、喷淋装置、急救箱危险品处理化学品、生物材料、废弃物分类处理安全是生物化学实验的首要前提在实验过程中，必须时刻保持警惕，熟悉危险信号和应急处理方案对于酸碱溅出、化学品接触皮肤、试剂误食等意外情况，必须按照标准程序迅速处理，并及时向实验室负责人报告实验常用玻璃仪器玻璃仪器是生物化学实验中最常用的基础设备容量瓶用于配制精确浓度的溶液，具有高度准确性；量筒用于测量液体体积，精度低于容量瓶；锥形瓶适用于溶液混合和滴定；试管用于小体积反应和溶液存放；培养皿则用于细胞培养和平板实验玻璃仪器的清洗非常重要，通常需使用专用清洗液浸泡，再用蒸馏水多次冲洗热敏感实验应使用硼硅酸盐玻璃仪器，它们具有较低的热膨胀系数和更高的耐热性实验常用塑料与金属器皿60°C塑料器皿耐热上限多数塑料制品不宜高温灭菌121°C金属器皿耐热温度可在高压灭菌器中处理年10金属器皿平均使用寿命远超塑料器皿的2-3年85%生化实验使用率塑料一次性消耗品使用比例塑料器皿以其轻便、不易破碎和相对低廉的特点，在现代生物化学实验室中广泛应用常见的塑料器皿包括移液管、离心管、PCR管、培养皿和微量滴定板等大多数塑料器皿为一次性使用，避免了交叉污染问题金属器皿如不锈钢烧杯、镊子、解剖工具和坩埚等，具有耐高温、耐腐蚀和使用寿命长的优点但在强酸强碱环境中使用时需特别注意材质的选择，避免化学反应导致的污染或腐蚀精密仪器一览显微镜分光光度计离心机细胞观察的基础工具，包括光基于比尔-朗伯定律测量样品利用离心力分离混合物的设学显微镜、荧光显微镜和电子吸光度的仪器使用前需进行备使用时需平衡放置样品，显微镜使用时需注意聚焦调空白校正，操作时避免气泡影避免振动设定转速和时间前节，避免物镜与载玻片直接接响读数比色皿应保持清洁，确认样品管耐受性操作结束触长期不用时应盖好防尘指纹和划痕会影响测量精度需等转子完全停止后再开盖罩，保持镜头清洁电泳仪基于带电分子在电场中迁移速率差异进行分离的装置接通电源前检查电极连接和缓冲液水平切勿在通电状态下操作，以防电击危险实验前的准备预习实验内容仔细阅读实验指导书，明确实验目的、原理和步骤准备相关理论知识，预想可能遇到的问题和解决方案记录关键参数和注意事项试剂准备按照实验要求配制所需试剂，检查试剂有效期和保存条件计算所需试剂用量并留有余量对于特殊试剂，确认保存条件和使用限制仪器准备检查实验所需仪器设备是否可用，必要时进行预约测试仪器功能是否正常，进行必要的校准准备备用设备以应对突发故障样品预处理按照实验要求处理样品，如离心、过滤、匀浆等确保样品状态适合实验要求，避免降解或污染记录样品处理的具体参数常用试剂的配置与保存试剂类型储存温度保质期注意事项酶类-20°C或-80°C6-12个月避免反复冻融抗体4°C或-20°C6-24个月避光保存缓冲液室温或4°C1-3个月防止微生物污染染料4°C3-6个月避光密封蛋白质-80°C3-12个月添加蛋白酶抑制剂试剂的正确配置与保存直接影响实验结果的准确性对于活性物质如酶和抗体，应分装后保存，避免反复冻融导致活性下降缓冲液配制后应测量pH值并校正，长期保存的缓冲液使用前需检查是否有沉淀或污染标准溶液应使用高纯度试剂配制，并定期校准有机溶剂需在通风橱中操作，并注意防火安全对于光敏感试剂，应使用棕色瓶储存并避光保存所有试剂瓶上必须标明试剂名称、浓度、配制日期和有效期称量与移液基础天平选择根据称量需求选择合适精度的天平分析天平（精度

0.1mg）用于精确称量，普通天平（精度

0.01g）用于一般称量天平应放置在稳定的平台上，避免振动和气流影响称量技巧称量前先校准天平使用镊子或称量纸放置样品，避免直接用手接触粉末样品应在通风橱中操作，防止飞散称量完毕立即记录数据，并清理天平移液器操作根据所需体积选择合适量程的移液器吸液前先检查枪头是否紧密连接按下按钮至第一挡吸液，缓慢释放；按至第二挡排液，确保完全排出垂直操作，避免液体进入枪身精确移液移液器定期校准，确保精度黏稠液体应使用反向移液法处理有机溶剂时选用专用移液器每次更换不同试剂时更换枪头，防止交叉污染浓度与稀释计算溶液配制案例分析确定目标计算用量明确所需溶液种类、浓度和体积根据分子量和浓度计算所需试剂量调整校验称量配制调节pH值并校准至最终体积精确称量试剂并溶解案例一配制500mL

0.1M pH

7.4的PBS缓冲液首先计算Na₂HPO₄的用量

0.1mol/L×

0.5L×142g/mol=

7.1g；计算KH₂PO₄的用量

0.1mol/L×

0.5L×136g/mol×

0.2=

1.36g（假设二者比例为4:1）将两种物质溶于400mL水中，用pH计测量并调整至

7.4，最后定容至500mL案例二配制100mL50mM Tris-HCl缓冲液计算Tris的用量

0.05mol/L×

0.1L×

121.14g/mol=

0.6057g将Tris溶于80mL水中，用浓HCl调节pH值至所需如

7.5，最后定容至100mL配制完成后应记录室温，因为Tris缓冲液的pH值随温度变化较大计量单位与换算质量单位mg、g、kg及相互换算体积单位μL、mL、L及相互换算浓度单位mol/L、mmol/L、mg/mL、ppm能量单位J、cal及相互换算生物化学实验中常用的国际单位制SI前缀包括皮p,10^-

12、纳n,10^-

9、微μ,10^-

6、毫m,10^-

3、千k,10^

3、兆M,10^6熟悉这些前缀的含义有助于快速进行单位换算例如，1mg=1000μg=10^-3g；1L=1000mL=10^6μL在浓度单位换算中，常见的问题是不同表示法之间的转换例如，将5%w/v的葡萄糖溶液换算为摩尔浓度Cmol/L=5g/100mL×1000mL/L×1mol/180g=

0.278mol/L其中180g/mol是葡萄糖的分子量类似地，1mM的蛋白质溶液分子量为50kDa相当于50mg/L颜色反应原理颜色反应是生物化学中常用的定性或定量检测方法，基于特定物质与显色剂反应产生有特征色的产物比色法的基础是比尔-朗伯定律Beer-Lambert Law，即溶液的吸光度与浓度成正比公式A=εcl，其中A为吸光度，ε为摩尔消光系数，c为浓度，l为光程常见的颜色反应包括Bradford法蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合呈蓝色；双缩脲法蛋白质肽键与铜离子在碱性条件下形成紫色络合物；DNS法还原糖与3,5-二硝基水杨酸反应呈红棕色；苯酚-硫酸法碳水化合物脱水形成糠醛衍生物，与苯酚反应呈橙黄色准确测定要求绘制标准曲线，样品测定值必须在曲线线性范围内分光光度计基础光源产生连续光谱的辐射源单色器选择特定波长光线样品室放置待测样品的比色皿检测器测量透过光强度数据系统处理信号并显示结果分光光度计是根据物质对不同波长光的吸收特性进行定性或定量分析的仪器现代分光光度计通常包括紫外-可见光区域190-800nm，用于检测多种生物分子核酸在260nm有吸收峰，蛋白质在280nm有吸收峰，这一特性常用于核酸纯度检测使用分光光度计时，首先需选择合适的比色皿石英、玻璃或塑料和波长然后用空白溶液调零，再测定样品吸光度现代仪器可进行波长扫描，绘制吸收光谱图，帮助鉴定未知物质对于浑浊样品，需进行适当处理以避免散射光影响测量准确性定量分析必须确保测量值在仪器线性范围内通常A值在

0.1-

1.0之间酶促反应基础酶的特异性温度与pH影响酶对底物具有高度特异性，这种锁酶活性受温度和pH强烈影响，每种钥关系源于酶活性中心的独特三维酶都有其最适温度和pH值温度过结构特异性可以针对化学键、底高会导致酶蛋白变性，活性丧失；物结构或立体构型例如，胰蛋白pH改变会影响酶分子表面带电基团酶特异性水解肽链中精氨酸和赖氨的离子状态，影响与底物的结合或酸残基羧基侧的肽键催化效率米氏方程V₀=Vmax[S]/Km+[S]，米氏方程描述了酶促反应速率与底物浓度的关系Km米氏常数等于使反应速率达到最大值一半时的底物浓度，反映了酶与底物的亲和力；Vmax表示最大反应速率，与酶的总量和转化数相关酶作为生物催化剂，能够显著降低化学反应的活化能，加速生物化学反应酶促反应遵循单位时间内酶与底物分子碰撞次数的统计规律，因此反应速率与酶和底物浓度相关kcat转换数表示每个酶分子每秒能转化的底物分子数，是衡量酶效率的重要参数蛋白质的提取与定量细胞破碎方法蛋白质定量方法蛋白质纯化机械破碎匀浆器、研磨、超声波处理，Bradford法基于考马斯亮蓝G-250与盐析利用蛋白质溶解度随离子强度变化适用于动植物组织和微生物渗透破碎蛋白质结合后在595nm处的吸收变化，灵的特性进行初步分离层析法包括离子低渗或高渗处理，利用渗透压差破坏细胞敏度高但易受某些化合物干扰Lowry交换、凝胶过滤、亲和层析等，基于蛋白膜化学裂解使用去垢剂如SDS、法基于Folin酚试剂与蛋白质中酪氨酸残质物理化学性质差异进行分离电泳Triton X-100溶解细胞膜冻融法反基反应，灵敏度高但操作复杂BCA法SDS-PAGE用于分析蛋白质分子量及纯复冻融导致细胞膜破裂利用蛋白质还原Cu²⁺为Cu⁺，后者与二度，等电聚焦用于分离等电点不同的蛋白辛可宁酸形成紫色络合物，稳定性好质升浸离心与分级沉淀低速离心500-1,000×g分离完整细胞、细胞核和细胞碎片中速离心10,000-20,000×g分离线粒体、溶酶体和过氧化物酶体高速离心100,000×g分离微粒体和细胞膜碎片超速离心300,000×g分离核糖体、大分子蛋白和病毒颗粒升浸离心是一种通过多次离心分离细胞组分的技术每次离心后取上清液进行下一次更高速度的离心，这样可以依次分离出不同大小和密度的亚细胞结构离心力计算公式RCF=

1.118×10^-5×r×N²，其中r为旋转半径cm，N为转速rpm分级沉淀常用于蛋白质初步分离，通过逐步增加盐浓度通常是硫酸铵使不同蛋白质依次沉淀蛋白质的沉淀点取决于其表面疏水性、电荷分布和分子量操作时应缓慢添加盐并充分搅拌，控制温度在0-4°C以保护蛋白质活性，分离后的蛋白沉淀通常通过透析去除高浓度盐蛋白凝胶电泳原理SDS-PAGE机制电泳图谱解读SDS-PAGE十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳是分析蛋白质分子量的主要方法SDS是一种阴离子去垢剂，可结合蛋白质疏水区域，使蛋白质变性并带负电通常每克蛋白质结合约

1.4g SDS，使蛋白质的电荷与质量比相近，从而在电场中主要按分子量大小分离β-巯基乙醇常加入样品缓冲液中，用于打断蛋白质分子内和分子间的二硫键，使复杂蛋白质解离为单体凝胶浓度影响分离范围，通常8-12%的凝胶适合分离15-100kDa的蛋白质电泳完成后，通过染色显示蛋白质条带考马斯亮蓝R-250是常用染料，检测限约为100ng蛋白质银染灵敏度更高，可检测至1ng分子量标记物与样品并行电泳，用于估算目标蛋白分子量条带位置反映蛋白质分子量，条带亮度反映蛋白质含量多条带表明样品中含有多种蛋白质或目标蛋白已降解条带弥散可能是由于蛋白质翻译后修饰、过量上样或电泳条件不佳导致染色与显色技术考马斯亮蓝染色银染色荧光染色最常用的蛋白质凝胶染色方法，利用染料高灵敏度染色方法，检测限可达1-5ng/条如SYPRO Ruby染色，结合了银染的灵敏与蛋白质中的碱性和疏水性氨基酸残基结带原理是银离子与蛋白质中的某些基团度和考马斯染色的线性范围检测限约为合R-250型染料检测限约为100ng/条结合，经还原剂处理后形成不溶性银颗1-2ng/条带，动态范围大超过3个数量带，G-250型染料用于胶体考马斯染色，粒步骤复杂，包括固定、敏化、银染和级需要荧光成像设备检测，但操作简背景低且敏感度高染色后需用甲醇-醋显影等，但灵敏度远高于考马斯染色过便，与质谱分析兼容性好成本较高但重酸溶液脱色，显示蓝色蛋白质条带度显影会增加背景，影响分析复性和稳定性优良在蛋白质印迹技术中，显色系统常基于酶标二抗催化底物反应产生有色产物常用的酶包括辣根过氧化物酶HRP和碱性磷酸酶APHRP催化DAB二氨基联苯胺氧化形成棕色沉淀，或催化ECL增强化学发光底物产生光信号AP催化BCIP/NBT转化为蓝紫色沉淀，色彩稳定但发展较慢核酸提取与纯化细胞裂解使用裂解缓冲液含去垢剂、蛋白酶K和RNase抑制剂破坏细胞膜和核膜，释放核酸动物细胞通常用SDS裂解，植物样品可能需要研磨处理，细菌细胞壁则需要溶菌酶消化裂解温度和时间需根据样品类型优化去除蛋白质酚-氯仿抽提是经典方法，利用有机相与水相分离，蛋白质溶于有机相而核酸留在水相离心后小心吸取上层水相现代试剂盒通常采用硅胶膜吸附法，蛋白质在高盐条件下流出，简化了操作流程并减少有毒试剂使用核酸沉淀传统方法使用乙醇或异丙醇在低温条件下沉淀核酸，加入高浓度盐如醋酸钠促进沉淀沉淀后离心收集核酸沉淀，用70%乙醇洗涤去除残留盐试剂盒方法通常采用硅胶膜吸附，经洗涤后用低盐或无盐缓冲液洗脱质量检测使用紫外分光光度计测定A260核酸吸收峰和A280蛋白质吸收峰，计算A260/A280比值评估纯度，理想值为

1.8DNA或

2.0RNA琼脂糖凝胶电泳可检查核酸完整性，RNA应显示清晰的28S和18S条带，DNA应无明显降解紫外分光法检测核酸脂类分析常用方法提取与萃取Folch法使用氯仿-甲醇2:1,v/v混合溶剂提取脂质，水洗后有机相含脂质Bligh-Dyer法氯仿-甲醇-水系统提取，更适合水分含量高的样品脂质提取过程需在低温和避光条件下进行，防止氧化和降解提取后的脂质样品通常在氮气保护下密封保存薄层色谱TLC基于不同脂类在固定相如硅胶与流动相如石油醚-乙醚-醋酸间分配系数差异进行分离样品点样于起点线，展开后喷洒显色剂如碘蒸气、硫酸显示脂类斑点可通过与标准品比较保留值Rf进行定性分析结合薄层扫描仪，可实现半定量分析气相色谱GC脂肪酸分析的常用方法，需先将脂质水解并甲酯化生成脂肪酸甲酯通过毛细管柱分离，FID检测器检测可分析脂肪酸组成、链长和不饱和度结合质谱GC-MS提高定性能力适用于挥发性或经衍生化处理的脂类分析质谱MS分析LC-MS和MALDI-TOF是现代脂质组学主要技术可分析完整脂质分子结构，提供分子量和片段信息电喷雾电离ESI和基质辅助激光解吸电离MALDI是常用电离方式具有高灵敏度和特异性，可检测极微量脂质，但设备和操作成本高糖类分析实验蒽酮法法苯酚硫酸法DNS-蒽酮试剂在浓硫酸中与多糖、寡糖或单糖3,5-二硝基水杨酸DNS可被还原糖还原碳水化合物在浓硫酸作用下脱水生成糠醛反应生成蓝绿色产物，在620nm有最大吸成3-氨基-5-硝基水杨酸，颜色由黄变红衍生物，与苯酚反应形成黄橙色产物，在收原理是碳水化合物在强酸条件下脱水棕色，在540nm有吸收此方法特异性检490nm测定此方法适用于广泛的糖类，形成糠醛衍生物，与蒽酮反应产生有色物测还原糖如葡萄糖、果糖等，不反应非包括多糖、寡糖和单糖灵敏度高，线性质该方法灵敏度高，但不能区分不同类还原糖如蔗糖常用于淀粉酶、纤维素范围宽，但苯酚有毒，操作需在通风橱中型的糖常用于总糖含量测定酶等水解酶活性测定反应温度和时间需进行不同糖类的显色强度有差异，故定严格控制以保证结果重现性量分析需使用相同糖类作标准曲线氨基酸分析衍生化样品准备氨基酸与荧光或显色试剂结合蛋白质水解为游离氨基酸分离色谱技术分离不同氨基酸3定量分析检测与标准品比较计算含量紫外、可见或荧光检测氨基酸分析通常需先将蛋白质水解为单个氨基酸常用方法是6N HCl在110°C水解18-24小时，但此条件会破坏色氨酸并部分氧化含硫氨基酸高效液相色谱HPLC是现代氨基酸分析的主要方法，常与预柱或后柱衍生化技术结合常用的衍生化试剂包括PITC苯基异硫氰酸酯、OPA邻苯二甲醛和FMOC9-荧光甲基氯甲酸酯经典的茚三酮反应是氨基酸定性和定量的基础方法茚三酮与α-氨基酸在加热条件下反应生成紫色产物例外是脯氨酸产生黄色这一反应被应用于氨基酸分析仪的后柱衍生化检测此外，茚三酮试剂喷雾也用于纸色谱和薄层色谱中显示氨基酸斑点蛋白质测序中的Edman降解法则可逐一鉴定肽链N端氨基酸酶活性测定基础连续监测法终点法实时跟踪酶促反应过程中底物消耗或产物生成，通常基于吸光在固定时间点终止反应并测定产物量，通过与标准曲线比较计算度、荧光或电化学信号的变化经典例子如LDH催化的NADH氧酶活性常用终止方法包括改变pH值、加入变性剂或沉淀剂化伴随340nm吸光度下降，或碱性磷酸酶水解对硝基苯酚磷酸例如，蛋白酶活性可通过TCA沉淀未水解蛋白，测定上清液中可酯产生黄色对硝基苯酚溶性氨基酸或肽含量连续监测法提供完整的反应进程数据，适合测定初速率和动力学终点法操作简便，适用于多样品同时处理，但不提供反应动态信参数要求产物或底物有可检测的物理化学性质变化，且反应速息关键是确保测定时间在反应线性阶段，且反应终止彻底常率适中以便准确测量需控制反应条件使测定值在仪器线性范围配合比色法、荧光法或放射性标记物检测多点终止法通过多个内时间点采样，可获得近似连续监测的效果酶活性单位U定义为在规定条件下每分钟转化1μmol底物的酶量比活力表示为每毫克蛋白质的酶活性单位U/mg，反映酶制剂的纯度测定酶活性时，需控制pH、温度、底物浓度等条件，并确保底物浓度远高于酶浓度[S]≫[E]以维持零级反应特性对于双底物反应，通常保持一种底物过量而变化另一底物浓度酶促动力学实验米氏方程Michaelis-Menten equation描述了单底物酶促反应速率与底物浓度的关系v=Vmax[S]/Km+[S]测定Vmax和Km的实验通常在恒定酶浓度下，变化底物浓度[S]范围应包括

0.2Km至5Km，测量初始反应速率初始速率应在反应进程的前5-10%内测定，以避免产物抑制等影响Lineweaver-Burk双倒数作图法是经典的数据分析方法，将米氏方程转化为1/v=Km/Vmax1/[S]+1/Vmax以1/[S]为横坐标，1/v为纵坐标作图，得到直线，其斜率为Km/Vmax，y轴截距为1/Vmax，x轴截距为-1/Km此外，Eadie-Hofstee作图v/[S]对v和Hanes-Woolf作图[S]/v对[S]也是常用的线性变换方法现代分析通常采用非线性回归直接拟合米氏方程，避免线性变换引入的误差抑制剂类型实验竞争性抑制抑制剂与底物竞争酶的活性中心非竞争性抑制抑制剂结合酶或酶-底物复合物的非活性位点反竞争性抑制抑制剂专一结合酶-底物复合物混合型抑制抑制剂既影响底物结合又影响催化步骤实验确定抑制类型通常通过比较有无抑制剂存在时的Lineweaver-Burk双倒数作图竞争性抑制改变Km增大但不影响Vmax，双倒数图线在y轴交于同一点；非竞争性抑制降低Vmax但不改变Km，双倒数图线在x轴交于同一点；反竞争性抑制同时降低Km和Vmax，双倒数图线在y轴左方交叉；混合型抑制则使Km和Vmax同时变化，双倒数图线既不在x轴也不在y轴相交抑制常数Ki是评估抑制剂效力的重要参数，表示抑制剂与酶结合的解离常数计算方法取决于抑制类型，对竞争性抑制，通过不同抑制剂浓度下的表观KmKmapp与抑制剂浓度[I]的关系确定Kmapp=Km1+[I]/Ki对非竞争性抑制，则通过表观VmaxVmaxapp计算Vmaxapp=Vmax/1+[I]/Ki通常需测定多个抑制剂浓度下的酶动力学曲线，以准确判断抑制类型并计算Ki蛋白蛋白相互作用检测-免疫共沉淀Co-IP标签蛋白拉下实验酵母双杂交利用特异性抗体沉淀目标蛋白及其结在细胞中过表达带标签如FLAG、将目标蛋白诱饵与转录因子DNA结合伙伴将细胞裂解液与特异性抗体HA、His、GST的蛋白，利用标签特合域融合，潜在互作蛋白猎物与转孵育，加入蛋白A/G珠子捕获抗体-蛋异性亲和介质捕获复合物类似Co-录激活域融合若两蛋白相互作用，白复合物洗涤去除非特异结合蛋白IP原理，但不依赖目标蛋白抗体将重构功能性转录因子激活报告基因后，洗脱并通过SDS-PAGE和GST拉下常用于体外结合实验，将表达此高通量筛选方法可在体内检Western blot分析共沉淀的蛋白此GST融合蛋白与潜在结合伙伴孵育，测弱暂时性相互作用，但假阳性率高方法可检测内源蛋白间的相互作用，通过谷胱甘肽琼脂糖珠捕获复合物并且不适用于膜蛋白变种系统如细菌但要求高质量抗体分析此方法便于研究重组蛋白间的双杂交和哺乳动物双杂交提供了不同直接相互作用实验环境荧光共振能量转移FRET将潜在互作蛋白分别标记供体和受体荧光团若两蛋白近距离相互作用通常10nm，激发供体时能量可转移至受体，导致供体荧光减弱而受体荧光增强此方法可在活细胞中实时检测蛋白相互作用动态变化，但需要专门设备且荧光标记可能影响蛋白功能酶联免疫吸附实验ELISA包被抗原或抗体吸附于微孔板封闭BSA或脱脂奶粉封闭非特异结合位点样品孵育加入含待测物的样品检测抗体加入酶标记的特异性抗体底物显色加入酶底物产生可检测信号ELISA是检测抗原或抗体的高灵敏度免疫分析方法根据实验设计，ELISA分为多种类型直接法抗原直接包被，用酶标抗体检测；间接法抗原包被，先加未标记一抗，再用酶标二抗检测；夹心法捕获抗体包被，捕获抗原后用另一酶标抗体检测；竞争法抗原或抗体与已知量的酶标记物竞争结合位点常见的酶标记包括辣根过氧化物酶HRP和碱性磷酸酶APHRP常与TMB四甲基联苯胺底物反应产生蓝色产物，加终止液后变黄，在450nm测量实验中的常见问题包括背景高可能是封闭不充分或洗涤不彻底；信号弱抗体浓度过低或抗原变性；重复性差操作不一致或试剂不稳定定量ELISA需建立标准曲线，样品测定值应在曲线线性范围内免疫印迹Western BlotSDS-PAGE分离蛋白样品在变性条件下按分子量分离样品需与含SDS和β-巯基乙醇的缓冲液混合加热变性，破坏蛋白质三级结构电泳过程需转膜控制电压和时间，确保良好分离将凝胶上的蛋白转移至固相膜PVDF或硝酸纤维素可使用湿转、半干转或干转系统转膜效率受蛋白大小、膜类型和转膜条封闭件影响PVDF膜疏水性强，蛋白结合力高，但使用前需甲醇活化用BSA或脱脂奶粉封闭膜上空余位点，减少非特异性结合封闭剂选择应考虑与后续抗体的兼容性，例如生物素化抗体检测系统不应使用含生物素的封闭剂抗体孵育先与特异性一抗孵育，洗涤后再与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育抗体浓度、孵育时间和温度需优化一抗通常在4°C过夜孵显影检测育，二抗室温1-2小时洗涤步骤对减少背景信号至关重要加入化学发光底物ECL，HRP催化产生光信号，用X光片或CCD相机记录现代系统多采用数字成像，具有更宽的线性范围和更高的灵敏度凝胶过滤色谱实验原理与装置分子量估测蛋白纯化应用凝胶过滤色谱又称分子筛色谱或体积排阻色通过比较未知蛋白与已知分子量标准蛋白的洗凝胶过滤可用于样品脱盐、缓冲液交换和蛋白谱基于分子大小分离混合物小分子可进入凝脱体积，可估算分子量建立标准曲线时，以质分离纯化对于蛋白质纯化，通常作为中后胶颗粒孔隙，流动路径较长，洗脱较慢；大分洗脱体积Ve与空柱体积Vo之比Ve/Vo或期步骤，结合其他层析方法如离子交换或亲和子被排除于颗粒外，沿最短路径快速洗脱装分配系数Kav[=Ve-Vo/Vt-Vo，Vt为总床色谱凝胶过滤的优点是条件温和，保持蛋白置包括填充凝胶介质的柱子、缓冲液贮槽、泵体积]对分子量对数作图此方法适用于球形蛋活性，且可直观判断蛋白质的聚合状态缺点系统和收集系统常用介质包括Sephadex葡白，对于非球形或糖基化蛋白可能有偏差精是分辨率较低，样品稀释严重，且上样量受柱聚糖基、Sepharose琼脂糖基和确估测需选择与目标蛋白洗脱位置相近的标准体积限制Sephacryl聚丙烯酰胺基蛋白离子交换色谱2-12工作pH范围覆盖大多数生物分子需求50mg典型蛋白结合量每毫升树脂可结合的蛋白量

0.5-2M洗脱盐浓度范围常用NaCl梯度洗脱95%典型回收率优化条件下的蛋白回收效率离子交换色谱基于带电分子与相反电荷固定相之间的静电相互作用按照固定相电荷分为阳离子交换负电荷固定相，结合正电荷分子和阴离子交换正电荷固定相，结合负电荷分子常用的阳离子交换基团包括磺酸基SP和羧基CM；阴离子交换基团包括季铵基Q和二乙氨基乙基DEAE操作流程通常包括平衡用起始缓冲液平衡柱子；上样样品应与起始缓冲液保持相同pH和低离子强度；洗涤去除未结合物质；洗脱通常用盐浓度梯度或pH梯度；再生高盐或极端pH恢复树脂缓冲液选择需考虑目标分子等电点和稳定性等电点高于缓冲液pH的蛋白质带正电荷，适合阳离子交换；反之适合阴离子交换此技术分辨率高，容量大，且可根据需要调整选择性，是蛋白质纯化的强大工具亲和层析技术特异性结合典型工作流程亲和层析基于生物分子间的特异性识别，利操作包括平衡柱子；在温和条件下上样使用固定在支持材料上的配体如抗体、酶底目标分子结合配体；用含与样品相同缓冲液物、抑制剂、金属离子可特异性结合目标的溶液洗涤去除非特异结合物质；通过改变分子这种高选择性使其成为最强大的分离pH、离子强度或加入竞争性配体洗脱目标技术之一，能从复杂混合物中一步分离出高分子；重新平衡柱子以便下次使用洗脱条纯度目标分子件应温和以保持生物活性常见应用蛋白A/G亲和层析分离抗体；金属螯合亲和层析IMAC纯化组氨酸标签融合蛋白；凝集素亲和层析分离糖蛋白；核苷酸亲和层析分离ATP结合蛋白和激酶；免疫亲和层析高特异性分离抗原技术还可用于酶纯化、蛋白相互作用研究和抗体生产亲和标签是现代重组蛋白纯化的有力工具常用标签包括多组氨酸标签His-tag，与镍或钴离子亲和、谷胱甘肽-S-转移酶GST，与谷胱甘肽亲和、麦芽糖结合蛋白MBP，与麦芽糖亲和和FLAG/HA/Myc等小标签与相应抗体亲和标签位置N端或C端选择应考虑对蛋白功能的潜在影响亲和层析的局限性包括非特异性结合引起的纯度问题；过强的特异性结合导致洗脱困难；配体泄漏污染产品；配体成本高且可能降解；固定化过程可能改变配体活性克服这些问题的策略包括优化缓冲条件、使用温和洗脱方法、选择稳定配体以及结合其他纯化技术荧光测定基本原理激发高能光子被荧光分子吸收激发态电子跃迁至高能轨道能量损失振动弛豫降低能量发射电子返回基态释放光子荧光是一种光致发光现象，特点是发射光波长通常长于激发光波长斯托克斯位移生物分子中常见的内源荧光物质包括色氨酸激发280nm，发射350nm、酪氨酸和某些辅酶如NADH通过测量这些内源荧光基团的荧光特性，可研究蛋白质构象变化、变性过程和配体结合外源荧光标记广泛用于增强检测灵敏度和特异性常用荧光染料包括荧光素FITC、罗丹明、Alexa Fluor系列和Cy系列这些染料可通过化学反应与蛋白质的氨基、巯基或羧基共价连接荧光共振能量转移FRET技术利用供体荧光团激发能量非辐射转移给近距离受体荧光团的原理，可用于研究分子间相互作用和构象变化荧光淬灭和荧光恢复实验则可提供分子微环境和动态变化信息活体染色及细胞观察荧光蛋白细胞器特异性染料绿色荧光蛋白GFP及其变种YFP、CFP、RFP等可与目标蛋白融合表达，实DAPI和Hoechst染料可特异结合DNA标记细胞核；MitoTracker靶向线粒体；时观察蛋白定位和动态变化优点是特异性高且无需外源染料，适合长期观ER-Tracker标记内质网；LysoTracker定位溶酶体这些染料多为膜透性小分察；缺点是需要遗传操作，且荧光强度相对较弱光激活型荧光蛋白可在特定子，可直接加入培养基染色活细胞选择染料时需考虑光稳定性、细胞毒性和时间点激活，用于追踪蛋白迁移与实验体系的兼容性多种染料可联合使用进行多重标记细胞膜和细胞骨架染料功能性荧光探针DiI、DiO等脂溶性荧光染料可标记细胞膜；CellMask系列染料提供高对比度的钙离子指示剂Fluo-

4、Fura-2可监测细胞内钙信号变化；pH敏感探针细胞膜标记；荧光标记的鬼笔环肽可染色肌动蛋白细胞骨架；SiR-tubulin可标BCECF用于测量细胞内pH；JC-1可检测线粒体膜电位；活性氧探针DCFH-记微管这些试剂对研究细胞形态、迁移和分裂过程非常有用标记条件需根DA测量氧化应激这类探针提供细胞生理功能动态信息，但需注意探针本身可据细胞类型和实验目的优化能影响细胞正常生理过程样品保存与运输样品类型存储温度保存方法保存期限纯化蛋白-80°C甘油保护,小份分装数月至1年抗体4°C/-20°C添加叠氮钠,避光保存数月至数年DNA-20°C TE缓冲液,低EDTA数年RNA-80°C无RNase水,添加抑制数月剂组织样本-80°C/液氮OCT包埋或福尔马林数月至数年固定细胞液氮10%DMSO冻存培养基数年生物样品运输通常需要特殊容器和温控条件国内短途运输可使用干冰-

78.5°C保存对温度敏感的样品，一般可维持1-3天国际长途运输则需使用干式冰/冷冻包或液氮容器运输前应确认接收方准备情况，并制定样品到达后的处理预案某些样品如固定组织可在室温下运输，但需防止泄漏和污染防止样品降解的通用策略包括添加适当的稳定剂如蛋白酶抑制剂、RNase抑制剂；避免反复冻融小份分装；使用合适的保存缓冲液如pH和离子强度适宜；避光保存光敏感样品；保持无菌环境防止微生物污染样品管应清晰标记，包含样品名称、日期、浓度和特殊注意事项建立样品库存管理系统有助于跟踪样品状态和使用历史生物信息学基础应用生物信息学已成为现代生物化学研究不可或缺的工具最基础的应用是核酸和蛋白质序列分析，包括使用BLAST进行序列同源性搜索，使用Clustal Omega进行多序列比对，使用MEGA构建系统发育树这些工具帮助研究者理解不同物种间生物分子的进化关系和功能保守性蛋白质结构预测和分析是另一重要应用，包括二级结构预测如JPred、三维结构模拟如SWISS-MODEL和分子对接如AutoDock通过PyMOL或Chimera等软件可视化蛋白质结构，研究活性位点、配体结合口袋和蛋白质相互作用界面高通量组学数据分析，如基因表达谱分析使用R语言和Bioconductor包和蛋白质组学数据处理如MaxQuant也是实验生物化学研究的重要补充数据库资源如NCBI、UniProt、PDB和KEGG提供了丰富的参考信息和分析工具实验数据记录与整理实验记录本电子实验记录数据管理原则传统实验记录本仍是许多实验室的基本工具电子实验记录系统ELN提供数字化记录方无论采用何种记录方式，良好的数据管理都应使用硬皮装订本而非活页本，以防页面丢失或案支持文本、图像、表格和原始数据文件直遵循可追溯、可重复和可获取原则建立清晰替换书写应使用防水墨水，内容包括日期、接录入，可实时备份和云存储用户权限管理的文件命名规则，包含日期、实验类型和版本实验目的、材料与方法、详细操作步骤、观察确保数据安全，时间戳和审计跟踪增强数据可信息原始数据与分析结果分开存储，保持原结果和初步结论错误记录应划线删除而非涂靠性先进系统支持模板创建、数据自动分始数据完整不变定期备份至少两个独立位抹，确保原始内容可辨认图表和照片可粘贴析、跨平台访问和团队协作优点是数据组织置数据整理应采用层级目录结构，按项目-实并标注说明优点是简单可靠，不依赖技术支便捷、检索高效、共享简单；缺点是需技术支验-日期组织关联数据应建立索引或元数据持；缺点是数据共享和检索不便持和培训，且数据长期保存需考虑格式兼容性表，便于检索和理解实验背景问题结果统计分析方法描述性统计计算平均值、标准差、变异系数等假设检验t检验、ANOVA等评估显著性相关与回归3分析变量间关系和预测模型多变量分析4主成分分析、聚类分析等统计学是确保实验结果可靠性的重要工具描述性统计通过计算均值x̄、中位数、标准差s、标准误SEM=s/√n和变异系数CV=s/x̄等参数，概括数据集特征均值代表中心趋势，标准差反映数据分散程度实验数据报告通常使用均值±标准差或均值±标准误格式，后者更适合小样本比较推断统计通过假设检验评估结果可靠性t检验用于两组数据比较，单因素方差分析ANOVA用于多组比较，配对设计减少个体差异影响p值≤

0.05通常被视为具有统计学显著性，但应谨慎解释，不等同于生物学意义相关分析Pearson或Spearman相关系数和回归分析用于评估变量间关系多次测量的重复实验很重要，通常至少三次独立重复才有统计意义统计分析前应确认数据符合正态分布等前提假设，必要时进行数据转换或选择非参数检验方法绘图与结果展示绘图软件选择图表规范与技巧常用科学绘图软件包括Origin，专业科学绘图软件，功能强大，支持复杂统计分析；GraphPad Prism，生物医学领域常用，界面友好，内置统计功能；Excel，基础作图，适合简单数据处理；R语言及ggplot2包，免费开源，高度定制化但学习曲线陡峭；Python的matplotlib和seaborn库，适合数据挖掘和机器学习结果展示选择时考虑数据复杂度、统计需求、团队习惯和成本因素对复杂数据集，专业软件提供更好支持；对简单展示，Excel可能已足够无论使用何种工具，掌握基本绘图原则更为重要有效科学图表应遵循以下原则选择合适图表类型散点图展示相关性，柱状图比较离散类别，线图显示趋势；确保坐标轴清晰标记，包括变量名和单位；使用恰当误差线，并在图例中说明标准差、标准误或置信区间；标注统计显著性；选择清晰配色方案，考虑色盲友好；图表大小适中，文字清晰可辨图表修饰应简洁不失信息，避免图表垃圾无意义装饰数据点应多于图表元素图表应独立可理解，标题、图例和注释应提供足够上下文坐标轴断开需明确标注，避免视觉误导特殊处理的数据点应标注说明常见实验误差类型45%25%操作误差占比仪器误差占比人为因素导致的误差设备精度与校准问题20%10%方法误差占比随机误差占比实验设计和流程缺陷不可预测的自然波动实验误差通常分为系统误差和随机误差两大类系统误差又称确定性误差导致测量值总是偏离真值一个方向，表现为准确度降低但精密度可能仍高常见来源包括仪器校准不当、试剂纯度问题、方法学偏差和操作者一致性错误系统误差通过改进方法、校准仪器和标准化操作可减少或消除随机误差导致测量值在真值周围随机波动，表现为精密度降低来源包括环境因素温度、湿度波动、电子噪声、样品不均匀性和测量过程中的随机波动随机误差无法完全消除，但可通过增加重复次数、改进实验条件和使用统计方法评估和减小其影响总误差是系统误差和随机误差的综合效应，评估时需考虑两者贡献良好实验设计应识别主要误差来源并采取相应措施控制，如使用阳性和阴性对照、盲法设计和适当重复误差来源及对策试剂问题环境因素纯度、降解和配制误差影响反应温度、湿度和光照波动影响实验稳定性仪器缺陷校准偏差和性能下降导致读数错误方法局限实验设计和流程本身的固有限制操作变异技术差异和人为失误引入不确定性针对环境因素，可使用恒温恒湿房间，避免阳光直射和振动重要实验应记录环境参数，必要时使用温度记录仪监测全程温度变化试剂问题对策包括使用高纯度试剂，记录批号；定期检查试剂有效期；专人负责试剂管理；关键试剂小份分装减少反复使用导致的污染；配制标准曲线确认工作浓度仪器误差控制措施遵循厂商推荐维护计划；使用前后校准；定期验证性能如分光光度计波长准确性和线性响应；保持仪器清洁；建立仪器使用和维护记录操作变异可通过标准操作程序SOP、培训和考核、自动化设备、双人核对关键步骤等措施减少方法学局限性需通过文献调研、预实验评估和方法验证确认适用范围对于复杂实验，宜采用计算机模拟辅助设计，明确各变量对结果的影响程度结果异常的排查流程异常确认区分真实结果与实验失败实验回顾检查记录寻找可能偏差试剂与仪器验证确认关键组分功能正常控制实验设计对照验证特定假设问题解决实施针对性措施并验证案例分析实验室酶活性测定结果突然下降90%排查流程首先确认异常不是孤立现象，多次重复仍观察到活性低下回顾实验记录，发现使用了新批次底物对照实验设计1用旧批次底物平行测试，恢复正常活性，确认问题与底物相关；2光谱分析新批次底物，发现杂质峰；3薄层色谱显示底物部分降解解决方案更换供应商并改进底物储存条件，每批次使用前进行质控排查异常的通用策略从简单因素开始如计算错误、试剂过期，再检查复杂因素；隔离变量逐一排查；利用对照实验验证假设；采用替代方法交叉验证结果；咨询有经验同事或专家；查阅文献了解类似问题报道异常结果也可能代表真实现象或新发现，不应仅凭与预期不符就否定建议维护故障排除日志，记录常见问题及解决方案，促进实验室知识积累和经验传承实验中的安全事故案例化学品泄漏事件离心机事故生物污染事件案例研究生在配制浓硫酸溶液时，因未使用漏案例某实验室离心机因样品不平衡，高速运行案例实验人员处理细胞培养物时未使用生物安斗直接倾倒，导致酸液溅出灼伤手臂和实验台时转子脱落，造成设备严重损坏并弹射碎片伤及全柜，培养液喷溅导致潜在生物污染，多名人员面教训化学品操作应在通风橱中进行，穿戴附近人员教训使用离心机前必须检查样品质需接受医学观察教训生物材料操作必须在适适当防护装备耐酸手套、防护面罩，使用正确量平衡，对称放置，不超过最大负载启动前确当生物安全等级设施中进行培养物操作应使用工具漏斗、安全泵，熟知紧急处理程序酸碱中认转子安装正确并锁紧，盖子关闭到位定期检生物安全柜而非普通通风橱处理前评估生物安和、冲洗现场应配备酸碱中和剂、吸收材料查转子完整性和使用寿命特别是超速离心机转全风险，选择适当防护制定生物污染应急预和急救用品处理强酸强碱时应有他人在场，不子离心运行时不可离开，出现异常声音立即案，包括去污、隔离和报告程序加强生物安全可单独操作停机建立离心机使用记录，定期维护培训，建立准入资质制度绿色生化实验理念废弃物减量优化实验规模，采用微量化技术减少样品和试剂用量例如，使用96孔板代替试管进行酶活性测定，可将试剂用量减少90%以上实验设计时考虑一试多用，避免重复制备相同样品尽可能采用无害或低毒试剂替代高毒试剂，如使用柠檬酸缓冲液替代部分含重金属的缓冲系统水资源节约改用循环冷却水系统代替自来水直流冷却，可减少95%以上的水资源消耗实验室洗涤设备采用高效节水型，合理规划洗涤流程，先用少量水预洗去除大部分污染物，再进行精洗收集蒸馏水装置产生的废热水用于非关键清洗定期检查水管连接，及时修复泄漏点能源效率设备选择优先考虑能效等级高的产品，如选用节能型冰箱、冷冻机和培养箱合理安排实验时间，集中使用大型设备如离心机、PCR仪，避免频繁启停改进实验室布局，将产热设备远离需制冷设备，减少空调负担设置设备自动关闭系统，避免不必要的待机能耗废弃物处理建立完善的废弃物分类收集系统，区分普通废弃物、可回收材料、化学废液和生物废弃物有机溶剂按类别分开收集，便于后续回收利用酸碱废液中和处理后排放含重金属废液专门收集，交由资质单位处理生物废弃物高压灭菌处理后作为医疗废物处置塑料一次性用品尽可能选择可降解材料生物化学实验前沿基因编辑技术单细胞技术类器官技术CRISPR-Cas9系统革命性简化了基因编辑过单细胞测序和蛋白质组学技术突破了传统混合样类器官Organoids是体外三维培养的微型器官程，使靶向DNA修饰变得更加精确和高效该技本分析的局限，揭示细胞异质性和罕见细胞亚样结构，能模拟实际器官的复杂组织结构和功术利用向导RNA识别特定DNA序列，Cas9蛋白群单细胞RNA测序scRNA-seq可同时分析能干细胞衍生的类器官可发展出多种细胞类型切割DNA，激活细胞自身修复机制实现基因修数千个细胞的转录组，了解细胞发育轨迹和疾病和组织结构，提供比传统二维培养更接近生理状改新一代基因编辑工具如碱基编辑器base进程单细胞蛋白质组学方法如质谱流式细胞术态的研究模型类器官技术已用于疾病建模、药editors和质粒编辑器prime editors进一步提CyTOF和空间蛋白质组学允许在保留空间信息物筛选、毒性测试和再生医学研究结合微流控高了精度，减少了脱靶效应这些技术广泛应用的同时分析多种蛋白标记这些技术正推动肿瘤技术的器官芯片Organ-on-chip进一步整合于功能基因组学研究、疾病模型构建和潜在治疗微环境、免疫应答和组织发育等领域的深入研了多种组织类型和生理微环境因素，为精准医学策略开发究和个体化治疗提供平台生物化学实验在医学中的应用复习与考点提示理论知识考点实验技能考点重点掌握各类实验原理及背后的生物化掌握基本操作技能，如移液、称量、离学机制熟悉实验数据处理公式，如酶心操作要点熟悉各类仪器使用步骤和动力学参数计算、浓度换算等理解不注意事项，尤其是分光光度计、电泳设同方法的适用范围、优缺点和局限性备和离心机等常用仪器能够绘制和解关注各种生物大分子蛋白质、核酸、糖释标准曲线、酶动力学曲线和电泳图类、脂类的分析方法特点和区别复习谱掌握实验数据的统计处理和误差分关键术语定义和专业英文缩写，如SDS-析方法能够识别常见实验问题原因并PAGE、ELISA、HPLC等提出相应解决方案考试形式与答题技巧考试通常包括选择题、填空题、计算题和实验设计题选择题注重概念理解和细节记忆，需全面复习；填空题关注关键术语和数值，尤其是标准操作参数；计算题需掌握公式并理解应用场景，注意单位换算；实验设计题考察综合应用能力，答题时应从实验目的、原理、材料、步骤、结果分析等方面系统阐述遇到不确定问题，可通过排除法缩小范围总结与答疑实验基础与安全实验室规则、安全常识与仪器使用基本生化实验技术溶液配制、分离纯化与定量分析生物大分子分析3蛋白质、核酸、糖和脂类实验方法实验设计与数据处理方案制定、结果分析与故障排除前沿技术与应用新方法及在医学研究中的转化本课程系统回顾了生物化学实验的核心内容，从基础实验室安全知识和仪器使用，到各类生物大分子的分析方法，再到前沿技术应用这些知识和技能不仅是考试的重点，更是今后科研和专业工作的基础生物化学实验强调理论与实践相结合，注重操作技能和科学思维的培养课程结束后，欢迎同学们针对复习内容提出问题常见疑问包括实验技巧细节、疑难计算题、实验结果判断标准等建议在考前重点练习数据处理和计算题型，梳理各实验方法的优缺点和适用条件比较考试时请注意时间分配，先完成熟悉的题目希望本复习课程能帮助大家顺利通过考试，更重要的是建立系统的生物化学实验知识体系，为未来研究和工作打下坚实基础。