细胞培养技术入门教程：课件版

细胞培养技术入门教程欢迎参加细胞培养技术入门教程本课程将系统介绍细胞培养的基础知识、操作技术和应用领域，帮助初学者建立完整的技术体系认知无论您是生物学专业学生、科研人员还是生物技术行业从业者，本教程都将为您提供全面且实用的培训内容细胞培养是现代生物医学研究的核心技术之一，也是生物医药产业的重要基础通过本课程，您将逐步掌握细胞培养的理论基础和实际操作技能，为进一步开展科研工作或从事相关产业奠定坚实基础课程简介课程目标技术发展历程行业发展趋势系统介绍细胞培养的基本原理、方从年首次体外培养蛙细胞培养技术正朝着自动化、标准1907Harrison法和技术要点，培养学员的无菌操胚神经组织，到年细胞系化、无血清培养、培养和类器官1951HeLa3D作意识和基本实验技能，使学员能建立，再到现代三维培养与类器官方向快速发展，在药物筛选、个性够独立完成常规细胞培养操作技术，细胞培养已经发展成为一门化医疗和组织工程领域应用前景广成熟而不断创新的技术体系阔细胞培养基础知识细胞的定义生物体的基本结构和功能单位培养环境模拟体内环境的人工系统培养基本原理提供营养、稳定环境、控制生长细胞是生物体的基本单位，具有自我更新和分化的能力在体外培养中，我们需要模拟体内环境，为细胞提供必要的营养物质、生长因子和适宜的物理化学条件与体内环境相比，细胞培养环境更为简单，缺乏复杂的三维结构和细胞间相互作用然而，这种简化的系统便于我们控制实验条件，研究特定因素对细胞的影响细胞培养技术的核心是通过人工控制环境条件，维持细胞的生长、增殖和功能表达常见培养细胞类型原代细胞传代细胞贴壁与悬浮细胞直接从组织分离获得的细胞，保持原始经过多次传代的细胞，其中有些可以无贴壁细胞需要附着于表面生长，悬浮细特性，但寿命有限，通常只能传代有限限传代形成永生细胞系胞可在液体培养基中独立生长次数操作简便，稳定性高贴壁细胞上皮细胞、成纤维细胞••保留组织特异性功能•可能丧失某些原始特性悬浮细胞血液细胞、某些转化细••更接近体内状态胞•常用于基础研究和药物筛选•获取和维持较困难培养方式和传代方法不同••常用细胞系举例细胞细胞细胞HeLa293T CHO来源于宫颈癌患者，是源自人胚肾细胞，转染了抗原，中国仓鼠卵巢细胞，生长迅速，易于大规Henrietta LacksSV40T首个成功建立的人类永生细胞系特点是易于转染，表达效率高常用于蛋白质表模培养在生物制药领域应用广泛，是生生长迅速，易于培养，广泛应用于癌症研达、病毒包装和基因功能研究，是分子生产单克隆抗体和重组蛋白的主要工具细胞究、病毒学和细胞生物学等领域物学研究的重要工具之一这些经典细胞系因其稳定性和特定的功能特点，成为生物医学研究中不可或缺的工具选择合适的细胞系进行实验，需要根据研究目的和细胞特性进行匹配细胞生长的基本条件营养要求温度条件碳水化合物、氨基酸、维生素等必要营养通常维持在37°C，模拟体内环境物质气体环境值pH5%CO₂浓度，维持缓冲系统平衡大多数哺乳动物细胞适宜pH

7.2-

7.4细胞生长需要特定的渗透压环境，通常在280-320mOsm/kg范围内此外，各类生长因子对细胞增殖分化起着关键调控作用，如表皮生长因子EGF、成纤维细胞生长因子FGF等，这些因素通常通过添加血清来提供所有这些条件必须协同配合，共同创造一个适宜细胞生长的微环境任何条件的异常波动都可能导致细胞生长受抑、形态改变甚至死亡，因此培养过程中需要严格监控和控制这些参数培养基的种类及组成培养基类型主要特点适用细胞DMEM高葡萄糖，适合快速生成纤维细胞、上皮细胞长细胞RPMI-1640含较多氨基酸和维生素淋巴细胞、杂交瘤细胞MEM基础配方，含必需氨基原代培养、HeLa细胞酸F12/DMEM混合培养基，营养更丰干细胞、敏感细胞系富胎牛血清FBS是培养基中最常用的添加物，通常添加5-20%，提供生长因子、激素和附着因子等抗生素如青霉素-链霉素用于预防细胞培养污染，缓冲剂如HEPES有助于维持pH稳定此外，L-谷氨酰胺作为重要能量来源和氮源，通常需要新鲜添加近年来，无血清培养基因其成分明确、批次差异小等优势，在某些应用中逐渐替代传统血清培养基细胞培养器材概述细胞培养常用容器包括培养瓶T

25、T

75、T175等不同规格、培养皿35mm、60mm、100mm等和多孔板6孔、24孔、96孔等这些容器通常由聚苯乙烯材料制成，经特殊处理使表面适合细胞附着生长实验中还需使用各种规格的移液器及无菌吸头、离心管、无菌过滤器等辅助工具不同材质的培养容器适用于不同实验目的，如超疏水表面用于悬浮培养，带滤膜的培养插入物用于共培养或极化细胞培养选择合适的器材对实验成功至关重要细胞培养实验流程总览实验准备•培养基与试剂准备•生物安全柜预操作•实验计划与记录准备细胞复苏•液氮取出细胞•迅速解冻与DMSO去除•细胞活力检测常规培养•细胞观察与状态记录•培养基更换•细胞计数与传代细胞冻存•细胞收集与计数•冻存液配制•程序降温与长期保存细胞培养实验流程是一个循环系统，从复苏开始，经过培养、传代，再到冻存保存每个环节都有其关键操作点和质量控制标准，需要严格遵循无菌操作规程，确保实验结果的可靠性和重复性细胞培养实验室简介洁净区布局动线规划设备摆放细胞培养实验室通常分为普通区、缓冲区人流、物流和废弃物流的合理分离是实验生物安全柜应远离门窗和人员频繁走动区和核心操作区，采用由外向内、清洁度逐室设计的关键操作区通常按照细胞培养域，避免气流扰动培养箱应放置在振动级提高的设计原则核心区通常为百级或工作流程布置设备，以减少交叉污染风小、温度稳定的位置显微镜需放在明亮千级洁净环境，配备生物安全柜、CO₂培险，提高工作效率主要动线包括样品准且便于观察的区域，但应避免阳光直射养箱等关键设备备、细胞操作和废弃物处理路线良好的实验室设计不仅能提高工作效率，更能降低污染风险，保障实验安全和结果可靠性因此，细胞培养实验室的规划应充分考虑功能需求、安全标准和操作便利性实验室环境条件空气洁净度温湿度控制细胞培养核心区域通常要求达到百级Class实验室温度通常维持在22-26°C，相对湿度100或千级Class1000洁净度，相当于ISO控制在40-60%这样的环境既有利于设备5-6级标准这意味着每立方英尺空气中的运行，也能减少微生物滋生的风险粒子数≥

0.5μm不超过100-1000个•全年恒温空调系统•高效空气过滤系统HEPA•湿度监控与控制•层流气流设计•温度波动≤±2°C•正压环境维持消毒系统实验室应配备紫外灯消毒系统，定时对环境进行无人状态下的紫外消毒表面消毒通常使用75%酒精或其他专用消毒剂•紫外灯（30W，照射强度≥70μW/cm²）•消毒时间记录系统•紫外灯使用寿命监控实验室环境的稳定性和洁净度是细胞培养成功的基础条件定期监测环境参数，维护洁净系统的正常运行，是实验室管理的重要内容无菌操作基础个人准备洗手消毒，穿戴防护装备环境准备清洁工作区，75%酒精擦拭操作防护防止交叉污染，保持无菌屏障质量监控定期检查，及时发现污染无菌操作的四大基本原则是预防污染源引入、减少污染物滋生、防止交叉污染和定期消毒灭菌在细胞培养操作中，应始终保持工作区洁净，避免不必要的说话和快速移动，以减少气流扰动和污染风险实验人员应穿着专用实验服、帽子、口罩和手套，操作前彻底洗手消毒所有进入无菌区域的物品都应经过适当的消毒处理无菌操作技术的掌握需要持续的练习和严格的自我要求，是细胞培养成功的关键因素主要仪器设备₂培养箱生物安全柜倒置显微镜CO维持37°C恒温、5%提供洁净的操作环用于观察培养容器中CO₂浓度和95%湿度境，保护样品免受污的细胞状态，包括形的环境，为细胞提供染，同时保护操作者态、密度和污染情稳定的生长条件现和环境不受样品污况相差显微镜能在代培养箱通常配备染常用的II级生物不染色的情况下清晰HEPA过滤系统和热安全柜采用70%回观察活细胞，是日常消毒功能，有水套式风、30%排风设计，细胞检查的重要工和气套式两种主要类确保操作安全具型离心机用于细胞收集、培养基更换等操作细胞离心通常使用800-1200rpm的低速，时间控制在3-5分钟，避免细胞损伤离心机需定期校准和安全检查培养箱的使用与维护°37C5%恒温控制₂浓度CO大多数哺乳动物细胞的最适生长温度维持培养基碳酸氢盐缓冲系统的平衡95%相对湿度防止培养基蒸发浓缩培养箱的日常维护包括定期清洁内壁和搁板，避免培养基或细胞悬液溢出后成为污染源水盘应定期更换蒸馏水并添加铜硫酸等防霉剂大多数现代培养箱配备自动热消毒程序，建议每1-2个月进行一次热消毒循环（通常为90°C，持续12小时）CO₂传感器需要定期校准，通常每3-6个月一次温度探头的准确性也应定期验证培养箱门应尽量减少开启频率和时间，以维持内部环境稳定合理安排培养容器位置，确保气流畅通，避免热点和冷点形成仪器常见故障及排查培养箱温度波动可能原因温度探头失效、控制电路故障、门封不严排查方法使用独立温度计验证、检查门封、联系技术支持₂浓度异常CO可能原因CO₂传感器漂移、气路泄漏、CO₂钢瓶耗尽湿度不足排查方法检查气源、执行传感器校准、观察培养基颜色变化可能原因水盘水量不足、水盘位置不当、箱内密封不良排查方法添加蒸馏水、检查水盘放置、观察培养基蒸发情况培养箱污染4可能原因清洁不及时、消毒不充分、培养基溢出排查方法彻底清洁、执行热消毒、必要时使用消毒剂处理对于生物安全柜BSC的常见问题，如气流异常、报警激活等，应当检查HEPA过滤器状态、风速传感器和前窗开启高度紫外灯失效通常是使用时间过长导致，应根据使用记录定期更换，一般使用2000小时后效能显著下降实验耗材的准备耗材类型消毒方法注意事项玻璃器皿高压蒸汽灭菌（121°C，20分钟）确保完全干燥后使用塑料吸管γ射线或环氧乙烷灭菌（商业包装）一次性使用，不可重复灭菌缓冲液/培养基

0.22μm膜过滤除菌热敏物质不宜高温灭菌金属工具干热灭菌（180°C，2小时）冷却后才能接触溶液实验室应建立完善的耗材管理系统，包括一次性耗材的储存、使用记录和库存管理可重复使用的器材应有明确的清洗、灭菌和质量控制流程所有灭菌过程都应有有效性验证，如灭菌指示带或生物指示剂消毒液的配制应严格按照标准操作规程进行，并注明配制日期和有效期75%酒精是常用的表面消毒剂，但不适用于芽孢污染对于重要实验，建议进行无菌验证，确保环境和器材符合要求细胞冻存与复苏基础冻存原理冻存温度冻存过程中，保护剂（如）可渗透细胞膜，取代细胞内细胞长期保存需要维持在以下，通常使用液氮罐进行存DMSO-130°C部分水分，降低冰晶形成，防止细胞在冻融过程中受损程序储在这个温度下，细胞代谢活动几乎完全停止，理论上可以降温控制冷却速率，通常为每分钟降低，避免细胞内外形无限期保存短期保存可使用超低温冰箱，但通常不超1°C-80°C成大冰晶过几个月最终浓度通常为液氮气相左右•DMSO10%•-150°C血清含量提高至液氮液相•20-90%•-196°C细胞浓度在之间超低温冰箱（临时）•1-5×10⁶/ml•-80°C液氮罐的管理至关重要，应定期检查液位，建立完善的细胞库管理系统，记录每个细胞样本的位置、来源、传代次数等信息细胞冻存前应进行霉菌支原体检测，确保保存的是无污染的健康细胞细胞复苏操作流程水浴融化37°C水浴快速解冻稀释转移预温培养基逐滴稀释离心洗涤800rpm，3-5分钟接种培养适当密度，完全培养基细胞从液氮中取出后应快速置于37°C水浴中解冻，通常30-60秒内完成，直到冰晶基本消失过长的解冻时间会增加DMSO的细胞毒性解冻后的细胞应立即用预热的完全培养基逐滴稀释，减缓渗透压变化对细胞的冲击离心去除含DMSO的冻存液是必要的步骤，因为DMSO对于37°C下的细胞有毒性复苏后的细胞应放置在CO₂培养箱中培养16-24小时，然后进行观察和换液复苏后的细胞状态评估应包括形态观察、活率计算和功能验证，确保细胞保持原有特性细胞接种（铺板）××⁴510³210低密度接种中等密度每平方厘米细胞数（用于克隆形成等）每平方厘米细胞数（常规培养）×⁴510高密度接种每平方厘米细胞数（快速增殖）细胞接种密度的计算公式所需细胞数=培养面积cm²×每平方厘米所需细胞数例如，一个25cm²培养瓶常规培养需要25×2×10⁴=5×10⁵个细胞接种密度应根据细胞类型、增殖速率和实验目的进行调整为确保细胞均匀分布，接种后应轻轻摇晃培养容器，使细胞悬液覆盖整个生长面对于贴壁细胞，接种后应立即将培养容器放入培养箱，避免长时间放置导致细胞分布不均细胞悬液配制过程中应充分混匀但动作轻柔，避免形成气泡或造成细胞损伤培养基配制与更换粉末培养基配制按照产品说明准确称量培养基粉末，溶解于适量超纯水中，添加碳酸氢钠（通常为

1.5-

2.2g/L）调节pH至

7.2-

7.4（通常呈现红棕色），然后定容，无菌过滤后分装保存完全培养基准备基础培养基加入10%FBS（56°C热灭活30分钟）、青霉素-链霉素（最终浓度100U/ml）、2mM L-谷氨酰胺等配制好的完全培养基应在4°C避光保存，通常可保存1-2个月培养基更换贴壁细胞通常每2-3天更换一次培养基取出旧培养基，加入预热的新鲜培养基悬浮细胞则需离心收集细胞后重悬于新鲜培养基中培养基呈黄色（酸性）时应立即更换培养基更换的频率取决于细胞增殖速率和代谢活性快速生长的细胞可能需要每天更换，而生长缓慢的细胞可能3-4天更换一次观察培养基颜色是判断更换时机的简单方法，pH指示剂酚红在酸性条件下变黄，提示细胞代谢产物积累细胞观察与状态评估健康细胞形态死亡细胞特征污染识别健康的贴壁细胞通常完全伸展附着于培养细胞凋亡时通常出现皱缩、圆化、细胞膜细菌污染通常表现为培养基混浊、pH迅速表面，胞质透明，轮廓清晰悬浮细胞应起泡等现象坏死细胞则表现为细胞肿下降（变黄）真菌污染可见菌丝或孢呈圆形，大小均一，悬浮液澄清不同细胀、膜破裂贴壁细胞大量漂浮，悬浮细子支原体污染不易直接观察，但可能导胞系有特定的形态特征，如成纤维细胞呈胞出现大量碎片或细胞聚集，都是细胞状致细胞生长减慢、形态变化细胞状态异纺锤形，上皮细胞呈多边形铺路石样态不佳的信号常时应及时检查可能的污染源倒置显微镜是细胞培养中最常用的观察工具，通常使用物镜进行常规观察，物镜观察细节相差显微镜能增强未染色细胞的对10×40×比度，是活细胞观察的理想工具荧光显微镜则用于特定标记细胞的观察和分析细胞计数与活率检测台盼蓝染色法血球计数板使用台盼蓝是一种不能透过完整细胞膜的染料，只能染色死亡细血球计数板是细胞计数的标准工具，包含精确刻划的网格最胞，使其呈现蓝色，而活细胞保持无色具体步骤常用的是改良的计数板计算方法Neubauer准备细胞悬液，充分混匀计数四个角方格中的细胞数

1.•取适量细胞悬液与等体积台盼蓝混合计算平均每个方格细胞数

2.

0.4%•N静置分钟（不超过分钟）细胞浓度稀释倍数

3.1-25•=N×10⁴×cells/ml加载到血球计数板活率活细胞数总细胞数

4.•%=/×100%在显微镜下计数

5.细胞计数时应避免计数团块细胞，对于位于边界线上的细胞，通常只计数位于上边界和左边界的细胞，不计数位于下边界和右边界的细胞此外，现代实验室也采用自动细胞计数仪、流式细胞仪等先进设备进行细胞计数，提高效率和准确性细胞传代原理传代意义传代时机传代比例细胞增殖到一定密度后，由于传代时机取决于细胞类型和增传代比例通常表示为1:N，意接触抑制、营养消耗和代谢产殖速率一般在细胞覆盖度达味着将一个培养瓶的细胞分到物积累，生长环境变得不适到80-90%时进行过度融合N个新培养瓶中常用比例为宜传代可以为细胞提供新鲜可能导致细胞性质改变、代谢1:2至1:10，取决于细胞类型、培养基和生长空间，维持细胞异常或死亡，而密度过低则可生长速率和实验需求健康状态能影响细胞生长传代次数细胞的传代次数对其特性有重要影响原代细胞和有限寿命细胞经过一定次数传代后会衰老传代次数通常记为P（如P5表示第5代）贴壁细胞传代需要酶消化或机械分离使细胞从培养表面脱离，而悬浮细胞则只需直接稀释酶消化通常使用胰蛋白酶-EDTA溶液，作用时间需要精确控制，过长会损伤细胞传代后应记录传代日期、比例和次数，以便跟踪细胞使用历史传代操作流程细胞观察确认细胞生长状态良好，密度达到80-90%洗涤PBS移除培养基，用PBS洗涤1-2次，去除血清酶消化3加入预热的

0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，37°C孵育2-5分钟消化检查显微镜下观察细胞变圆脱离培养表面终止消化加入含血清培养基终止胰酶活性重悬分装轻轻吹打形成单细胞悬液，按传代比例分装机械法传代适用于某些对酶敏感的细胞，通常使用细胞刮刀直接将细胞从培养表面刮下这种方法可能导致细胞损伤增加，但避免了酶对细胞表面分子的影响某些细胞系可能需要特殊的传代方法，如角质形成细胞需要低钙离子环境才能有效消化，神经元细胞可能需要特殊的酶混合物对于传代敏感的细胞，可尝试降低酶浓度、缩短消化时间或使用更温和的酶替代品细胞冻存操作详解冻存前准备确保用于冻存的细胞处于对数生长期，无污染，活率90%提前准备冻存管（灭菌），标记清楚细胞信息（名称、日期、传代次数等）冻存液应新鲜配制，常用配方为90%FBS+10%DMSO，置于冰上预冷细胞处理收集细胞，计数确定浓度调整细胞浓度至1-5×10⁶/ml轻柔地重悬细胞于冰冷的冻存液中，避免气泡每个冻存管通常分装1ml细胞悬液所有操作应在冰上进行，减少DMSO毒性程序降温将装有细胞的冻存管置于程序降温盒（如Mr.Frosty）中，先在-80°C冰箱放置24小时，控制降温速率约为1°C/分钟也可使用程序降温仪进行更精确控制24小时后转移至液氮中长期保存程序降温对细胞冻存成功至关重要，过快的冷却会导致细胞内形成冰晶，损伤细胞结构；过慢的冷却则使细胞长时间暴露于高浓度溶质中，造成溶质损伤理想的冷却速率能够平衡这两种损伤机制液氮保存分为气相（-150°C左右）和液相（-196°C）保存气相保存可降低交叉污染风险，但温度波动较大；液相保存温度更稳定，但存在污染风险建立完善的细胞库管理系统，记录每个样本位置、冻存日期和使用情况，对细胞资源的有效管理至关重要细胞培养常见污染源细菌污染真菌污染特征培养基快速变浊、pH降低（变黄）、显特征肉眼可见棉絮状或霉点，显微镜下可见微镜下可见大量杆状或球状细小颗粒菌丝或孢子防控严格无菌操作，添加抗生素（通常为青防控环境卫生，添加两性霉素B，灭菌彻底霉素-链霉素）支原体污染病毒污染特征细胞生长缓慢，形态异常，但无明显培特征不易直接观察，可能导致细胞病变或生4养基变化长异常防控定期检测，使用特定抗生素（如环丙沙防控使用经验证的试剂，避免混合不同来源星）细胞细胞污染的主要来源包括实验操作者（皮肤、呼吸道、头发等）、实验环境（空气、台面、仪器设备）、培养基和试剂（血清、水、消毒不彻底的溶液）以及交叉污染（共用器材、操作不规范）一旦发现污染，对于贵重或难以替代的细胞，可尝试抢救性处理，如使用高浓度抗生素短期处理但大多数情况下，彻底丢弃受污染细胞并进行全面消毒是最安全的做法定期监测细胞状态和进行支原体检测是预防污染扩散的关键措施细胞污染的早期识别细菌污染早期特征真菌污染早期特征支原体污染特征细菌污染初期可能表现为培养基略微混真菌污染初期可能出现小而分散的丝状或支原体污染不易直接观察，但会导致细胞浊，特别是培养瓶底部显微镜下可见小分枝结构，随后发展为明显的菌丝网络形态改变，如变圆、细胞质颗粒增多增点状或杆状物体活跃移动，尤其在细胞周有些真菌会形成圆形孢子，漂浮在培养基殖速率明显下降，细胞功能异常专业检围区域通常培养24小时后污染会变得明中真菌污染通常发展较缓慢，但最终会测需用DAPI染色或PCR方法，能在早期确显，培养基迅速变黄覆盖整个培养表面认污染污染导致的细胞状态变化通常包括生长速率下降、形态异常、培养基颜色变化速度异常、细胞聚集或大量死亡等及早识别这些变化迹象，有助于控制污染扩散，保护其他未受影响的细胞培养关键步骤操作规范无菌移液技术换液标准流程无菌移液是细胞培养中最基本也是最关键的技培养基更换是维持细胞生长环境的重要操作，能之一标准流程包括应遵循以下标准•移液器吸头不接触任何非无菌表面•培养基预热至37°C再使用•打开容器时盖子朝下放置•轻柔倾倒或吸弃旧培养基•容器口经火焰灭菌后再倾倒•贴壁细胞层始终保持湿润•避免说话、咳嗽或快速移动•新培养基沿容器壁缓慢加入•液体转移时避免产生气泡•避免直接冲击细胞层交叉污染预防防止不同细胞系之间的交叉污染至关重要•同一时间只处理一种细胞系•不同细胞使用独立的试剂和器材•操作间隔进行台面消毒•明确标记所有培养物和试剂•建立规范的操作记录系统生物安全柜的正确使用对确保无菌操作至关重要操作区应保持整洁，避免放置过多物品物品放置应遵循清洁区-工作区-污染区的布局原则开始操作前应让气流稳定5-10分钟，操作时手部动作应缓慢和规律，避免在垂直气流方向上快速移动实验记录与数据管理记录要素实验日期、细胞信息、操作步骤、观察结果记录系统纸质记录本或电子实验记录系统数据分析生长曲线、活率统计、图像处理长期存档安全备份、分类整理、检索系统细胞培养的关键记录信息应包括细胞类型和来源、传代次数、培养条件（培养基、血清批次等）、观察到的形态特征、生长状态评估、污染情况以及任何异常现象图像记录（显微照片）对于细胞状态的长期追踪和比较尤为重要电子记录系统的优点在于数据检索方便、易于共享和备份、可整合图像数据；而纸质记录则具有操作简便、不依赖电子设备、法律效力高等特点无论采用何种记录方式，都应保证记录的及时性、完整性和真实性，避免事后补记或修改原始数据实验室可建立标准化的记录模板，确保不同人员的记录格式统一细胞培养的典型应用生物制药生产抗体、重组蛋白与疫苗基础研究细胞生物学、分子机制研究药物筛选毒性测试与功效评价组织工程构建人工组织与器官疾病模型模拟人类疾病发生机制药物筛选平台是细胞培养的重要应用领域，可用于评估药物对特定细胞类型的毒性和疗效高通量筛选技术结合细胞培养，使得同时测试数千种潜在药物分子成为可能，大大加速了药物开发进程疾病模型构建方面，通过基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）可以在培养细胞中引入或修复特定疾病相关基因，创建模拟人类疾病的细胞模型这些模型有助于深入研究疾病机制并进行靶向药物开发在生物制药领域，特别是单克隆抗体和重组蛋白生产中，大规模细胞培养技术已成为产业化的核心工艺细胞转染技术概览转染方法原理优点缺点脂质体转染阳离子脂质包裹DNA操作简便，效率较细胞毒性，某些细胞形成复合物，通过膜高，适用范围广类型效率低融合导入细胞电穿孔电脉冲形成暂时性膜适用于难转染细胞，细胞死亡率高，设备孔，使DNA进入细胞可转染大容量DNA成本高钙磷酸沉淀DNA与磷酸钙形成沉成本低，适合大规模重复性差，效率较低淀，被细胞吞噬转染病毒转导利用病毒感染机制导效率极高，可实现稳制备复杂，安全性顾入目的基因定整合虑提高转染效率的关键策略包括1使用高质量质粒DNA，纯度OD260/280比值在

1.8-

2.0之间；2细胞状态控制在对数生长期，汇合度在50-80%；3优化DNA与转染试剂比例；4转染后避免立即更换培养基，通常等待4-6小时；5对难转染细胞，可尝试添加转染增强剂不同细胞系对转染方法的敏感性差异很大例如，HEK293系列细胞适合多种转染方法，转染效率通常很高；而原代细胞和神经元细胞则转染难度较大，可能需要尝试病毒转导或特殊的电穿孔条件转染效率的评估通常通过报告基因（如GFP、荧光素酶）表达来判断与基因敲除案例CRISPR设计sgRNA针对目标基因设计特异性引导RNA，通常选择基因编码区前端的外显子构建载体将sgRNA克隆入表达Cas9蛋白的载体转染细胞使用脂质体转染293T细胞，荧光标记辅助筛选单克隆分离稀释法获得单细胞克隆验证筛选PCR、测序和蛋白检测确认敲除效果在293T细胞CRISPR敲除实验中，转染效率通常可达80%以上转染48小时后，可通过流式细胞分选或有限稀释法分离单细胞克隆克隆扩增后，首先通过PCR和Sanger测序确认基因组DNA编辑情况，再通过Western blot验证蛋白表达缺失CRISPR系统敲除效率受多种因素影响，包括sgRNA设计、转染效率、细胞类型等优化策略包括使用多个sgRNA靶向同一基因不同位点，增加筛选标记，优化Cas9表达等脱靶效应是CRISPR技术的主要风险，可通过高特异性sgRNA设计和全基因组测序分析来评估和减轻干细胞培养介绍诱导多能干细胞间充质干细胞iPSC MSC是通过重编程体细胞获得的多能干细胞，具有自我更新能是存在于多种组织中的成体干细胞，具有分化为骨、软iPSC MSC力和分化为三胚层细胞的潜力骨、脂肪等中胚层组织的能力培养基通常使用或培养基低糖生长因子•Essential8mTeSR1•DMEM+10%FBS+基质或重组蛋白（如）培养表面普通培养表面，无需特殊处理•Matrigel Vitronectin•传代酶法（如或）或机械法传代胰蛋白酶或•EDTA Accutase•

0.25%TrypLE特征紧密的菊花状集落，细胞核大、细胞质少特征贴壁生长，纺锤形形态••干细胞分化诱导是再生医学和疾病模型研究的重要应用例如，可通过添加特定生长因子和小分子化合物分化为心肌细胞iPSC首先诱导中胚层形成（使用和），然后诱导心脏前体（使用和），最后分化为功能性心肌细胞（抑制BMP4Activin AVEGF bFGF信号通路）分化的心肌细胞可应用于心脏疾病模型、药物筛选和心肌修复研究Wnt干细胞培养的关键挑战包括维持未分化状态、避免自发分化、防止染色体异常、降低批次间差异等解决这些挑战需要严格控制培养条件、定期鉴定细胞特性、进行质量控制检测，以及使用标准化的无血清培养体系动物细胞规模培养搅拌式生物反应器微载体培养中空纤维系统搅拌式生物反应器是最常用的大规模细胞培微载体是直径100-300μm的小球体，为贴中空纤维生物反应器由数千根半透膜纤维组养设备，容积从几升到数千升不等机械搅壁细胞提供附着表面常见材质包括琼脂成，细胞生长在纤维外侧或内侧培养基通拌确保培养环境均匀，通常配备溶氧、糖、明胶、聚苯乙烯等微载体可显著增加过纤维内循环，营养物和代谢产物通过膜扩pH、温度等参数在线监测系统适用于悬单位体积培养面积，使贴壁细胞也能在悬浮散交换这种系统可实现高密度培养，模拟浮细胞或微载体附着的贴壁细胞培养系统中大规模培养，提高产量和降低成本体内微环境，适合生产高价值蛋白大规模细胞培养的关键技术参数包括溶氧控制、pH调节、剪切力管理和培养基补料策略等溶氧常通过气泡通气或表面曝气提供，但需控制剪切力避免细胞损伤培养基补料可采用批次、半批次或灌流模式，后者可显著提高产量和产品质量三维细胞培养（）3D球状体培养类器官培养细胞自组装形成的三维球形结构，直类器官是从干细胞或祖细胞发展而径通常为50-500μm常用方法包括来，具有特定器官相似结构和功能的悬滴法、低粘附表面培养和旋转培养三维培养物培养过程通常需要特定等球状体内部存在氧气和营养梯的生长因子和细胞外基质成分（如度，细胞呈现出更接近体内的分化状Matrigel）支持可用于疾病建模、态和功能特性药物筛选和再生医学研究支架培养使用天然（如胶原、透明质酸）或合成（如聚乳酸、聚己内酯）材料制成的三维支架，为细胞提供生长环境支架可设计特定的物理化学性质和拓扑结构，引导细胞排列和组织形成广泛应用于组织工程和再生医学三维培养相比传统二维培养具有多项优势细胞形态和极性更接近体内状态；细胞-细胞、细胞-基质相互作用更为复杂和真实；基因表达模式和信号转导更接近体内；对药物反应更具预测性；可模拟组织微环境的复杂性三维培养的主要局限性包括标准化和重复性挑战；实时观察和分析困难；培养成本较高；细胞提取和分离技术复杂；大规模生产面临技术障碍尽管如此，三维培养技术正迅速发展，成为连接传统细胞培养和动物模型的重要桥梁实验案例一细胞增殖曲线绘制HeLa天数细胞数量×10⁴实验案例二常见药物对细胞活率影响药物浓度μM顺铂紫杉醇5-氟尿嘧啶细胞培养中的常见错误培养环境问题温度异常培养箱温度设置错误或温度传感器失效CO₂浓度不稳气体传感器校准不准或管路泄漏解决方案定期校准并验证培养箱参数，使用独立温度计与CO₂检测器培养基问题pH异常配制错误或缓冲系统失效营养耗尽培养基更换不及时或细胞密度过高解决方案严格按照说明配制培养基，定期检查pH，根据细胞密度及时更换培养基细胞处理错误酶消化过度时间过长导致细胞损伤离心参数不当转速过高或过低影响细胞收集效率解决方案优化酶消化条件，密切观察细胞状态，选择适当的离心参数污染问题微生物污染无菌操作不严格或环境污染交叉污染不同细胞系混用设备或试剂解决方案加强无菌操作培训，定期环境监测，不同细胞使用独立器材预防细胞培养常见错误的关键在于建立标准操作规程SOP并严格执行实验前充分了解所用细胞的特性和需求，根据细胞类型选择合适的培养条件和操作方法定期进行细胞形态学观察和质量控制检测，如霉菌支原体检测、细胞身份验证等，及早发现潜在问题细胞培养安全规范气溶胶安全化学品安全液氮安全细胞培养过程中可能产生含有潜在生物危害DMSO、甲醛、胰蛋白酶等常用试剂具有一液氮温度极低（-196°C），可导致严重冻的气溶胶，特别是在移液、离心和细胞收集定毒性，应在通风环境下操作化学品应按伤操作时必须佩戴专用防护手套和面罩过程中应始终在生物安全柜内操作，避免类别存储，避免不兼容试剂放置在一起所液氮罐应放置在通风良好的区域，避免氮气产生气泡和飞溅离心管应密封，开启前在有试剂瓶应清晰标记，包括名称、浓度、配蒸发导致缺氧冻存管应使用专用耐低温类安全柜内静置5-10分钟，让气溶胶沉降制日期和危险性紫外线对皮肤和眼睛有型，封口牢固，避免液氮进入管内导致爆炸害，操作时应避免直接照射风险实验室应制定详细的安全应急流程，包括生物暴露、化学品泄漏、火灾和人员意外等情况的处理程序所有人员应熟悉紧急设备（如洗眼器、淋浴器）的位置和使用方法，以及紧急联系人电话定期进行安全培训和演练，确保在紧急情况下能够正确应对个人防护与卫生管理实验室着装要求手部卫生标准工作区域卫生进入细胞培养区域需要穿戴适当的个人防护装备手部是最常见的污染源之一，严格的洗手规范至关维持工作环境的清洁是预防污染的基础PPE重要•工作前后用75%酒精喷洒擦拭台面•实验服应为长袖，材质易清洁消毒•进入实验室前彻底洗手•每日紫外消毒30-60分钟•手套无粉乳胶或丁腈手套，操作前检查完整性•使用肥皂或消毒洗手液，冲洗至少20秒•定期清洁培养箱、显微镜等设备•口罩防护口罩减少呼吸道污染物•特别注意指缝、指甲缝和手腕部位•废弃物及时处理，分类放置•帽子完全包裹头发，防止头发脱落污染•使用一次性纸巾擦干•保持工作区整洁有序，避免杂物堆积•鞋套进入洁净区域时需穿戴•戴手套前和摘手套后都需要洗手实验室应建立完善的卫生管理制度，包括日常清洁消毒计划、定期深度清洁安排和卫生检查记录每个操作区域应有明确的清洁责任人和操作规程特别注意交叉污染风险高的区域，如门把手、开关、共用设备表面等，应增加清洁消毒频率实验室危害与风险评估生物危害化学危害细胞、组织样本、血清等含有潜在感染性物试剂、染色剂、消毒剂等化学品的毒性风险质•甲醛等致癌物质•人源样本可能含有病毒或病原体•有机溶剂的挥发性与易燃性•动物源性产品可能有人畜共患病风险人体工学风险物理危害长时间重复性操作导致的健康问题设备、工具和环境条件导致的伤害风险•颈肩疼痛•液氮低温冻伤•腕管综合征•玻璃器皿破碎•视觉疲劳•紫外灯辐射生物安全等级BSL划分用于指导不同风险级别生物材料的安全操作常规细胞培养通常在BSL-1或BSL-2级别进行BSL-1适用于已知不会导致健康人疾病的生物材料；BSL-2适用于可能导致人类疾病但严重性有限的材料，如原代人体细胞、HIV感染细胞等风险评估应系统识别潜在危害，评估其发生概率和危害程度，并制定相应的控制措施评估应定期更新，特别是在引入新技术、新材料或工作流程变更时有效的风险沟通确保所有实验室人员了解风险和相应的安全措施，是预防事故的关键环节细胞相关废弃物处理废弃物类型处理方法注意事项培养废液添加有效氯≥5000mg/L避免直接倒入下水道，确的消毒液处理≥30分钟保完全灭活培养容器高压蒸汽灭菌121°C30分塑料容器需放入专用垃圾钟或浸泡消毒后丢弃袋，标记为生物危害尖锐物品收集于专用硬质利器盒，禁止回套针头，防止刺伤满3/4后封闭受污染手套视为生物危害废弃物处理脱手套前进行表面消毒生物危害废弃物应依据国家和地方法规进行分类收集和处理通常需要使用专用的带有生物危害标志的垃圾袋或容器，并确保密封完好实验室应建立废弃物处理的标准操作流程，包括临时储存、记录和最终处置的全过程管理化学废液处理需考虑环保要求，不同类型的化学废液应分开收集，避免不兼容物质混合导致危险反应含有重金属、有机溶剂等有害物质的废液需委托有资质的机构处理标记清晰是安全处理的基础，所有废弃物容器应注明内容物、危害性质和产生日期突发情况处理细胞污染应对•立即隔离受污染培养物，放入密封容器•记录污染情况，包括时间、容器信息和可能原因•对操作区域进行彻底消毒，包括设备表面•检查其他相关培养物是否受影响•回溯操作步骤，分析污染源，防止再次发生气体泄漏处理•发现CO₂或液氮泄漏，立即打开窗户通风•撤离人员至安全区域，防止缺氧危险•关闭气体总阀，切断泄漏源•穿戴适当防护装备后检查泄漏点•向实验室安全负责人报告，记录事件生物材料溢出•使用吸水纸覆盖溢出物，防止扩散•从外向内倒入消毒液（如10%漂白剂）•等待至少20分钟确保充分灭活•使用镊子处理可能的碎片，避免手部接触•按生物危害废弃物处理所有清理材料应急设备的正确使用对于有效处理突发情况至关重要实验室应配备洗眼器/淋浴器、灭火器、急救箱、溢出处理套件等应急设备，并定期检查其功能状态所有人员应接受使用培训，熟悉设备位置和基本操作方法建立明确的应急报告机制和联系人网络，确保事件能够及时上报并得到恰当处理事后应进行彻底的原因分析和改进措施制定，预防类似事件再次发生对重大事件进行案例分析和经验分享，作为安全教育培训的素材支原体污染检测试剂盒应用法检测酶联比色法PCRPCR检测是目前最常用的支原体检测方法，其原理是扩增支原体特异性酶联比色法基于检测支原体特有的酶活性，如腺嘌呤磷酸化酶DNA序列

1.收集细胞培养上清液至试剂盒提供的管中

1.收集培养上清液，直接用作PCR模板

2.加入底物，37°C孵育固定时间

2.按试剂盒说明配制PCR反应体系

3.加入显色剂，观察颜色变化

3.进行PCR扩增，通常包括30-40个循环

4.与对照比较，判断结果

4.琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物酶联法优点是操作简单，不需要特殊设备，可检测活的支原体缺点是

5.出现特定大小条带表示支原体阳性灵敏度低于PCR，需要较高浓度的支原体（通常10³CFU/ml）才能检出PCR方法的优点是敏感性高（可检测10-100CFU/ml），特异性强，操作相对简便缺点是需要专业设备，且不能区分活的和死的支原体结果判读需要注意的问题阳性对照必须显示明确阳性信号，阴性对照必须为阴性，否则结果无效弱阳性结果建议重复检测确认PCR检测中常见的假阳性源自污染，建议使用设置阴性对照和严格的实验操作规程来避免假阴性可能由样品中PCR抑制剂或支原体浓度低于检测限导致支原体检测应纳入细胞培养质量控制常规，建议每1-3个月检测一次，或在细胞生长异常时进行检测对于重要实验使用的细胞，应在实验前确认无支原体污染阳性细胞的处理通常有两种选择丢弃重新取用干净细胞，或使用专业支原体清除试剂进行治疗理论考试与操作考核理论知识考察培养原理、无菌操作、安全规范基本技能考核移液技术、传代操作、细胞计数实验记录评估数据记录完整性、逻辑性、规范性综合能力评定问题分析、应急处理、实验设计理论知识考试内容通常包括细胞生物学基础知识、培养技术原理、无菌操作规范、安全防护要求、仪器设备使用原则等考试形式可以是选择题、填空题和简答题的组合，重点考察对核心概念的理解和应用能力技能考核采用实操方式，评估学员的操作规范性和熟练程度考核项目包括无菌操作技术（如移液、培养基更换）、细胞传代与密度调整、细胞计数与活率测定等基本技能评分标准关注操作过程的正确性、无菌意识的体现、时间效率和结果准确性综合能力评定则着重考察学员面对问题的分析和解决能力，如污染处理、异常情况应对和简单实验设计等最新进展与前沿技术自动化培养系统类器官技术结合机器人技术和人工智能的全自动细胞类器官Organoids是从干细胞培养发展培养系统正逐渐普及这些系统可以自动出的三维微型器官结构，可模拟体内器官完成细胞培养的各个环节，包括接种、培的组织架构和功能近年来，肠、肝、养基更换、传代和监测等自动化不仅提脑、肾等多种类器官系统取得突破，为疾高了效率和重复性，还减少了人为操作带病模型、药物筛选和再生医学提供了新工来的污染风险和变异性具类器官与微流控器官芯片结合，可创建更复杂的体外生理系统基因编辑细胞系CRISPR/Cas9等基因编辑技术与细胞培养的结合，使创建特定基因修饰的细胞系变得更加高效和精准这些工程化细胞系广泛应用于基因功能研究、疾病机制探究和药物靶点验证商业化的基因编辑细胞库为研究者提供了丰富的研究资源最近新闻案例2022年，研究人员利用类器官技术结合多细胞培养，成功构建了功能性的人类肾脏组织模型，该模型展现出肾小球滤过和肾小管重吸收等关键生理功能这一突破为研究肾脏疾病和药物肾毒性评价提供了重要工具细胞培养未来发展趋势包括无血清和化学成分明确的培养系统不断优化；利用生物材料和生物打印技术构建更复杂的三维培养环境；培养自动化与数据分析的深度整合，实现智能培养室；单细胞分析技术与培养系统结合，实现实时细胞功能监测和精准筛选课程常见问题答疑如何判断培养皿中是否有污染？通常表现为培养基混浊或变黄、气泡异常增多、细胞形态改变等使用显微镜可以观察到污染物（如细菌、真菌）定期仔细观察是预防污染扩散的关键如何确定最佳传代时间？根据细胞覆盖度（通常80-90%）、培养基颜色变化和细胞形态判断不同细胞系有不同的生长特性，需要积累经验，建立适合特定细胞的传代规律为什么细胞复苏率低？可能原因包括冻存前细胞状态不佳、冻存过程降温速率不适宜、保存温度波动、复苏过程过慢或过快、DMSO去除不彻底等优化冻存和复苏流程可提高成功率转染效率低的原因有哪些？细胞状态不佳（过度融合或刚传代）、质粒纯度不高、转染试剂比例不优、培养条件不适等都可能导致转染效率低不同细胞系对转染方法的敏感性也有很大差异技术支持与问题解决渠道包括课程指导老师的在线答疑系统，可通过电子邮件或微信群联系；细胞培养专业论坛和问答平台，如中国细胞生物学学会网站；试剂和设备供应商提供的技术支持服务，通常包括详细的产品使用手册和在线咨询学员常见困惑还包括设备故障诊断、优化特定细胞类型的培养条件、解决细胞生长缓慢或形态异常等问题针对这些问题，除了基础理论学习外，实际操作经验的积累和同行交流也是解决问题的重要途径建议记录细胞培养过程中的观察发现，形成个人的技术笔记推荐工具与参考资源推荐书籍《培养细胞的基本原理与技术》（张锡葵主编）、《细胞培养实验指南》（尚永丰主编）、《Culture ofAnimal Cells》（R.Ian Freshney著）、《Basic CellCulture Protocols》（Springer出版）这些书籍涵盖了细胞培养的基础理论和实用技术，是初学者和专业人员的重要参考资料网络资源中国科学院细胞库http://www.cellbank.org.cn提供细胞株信息和技术资源；美国ATCC细胞库http://www.atcc.org是国际标准细胞资源中心；Bioprotocol网站收录了大量经同行评议的实验方案；各大试剂公司如Thermo Fisher、Corning等的技术支持网站有详细的操作视频和故障排除指南此外，PubMed、Web ofScience等数据库可检索最新研究文献，Nature Protocols、Journal ofVisualizedExperiments等期刊提供详细的实验方案经验分享与小技巧细胞观察技巧无菌操作小窍门问题解决经验使用相差显微镜时，适当调低移液管插入培养基瓶时避免触细胞贴壁不良时，可尝试提高光源亮度可提高细胞结构的对碰瓶口，瓶盖放置时内侧朝血清浓度或使用细胞外基质蛋比度观察前轻轻旋转培养皿下生物安全柜内预留物品操白（如胶原、纤连蛋白）预处使细胞均匀分布定期在同一作空间，避免在气流屏障上方理培养表面传代困难的细胞位置拍照，便于比较细胞生长操作使用吸管时，先吸取少可使用细胞刮刀代替酶消化状态变化解冻贴壁细胞8小量液体润洗内壁再进行正式操培养基蒸发严重时，可在培养时后小心观察，此时应有部分作准备工作完成后再取出细箱的水盘中添加铜硫酸溶液抑细胞开始贴壁胞，减少细胞暴露在室温的时制微生物生长间实验室管理心得建立细胞库信息管理系统，记录细胞来源、传代次数、检测结果等制作试剂配制快速指南，贴在工作区显眼位置培养基和常用试剂分装为适量小包装，减少反复解冻次数设立设备使用登记本，记录使用情况和异常情况行业前辈的经验提示始终保持怀疑态度，不放过任何细节异常；建立系统的实验记录习惯，记录所有观察和思考；面对失败保持耐心，从错误中学习；定期进行污染检测，防患于未然；与同行保持交流，分享经验和解决方案课程回顾与展望3理论基础细胞特性、培养原理、环境要求15基本技能无菌操作、传代、冻存、观察计数等7应用拓展转染、3D培养、规模化生产等25技术前沿自动化、类器官、智能培养系统通过本课程的学习，您已经掌握了细胞培养的基础理论和核心技术，能够理解细胞培养的科学原理，执行标准操作流程，并进行基本的问题分析和解决细胞培养是一门需要耐心和经验的技术，技能的提升需要不断实践和总结建议从简单细胞系开始，逐步尝试更复杂和专业的细胞培养技术细胞培养技术的发展日新月异，建议持续关注最新研究进展和技术动态，参与专业培训和学术交流活动从初级技术到高级应用，是一个循序渐进的过程希望本课程能为您打开细胞培养的大门，为今后的科研或产业工作奠定坚实基础最重要的是保持科学严谨的态度和持续学习的热情，这将是成为细胞培养领域专业人才的关键。