Transwell是检测细胞侵袭能力的检测方法

Transwell是检测细胞侵袭能力日勺检测措施我们所使用日勺是Chemicon企业日勺ECM554,基质胶已经包被好了，买来就可以用,很以便，并且我们算过,跟自己买胶来包被价格相差不大这种胶4度下很软,37度则变得比较坚硬，因此用前应先放在培养箱中10分钟作用，使胶完全凝固该试剂盒对穿过膜日勺细胞进行荧光染色，再用裂解液裂解细胞后检测荧光值我们在实际使用日勺时候对穿过膜口勺细胞采用1%结晶紫染色,镜下计数细胞数目结晶紫也可以用33%醋酸溶解，再用酶标仪570nm检测，同样可以反应穿过细胞数由于基质胶日勺厚度直接影响穿过膜日勺细胞数，因此提议有条件日勺话还是买此类已经铺好胶日勺试剂盒，比较可靠阐明书该企业网上可如下载，对原理也有比较详细日勺论述，可以去查一下我们做日勺时候,上室用

0.5%BSA日勺培养液,下室用5%血清日勺培养液,下室血清日勺浓度可根据细胞类型口勺不一样进行调整，假如细胞侵袭能力强，可合适减少血清浓度，否则可合适提高血清浓度需要注意日勺是lo上室内的细胞数目要合适，过多，穿过膜日勺细胞会过多过快，假如用计数法日勺话将难以计数;至少也要保证在收样日勺时候，上室内还要有细胞存在详细细胞密度需要自己探索2细胞计数日勺精确性对成果影响很大,各组间最佳不要分开计数尽量用同一密度日O勺细胞悬液予以不一样处理，保证各组细胞量一致3对细胞口勺处理不可影响细胞生存否则难以肯定是细胞量日勺变化还是侵袭能力O变化侵袭小室其实不止是transwell日勺,其他像Boyden chamberThincert也挺好用日勺s我用过Thincert,个人感觉不错，并且价格廉价，是grelner日勺，孔径8微米用于24孔板日勺一种才45块人民币,并且可以零买，不想transwell,总是一箱一箱日勺卖，实在是太贵了！侵袭试验要结合试验目日勺，不一定非要包被日勺下面奉上用Thincert做侵袭试验日勺环节（摘自《A quantitativecell migrationassayusing ThinCert™cell cultureinserts》，大家如需要，可用google搜之

2.Starv.cell.overnigh.i.serum-fre.mediu.wit.

0...BSA

34.Resuspen.cell.i.serum-

58.1ncubat.th.cel.cultur.plat.fo.3-

2..i..cel.cultur.incubato.a.37°.an...CO

29.Remov.th.cel.cultur.mediu.fro.eac.wel.o.th.cel.cultur.plat.an.replac.i.b.

45.|j.serum-fre.cultur.mediu.wit..|j.Calcein-AM

10.Incubat.fo.

4.mi.i..cel.cultur.incubato.a.37°.an...CO

2112.Transfe.th.cel.cultur.insert.int..freshLprepare.

2.wel.cel.cultur.plat.containin.

50.p.

1.

115.Rea.fluorescenc.i..fluorescenc.plat.reade.a.a.excitatio.wavelengt.o.

48.n.an.a.emis从第9步开始计数侵袭细胞时,这份阐明书用日勺是荧光标识，但这种措施成本高并且繁琐我做日勺时候改为giemsa染色,发现效果不错，详细如下

9.侵袭试验完毕后，取出小室，用棉签小心将膜上表面日勺细胞擦拭清除；

10.用手术刀片小心沿小室边缘将膜切下；

11.把膜下表面向上放在一种洁净的24孔板日勺孔中；

12.甲醇:冰醋酸（3:1固定lOmin后用10%giemsa染色；

13.在显微镜下随机选用5个视野计数细胞（即染成紫红色日勺点，未着色日勺多为细胞碎屑计数并拍照留念Trans well细胞体外侵袭试验概述目的:总结并改善细胞体外侵袭试验日勺操作经验措施:采用改善后细胞体外侵袭试验分别研究不一样浓度TNFa刺激下日勺HCCC29810胆囊癌细胞体外侵袭能力日勺强弱;粉防己碱对HUVEC人类脐静脉内皮细胞迁移能力日勺克制作用;VEGF对人结肠癌HT229细胞体外侵袭能力的影响成果:改善后侵袭试验定位精确,成果清晰结论:按照作者提议日勺措施操作，可以缩短试验时间，有助于提高细胞体外侵袭试验日勺质量细胞体外侵袭试验重要应用于多种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移日勺影响及某些克制血管生成日勺新药研究,但在详细试验中获得真实、最佳试验成果日勺图像,并借以阐明问题并非简朴诸多研究人员在此方面花费了诸多时间和科研经费，从刺激试验用日勺细胞到苏木素染色，看似简朴日勺试验环节中有诸多环节需要研究者注意.材料与措施

1.1Matrigel:Becton DickinsonCompary,-20℃保留；Tanswell plate:Costar,USA,#3422，聚碳酯膜微孔直径为8|im;苏木素染液，梯度乙醇,二甲苯溶液

1.•趋化因子的I制备取传代第二天长势良好的NIH3T3细胞，无血清培养基轻柔漂洗两次.加入无血清培养基,37℃,・％CO.培养

2.h〜48h,搜集细胞培养上清;.℃』.000rp.离心取上清;02u.滤膜过滤除菌;分装，在2℃保留

1.3transwell培养板准备所有操作均需无菌操作-20℃保留日勺Matrigel在冰上保2℃〜8c过夜融化在冰上用预冷日勺枪头吸取100|il Matrigel加入冰预冷日勺300m无血清培养基中，充足混均取上述稀释日勺Matrigel25|il加入transwell板上室，覆盖整个聚碳酯膜,37℃,30min，使Matrigel聚合成胶已铺好Matrigel日勺transwell培养板置于37c可保留2周

1.4Matrigel侵袭试验（Matrigel InvasionAssay刺激后日勺各组细胞用PBS漂洗3次以常规措施用无血清培养基制备单细胞悬液,5X105个细胞/ml,每组细胞各分为两部分胎盘兰拒染试验，细胞活力需不小于95%Transwell培养板上室加入100^1细胞悬液（5X104个并加入无血清培养基200ul Transwell培养板下室加入500似趋化因o子,37℃,5%CO2培养24h用湿棉签轻轻擦去Matrigel凝胶和聚碳酯膜上表面口勺细胞o小心取出上室，用线拴住，并做好标识，用冰预冷日勺甲醇固定30min苏木素染色1min梯度乙醇脱水（80%,95%,100%,二甲苯透明小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来，置载玻片上中性树脂封片附着于聚碳酯膜下表面日勺细胞在高倍镜下（X400随机取6个视野［1］计数，取平均数反复试验两次注意事项

2.1NIH3T3细胞制备日勺趋化因子与胎牛血清趋化因子是能使细胞产生趋化运动日勺一类细胞因子［2J目前运用NIH3T3细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭试验日勺试验室比较多,时间较长且试验环节繁琐众所周知，胎牛血清中有趋化因子，我们在不一样浓度TNFa刺激下日勺HCCC29810胆囊癌细胞体外侵袭能力日勺强弱试验中发现用胎牛血清和用NIH3T3细胞制备日勺趋化因子做细胞体外侵袭试验效果是同样日勺，两组迁移日勺细胞数很靠近在试验时间上，用NIH3T3细胞制备趋化因子做细胞体外侵袭试验周期为1周，而用胎牛血清作趋化因子做细胞体外侵袭试验周期为2d，试验时间节省了诸多因此认为可以用胎牛血清来替代NIH3T3细胞制备日勺趋化因子

2.•细胞的准备所需细胞应处在对数生长期，细胞活力需不小于

9.%o假如细胞活力小，就会导致细胞穿透能力下降，影响试验成果

2.3去Matrige.凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞先用干棉签将上室内液体吸去，再用蒸储水浸湿的棉签轻轻擦去Ma.rige.凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞,假如没有擦净聚碳酯膜上表面的I细胞，在细胞计数时就会将没擦掉的细胞也计进来尤其是细胞为圆形的I时候，就会辨别不出是穿过去的I细胞还是没穿过去的细胞，对于长梭形细胞来说，穿过去的细胞为长梭形，没穿过去的细胞多为圆形

2.4木素染色上室浸泡在新苏木素中日勺时间为.mi.,用过多次的苏木素为.min在研究粉防己碱对HUVE、人类脐静脉内皮细胞迁移能力的克制作用没有将多出苏木素洗去，直接脱水、透明，导致细胞图片背景模糊,细胞不清晰在作不一样浓度TNFa刺激下的|HCCC

2981.胆囊癌细胞体外侵袭能力的强弱试验时我们将其置于盛有自来水的I烧杯中，反复漂洗几次，将多出苏木素洗去再行脱水、透明;这样做出的细胞图片背景洁净，细胞清晰

2.5水和透明时间脱水时间各为.mi.,在二甲苯中的I时间不要过长，以.min〜.mi.为宜;尤其是同步操作多种样本时，时间过长就会导致部分聚碳酯膜从上室基底部自动脱落下来，上室间粘连在一起，导致样本混淆，试验失败提议在最终一步试验时需二人协做，一人辨别并取出样本,一人小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来，置载玻片上中性树脂封片并及时编号

2.6胞计数当试验用的|细胞为圆形时，试验人员轻易将聚碳酯膜上小孔误认为细胞进行计数我们在作VEG.对人结肠癌HT

22.细胞体外侵袭能力的I影响时，发现HT229细胞很小,很轻易将聚碳酯膜上小孔误认为细胞进行计数。