《生物化学实验复习》课件

生物化学实验复习导学生化实验知识体系全解析掌握关键实验技术和实验原理提高实验操作能力和数据分析水平课程概述与考核要求课程重要性考核方式实验技能直接影响未来科研能力实验操作技能评估提供理论知识实际应用平台实验报告占总成绩60%平时表现与出勤占20%实验室安全守则安全服装实验服必须穿好扣紧防护眼镜操作危险试剂时必备应急处理熟知灭火器位置及使用方法洗眼装置化学品溅入眼睛应立即冲洗常用玻璃器皿的识别与使用烧杯量筒适合溶液混合与加热测量液体体积不适合精确量取体积读数时视线与刻度线平行移液管精确转移液体使用吸液球而非口吸实验用水和溶液配制超纯水电阻率18MΩ·cm去离子水离子交换树脂处理蒸馏水基础实验和清洗使用精密天平和称量技术天平校准使用前需气泡居中调平称量纸准备折叠四边形防药品散落药品转移避免药品接触天平盘清洁整理使用后清理称量区域酸碱滴定管与自动移液器安装固定垂直固定于铁架台排气泡轻弹除去气泡调零刻度液面与刻度零点对齐读数方法视线与液面最低点平行计的原理与校准pH缓冲液准备、和三点校准pH

4.

016.

869.18电极浸泡电极需充分浸入溶液校准确认显示值稳定后确认固相与液相萃取技术液液萃取固相萃取分配系数差异分离填料选择性吸附常用分液漏斗操作操作步骤活化上样洗脱--适合脂溶性物质提取适合痕量组分富集离心技术基础样品平衡转速设定离心管对称放置保持平衡根据目标物质选择值g温度调节时间控制热敏样品需低温离心过长可能导致样品变性光度计与分光光度计A=εc2l00-800nm朗伯比尔定律可见光范围-吸光度与浓度成正比不同波长测不同物质10-100μg/ml最佳测定范围超出范围需稀释样品实验记录与数据处理原始记录数据计算图表绘制使用钢笔直接记录标准曲线回归分析坐标轴标注清晰不涂改误差分析系统误差与随机误差区分蛋白质定量实验概述紫外吸收法双缩脲法简便快速适用范围广受芳香族干扰灵敏度较低法法Lowry Bradford经典常用灵敏度高多种干扰因素易受洗涤剂影响凯氏定氮法原理与步骤样品消煮浓硫酸高温分解有机氮碱化蒸馏氨气释放并被硼酸吸收酸滴定标准酸滴定计算含氮量紫外分光光度法测蛋白法蛋白定量Lowry双缩脲反应蛋白肽键与铜离子形成复合物磷钼酸还原酪氨酸还原磷钼试剂显色检测测吸光度750nm浓度计算通过标准曲线求得未知样品浓度法蛋白定量BCA灵敏度高抗干扰性强操作简便检测限可达兼容多种缓冲液和洗涤剂一步法反应快速

0.5μg/ml蛋白质样品电泳基础作用变性蛋白质并赋予统一负电荷SDS作用还原二硫键破坏蛋白质三级结构DTT聚丙烯酰胺提供分子筛效应分离不同大小蛋白电泳缓冲液体系维持稳定Tris-Glycine pH电泳操作步骤与要点配胶上样电泳染色分离胶浓度根据目标蛋白分微量注射器避免气泡恒压或恒流模式运行考马斯亮蓝显示蛋白R-250子量选择条带蛋白质定性实验双缩脲反应反应原理肽键与⁺生成紫色配合物Cu²至少需连续两个肽键颜色深浅与蛋白浓度成正比阳性反应呈紫色最低检测浓度约

0.2mg/ml酶与酶活性测定乙酰胆碱酯酶活性测定底物水解产物形成乙酰胆碱被酶切断产生胆碱和乙酸吸光度测定显色反应跟踪产物生成速率与巯基结合显黄色412nm DTNB酶动力学参数求解含义含义Km Vmax酶与底物亲和力指标最大反应速率越小亲和力越强与酶浓度成正比Km等于当底物饱和时的速率[S]v=Vmax/2双倒数作图对作图为直线1/v1/[S]截距为1/Vmax斜率为Km/Vmax抑制剂类型判读竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制混合型抑制抑制剂与底物竞争活性中心抑制剂与酶结合改变构象仅与酶底物复合物结合影响酶与底物亲和力及催化-效率酶的纯化与鉴定盐析硫酸铵梯度沉淀层析离子交换亲和凝胶过滤//透析去除小分子杂质纯度鉴定电泳检查条带均一性核酸的提取与鉴定细胞裂解破碎细胞释放核酸有机相分离酚氯仿去除蛋白质-醇类沉淀乙醇或异丙醇沉淀核酸洗涤与溶解乙醇洗涤后溶于缓冲液70%TE植物提取实验DNA组织研磨液氮冷冻研磨破碎细胞壁缓冲液处理CTAB去除多糖和多酚类物质氯仿抽提分离蛋白质和核酸酶处理RNA去除污染RNA电泳检测核酸纯度与完整性

0.8%

1.8-

2.010-30V/cm常用琼脂糖浓度纯度评价标准电场强度适合大多数片段分离比值应在此范围电泳速度与分辨率平衡点DNA A260/A280的酶降解与污染防控RNA手套操作处理DEPC全程戴无粉手套防皮肤污染灭活溶液中RNase RNase低温操作抑制剂使用冰上进行减缓降解加入抑制剂保护样品RNA RNase核酸定量方法紫外吸收法荧光法吸收峰特异性高且灵敏DNA260nm浓度计算稀释倍数不受杂质干扰A260××50μg/ml适合低浓度样品核酸杂交技术简介杂交原位杂交Northern分析表达定位组织中特定核酸RNA杂交基因芯片Southern检测特定序列高通量表达谱分析DNA4糖类的定性鉴定糖类莫利氏反应斐林试剂碘反应葡萄糖紫色砖红色无变化蔗糖紫色无变化无变化淀粉紫色无变化蓝色还原糖的定量分析法斐林法蒽酮法DNS二硝基水杨酸⁺被还原为浓硫酸条件下显蓝3,5-Cu²被还原为红棕色红色沉淀绿色Cu₂OSomogyi-法Nelson还原性糖还原磷钼酸多糖的提取与纯化样品处理研磨与热水抽提过滤清除去除不溶性杂质醇类沉淀乙醇体积比3:1离心收集离心分钟8000×g15脂类的提取索氏抽提器法法Folch Bligh-Dyer循环溶剂高效提取脂溶性物质氯仿甲醇混合溶剂提取氯仿甲醇水分层提取:2:1::脂肪酸分析（酯化与气相色谱）甲酯化反应甲醇催化脂肪酸甲酯形成BF₃-气相色谱分离不同碳链长度分离峰面积计算内标法定量计算各脂肪酸含量脂类定量测定生物大分子实验常见问题蛋白质实验核酸实验变性导致活性丧失核酸酶污染蛋白酶污染降解样品紫外灯暴露导致断裂沉淀形成影响测定过度剪切导致片段化酶学实验缓冲液影响活性pH底物浓度不足金属离子干扰常用实验缓冲液配制缓冲液类型范围主要应用pH细胞洗涤、稀释PBS

7.2-

7.4蛋白实验Tris-HCl

7.0-

9.0DNA/柠檬酸盐酸性环境实验

3.0-

6.2碳酸盐实验

9.2-

10.8ELISA蛋白酶抑制实验抑制剂选择1特异性抑制剂或混合物抑制率测定对照与实验组活性比较₅₀计算IC半抑制浓度反映抑制效力热稳定性实验设计小鼠肝脏糖原测定实验样品采集颈椎脱位处死小鼠取肝脏组织匀浆溶液热水浴消化30%KOH糖原沉淀无水乙醇添加冷沉淀蒽酮显色测定吸光度620nm代谢产物的定性定量分析/乳酸尿素葡萄糖丙酮酸乳酸脱氢酶法测定运动后血脲酶水杨酸法测定血尿素氮葡萄糖氧化酶法血糖测定二硝基苯肼显色法-2,4-乳酸酶联免疫吸附实验（）ELISA包被抗原或抗体固相化封闭封闭非特异结合位点BSA检测酶标记抗体结合目标分子显色底物转化为有色产物经典实验高频考题解析选择题常考点填空题常考点简答题常考点实验原理理解关键术语与专业名词实验原理与适用条件实验步骤操作要点常用试剂配制比例结果分析与错误分析实验数据计算方法关键操作参数设置方法优缺点比较实验结果与结论书写技巧数据表格化清晰呈现实验原始数据结果图形化选择合适图表展示趋势数据分析计算值与理论值比较结论简明化简明扼要陈述主要发现实验报告评审要点30%40%30%实验原理与方法数据记录与处理讨论与结论理解原理并正确描述数据完整且计算无误结果分析合理有深度实验创新设计与拓展问题提出方案设计基于已有实验提出新问题构建科学合理的实验方案方案优化预实验针对问题调整实验条件小规模测试验证可行性复习重点与备考方法重点知识备考方法各类实验原理构建知识结构图操作步骤要点实操练习提升技能数据处理方法多做计算题时间分配每日复习个实验1-2周末整合复习考前天全面回顾2答疑与总结常见问题参考资源学习小组课上收集的共性问题推荐实验教材与网络组建互助小组共同复解答资源习教师辅导预约一对一答疑时间。