《分子生物学与基因工程》课件

分子生物学与基因工程欢迎学习《分子生物学与基因工程》课程！本课程将深入探讨分子生物学的基本原理和基因工程的前沿技术应用通过系统学习、和蛋白质的结DNA RNA构与功能，理解基因表达调控机制，以及掌握基因工程的实验技术与方法分子生物学发展简史1年1869米舍尔从细胞核中分离出核素即DNA2年1944艾弗里证明是遗传物质的载体DNA3年1953沃森和克里克提出双螺旋结构模型，奠定分子生物学基础DNA4年1961尼伦伯格破译遗传密码，揭示与蛋白质合成的关系DNA分子生物学作为一门独立学科的诞生可追溯至世纪年代，沃森和克里克发现双螺2050DNA旋结构是其重要里程碑此后，科学家们相继阐明了复制、转录和翻译的分子机制，开DNA启了理解生命本质的新时代的基本结构DNA磷酸基团形成骨架的重要组成部分，连接相邻的脱氧核糖DNA脱氧核糖五碳糖，是核苷酸的重要组成部分含氮碱基包括嘌呤、和嘧啶、，按照碱基互补配对原则连接A G C T呈双螺旋结构，由两条多核苷酸链通过氢键连接而成每条链的骨架由磷酸二酯键连接的脱氧核糖构成，碱基位于内侧碱基配对遵循特定规则腺嘌呤与胸腺嘧啶DNA A T配对，鸟嘌呤与胞嘧啶配对G C核酸的种类与功能脱氧核糖核酸核糖核酸DNARNA结构特点双链结构，含脱氧核糖，碱基包括、、、结构特点通常为单链结构，含核糖，碱基包括、、、ATG CA UG C主要功能主要功能•遗传信息的长期存储载体•参与蛋白质合成过程•通过复制传递遗传信息•基因表达调控•基因组结构的主要成分•某些病毒的遗传物质的类型RNA信使RNA mRNA•携带DNA信息至核糖体•含有编码蛋白质的密码子序列•5帽子结构和3多聚A尾转运RNA tRNA•呈三叶草结构•携带特定氨基酸•含有与密码子配对的反密码子核糖体RNA rRNA•与蛋白质结合形成核糖体•具有催化肽键形成的活性•高度保守的结构调控性RNA•miRNA21-23nt，调控基因表达•siRNA干扰特定基因表达•lncRNA参与染色质修饰等过程复制的分子机制DNA解旋引物合成解旋酶打开双螺旋，形成复制叉引物酶合成引物RNA校对修复链延伸外切酶活性校正错误聚合酶催化脱氧核苷酸连接3→5DNA复制是一个半保留复制过程，新合成的分子中，每条链都包含一条来自母链的链和一条新合成的链复制过程需要多种酶和蛋白DNA DNA质的协同作用，包括聚合酶、解旋酶、引物酶、连接酶等DNA复制的起始与延伸DNA识别起始位点起始复制蛋白复合物识别并结合到含有特定序列的复制起点在DNA ORI真核生物中，一条染色体通常包含多个复制起点，可同时进行复制形成复制泡解旋酶打开双链，形成复制泡，随后单链结合蛋白稳定暴露的单链DNA区域，防止其重新退火每个复制泡有两个复制叉向相反方向延伸引物合成与延伸引物酶在模板链上合成短的引物，聚合酶以此为起点，沿RNA DNA方向延伸链领先链连续合成，滞后链则以冈崎片段方式5→3DNA不连续合成损伤与修复机制DNA主要损伤类型损伤可由紫外线、电离辐射、化学物质或复制错误引起，常见类型包括碱基错配、DNA碱基修饰、链内交联、链间交联以及单链或双链断裂等核苷酸切除修复识别并切除含有损伤碱基的核苷酸片段，然后以完整链为模板合成新填补缺口DNA这种机制主要修复由紫外线引起的胸腺嘧啶二聚体碱基切除修复糖基化酶识别并切除损伤的单个碱基，核酸内切酶切开无碱基位点，随后聚合DNA AP酶填补缺口并由连接酶连接这是修复单碱基损伤的主要途径错配修复识别并修复复制过程中产生的碱基错配和小型插入缺失重要的错配修复蛋白如/、等，其基因突变与某些癌症相关MLH1MSH2基因的概念与组织基因1能够编码蛋白质或功能的片段RNA DNA外显子基因中能够表达的序列，最终存在于成熟中mRNA内含子位于外显子之间的非编码序列，在成熟过程中被剪除RNA在真核生物中，基因结构通常包含启动子区、非翻译区、编码序列由外显子和内含子组成、非翻译区和终止信号等部分外显子53携带编码蛋白质的信息，而内含子在转录后经过剪接被去除基因在染色体上有特定的排列方式，彼此之间由非编码区分隔这些非编码区可能包含调控元件，参与基因表达的调控人类基因组中，编码蛋白质的序列仅占约，大部分区域是非编码2%DNA染色体与人类基因组人类染色体组人类基因组测序染色体结构人类基因组包含对染色体，其中对人类基因组计划于年完成，确定了染色体由和蛋白质组成，在细胞分23222003DNA为常染色体，对为性染色体每条染色人类基因组约亿个碱基对的序列这裂期高度浓缩每条染色体有一个着丝130体都携带着数百至数千个基因，编码着维项成就为研究基因功能、疾病机制和个体粒，将染色体分为短臂臂和长臂pq持生命必需的蛋白质和功能差异提供了基础数据和工具臂，便于定位基因和描述染色体异常RNA人类基因组中约有个蛋白质编码基因，这个数量远低于早期预测然而，通过选择性剪接、编辑和翻译后20,000-25,000RNA修饰等机制，这些基因可以产生多种蛋白质变体，大大增加了蛋白质组的复杂性染色质结构与调控染色体分裂期高度凝聚的结构染色质与组蛋白和非组蛋白的复合物DNA核小体缠绕组蛋白八聚体的基本结构单位DNA染色质是真核细胞核内与蛋白质的复合物，其基本结构单位是核小体每个核小体由缠绕组蛋白八聚体由、DNA146bp DNAH2A、和各两个分子组成形成核小体之间的由连接组蛋白结合，形成珠串结构H2B H3H4DNA H1染色质根据凝聚程度可分为常染色质和异染色质常染色质结构相对松散，基因转录活跃；异染色质高度凝聚，转录活性较低组蛋白修饰如乙酰化、甲基化、磷酸化等能改变染色质结构，是基因表达调控的重要机制转录的过程起始聚合酶结合启动子，在转录因子辅助下开始转录RNA延伸聚合酶沿模板链移动，合成与模板链互补的RNA RNA终止聚合酶识别终止信号，释放新合成的和模板RNA DNA转录是信息流向的过程，由聚合酶催化在真核细胞中，有三种主要DNA RNA RNA的聚合酶聚合酶转录，聚合酶转录和大多数小，RNA RNAI rRNA RNA IImRNA RNA聚合酶转录和RNA IIItRNA5S rRNA转录过程中，双链部分解开，露出模板链聚合酶按照方向合成DNA RNA5→3，碱基配对原则为配不是，配与复制不同，转录通常只涉及RNA AU TGC DNA基因组的特定区域，而且不需要引物基因转录调控元件启动子增强子沉默子位于基因上游的序列，是聚合酶结合和起始能增强基因转录的调控序列，可位于基因上游、下游或抑制基因表达的序列，与负调控转录因子结合，DNA RNADNA转录的位点真核生物的核心启动子通常包含盒，内含子中，甚至可远离靶基因数千碱基阻碍聚合酶活性或招募组蛋白去乙酰化酶，导致染TATA RNA位于转录起始点上游约处色质凝聚25-30bp增强子与特定转录因子结合后，通过环化与启动DNA启动子强度决定了基因的基础转录水平，是转录调控的子区接触，促进转录机器的组装和活化一个重要层面转录调控元件与各种转录因子的相互作用构成了复杂的基因表达调控网络，使基因能在特定时间、特定细胞类型中以适当水平表达这些调控机制的精确协调对生物体的正常发育和生理功能至关重要的剪接与处理mRNA帽子结构5在端加入甲基鸟嘌呤，通过三磷酸键连接帽子结构保护免受核酸酶降解，并参与核质转运和翻译起始mRNA57-5-5mRNA剪接由剪接体介导，去除内含子并连接外显子剪接位点依赖保守序列，如剪接位点的和剪接位点的选择性剪接产生不同亚型5GU3AG mRNA尾部修饰3切割并加入多聚尾巴约个多聚尾影响稳定性、核质转运和翻译效率少数如组蛋白没有多聚尾A200A AmRNA mRNA mRNA A在真核生物中，初级转录产物前体需经过一系列加工修饰才能成为成熟的这些修饰过程主要发生在细胞核内，是从转录到翻译的重要环节mRNA mRNARNA选择性剪接是增加蛋白质多样性的重要机制，人类约的多外显子基因都存在选择性剪接现象研究表明，剪接异常与多种疾病相关，如某些神经退行性疾病和癌症95%蛋白质的翻译过程3420主要参与者翻译阶段氨基酸种类翻译主要参与者、和核糖体翻译全过程包括起始、延伸、终止和核糖体循蛋白质由种基本氨基酸组成mRNA tRNA20环翻译是将中的遗传信息转换为蛋白质序列的过程起始阶段，翻译起始因子识别上的起始密码子通常是，招募核糖体小亚基与mRNA mRNAAUG结合，随后大亚基加入形成完整核糖体mRNA在延伸阶段，根据密码子反密码子配对原则将特定氨基酸运送到核糖体位点，肽基转移酶催化肽键形成，核糖体移动一个密码子距离当遇到终tRNA-A止密码子、或时，释放因子结合并促使新合成的多肽链释放，完成翻译过程UAA UAGUGA遗传密码子的解析亮氨酸丝氨酸精氨酸缬氨酸等苏氨酸等甘氨酸等终止密码子单密码子氨基酸起始密码子蛋白质结构与功能一级结构1氨基酸的线性序列二级结构局部有规则结构螺旋和折叠αβ三级结构多肽链整体三维折叠四级结构多个多肽链的空间组合蛋白质的功能直接依赖于其特定的三维结构一级结构决定了蛋白质折叠的方式，通过氢键形成局部的二级结构，如螺旋和折叠进一步折叠形成具有特定αβ功能的结构域，最终多个亚基可能组装成具有协同作用的蛋白质复合物蛋白质结构研究方法包括射线晶体衍射、核磁共振和低温电子显微镜技术随着等人工智能技术的发展，蛋白质结构预测准确度大幅提高，为理X AlphaFold解蛋白质功能和药物设计提供了新工具蛋白质的加工与修饰蛋白质切割许多蛋白质初始合成为前体蛋白或前体多肽，需通过蛋白酶切割才能获得活性例如，胰岛素先合成为单链前胰岛素，经过切除肽后形成有活性的双链结构C糖基化修饰在特定氨基酸残基通常是天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸上添加糖基糖基化影响蛋白质折叠、稳定性和受体识别，是膜蛋白和分泌蛋白的常见修饰磷酸化修饰蛋白激酶催化将磷酸基团添加到丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基磷酸化是可逆的，由磷酸酶催化去磷酸化，是调节蛋白质活性的重要机制分子伴侣辅助折叠分子伴侣如热休克蛋白帮助新合成的多肽正确折叠，防止错误折叠和聚集它们在HSP细胞应激条件下尤为重要，维持蛋白质稳态翻译后修饰极大地扩展了蛋白质组的多样性和功能复杂性人类基因组约个基因可产生20,000数十万种功能不同的蛋白质，这在很大程度上归功于丰富多样的翻译后修饰基因表达的调控层级翻译后调控蛋白修饰、降解、定位翻译水平调控2翻译起始、延伸速率调节转录后调控剪接、稳定性控制RNA转录水平调控4转录因子、增强子活性表观遗传调控5甲基化、组蛋白修饰DNA基因表达调控是一个多层次、高度协调的过程，从染色质状态到蛋白质功能的每个环节都有精密的调控机制表观遗传调控包括甲基化和组蛋白修饰，能改变染色质结构而DNA不改变序列，影响基因的可及性DNA转录水平调控主要通过转录因子与启动子和增强子的相互作用实现转录后调控包括剪接、稳定性和干扰等机制翻译水平和翻译后的调控使细胞能够快速响应环RNARNARNA境变化，实现基因表达的时空特异性非编码的调控作用RNA小干扰microRNA miRNARNA siRNA长度约个核苷酸的单链分子，通过与靶的双链分子，长度通常为个核苷酸，与类22RNAmRNARNA21-23miRNA部分互补配对，抑制翻译或促进降解似但来源不同，主要通过完全配对靶引起其降解3UTR mRNAmRNA生物合成过程干扰机制RNA RNAi聚合酶转录初级将长双链切割为

1.RNA IImiRNA pri-miRNA

1.Dicer RNA siRNA酶将加工为前体被整合入诱导的沉默复合物

2.Drosha pri-miRNA miRNApre-miRNA

2.siRNA RNARISC将从核内转运到细胞质中的蛋白切割与配对的靶

3.Exportin-5pre-miRNA

3.RISC ArgonautesiRNA mRNA酶剪切形成成熟靶被降解，阻断蛋白质合成

4.Dicer pre-miRNA miRNA

4.mRNA非编码在基因表达调控网络中发挥着重要作用据估计，人类基因组编码的可调控约的蛋白质编码基因RNA miRNA60%与多种生理过程和疾病相关，如细胞增殖、分化、凋亡和癌症发生miRNA干扰技术已成为研究基因功能的强大工具，通过人工合成的特异性抑制目标基因表达此外，基于原理的药物已RNAsiRNA RNAi用于治疗某些疾病，如转甲状腺素蛋白淀粉样变性多发性神经病操纵子模型（以乳糖操纵子为例）抑制状态诱导状态1无乳糖时，阻遏蛋白结合于操作子，阻止乳糖存在时，与阻遏蛋白结合使其构象改变，聚合酶转录2脱离操作子RNA酶合成4转录激活3产生半乳糖苷酶等酶，用于乳糖代谢聚合酶结合启动子，转录结构基因β-RNA操纵子模型由雅各布和莫诺于年提出，是理解原核生物基因表达调控的经典模型乳糖操纵子包含三个结构基因、和，以及调控元1961lacZ lacYlacA件启动子、操作子和调节基因lacI乳糖操纵子的调控体现了负调控机制当环境中无乳糖时，阻遏蛋白结合于操作子，阻止转录；有乳糖时，乳糖与阻遏蛋白结合，使其构象改变而无法与操作子结合，从而解除抑制此外，葡萄糖缺乏时，环腺苷酸水平升高，复合物结合到位点，促进聚合酶结合，形成正调cAMP cAMP-CAP CAPRNA控哺乳动物基因调控的复杂性染色质结构层面远程调控元件转录因子网络真核生物基因表达首先受染与原核生物不同，哺乳动物数百种转录因子以组合方式色质开放状态的影响增强子可位于距基因数十万共同调控基因表达转录因甲基化、组蛋白乙酰碱基远的位置通过染色质子可能互相竞争结合位点，DNA化、甲基化等修饰决定基因环化，远程增强子与靶基因或形成复合物协同作用，构是否可被转录染色质重塑启动子形成物理接触，调控成复杂的调控网络复合物可改变核小体排列，转录活性影响的可及性DNA哺乳动物基因调控的一个重要特征是三维染色体构象的参与高分辨率染色质构象捕获技术揭示了基因组在细胞核内的复杂三维组织，包括拓扑相关结构域和染色质Hi-C TAD环这些结构为远程调控元件与靶基因的相互作用提供了物理基础此外，组织特异性转录因子在细胞命运决定和维持中起关键作用例如，可诱导成MyoD肌分化，而、和构成维持多能性的核心转录网络这些机制共同确保了Oct4Sox2Nanog基因在正确的时间、正确的细胞类型中以适当水平表达信号转导与基因调控信号接收细胞表面受体或细胞内受体识别并结合配体信号传递通过蛋白激酶级联反应、第二信使等途径传递信号转录因子激活信号通路的终点常为转录因子的活化或抑制基因表达改变转录因子结合特定序列，调控基因转录水平DNA信号转导与基因表达调控紧密相连，是细胞响应环境变化的重要机制以激素受体为例，类固醇激素等脂溶性激素可透过细胞膜，与细胞质或核内的受体结合激素受体复合物直接作为转录因子调控-靶基因表达，如雌激素受体结合雌激素响应元件膜受体介导的信号转导则更为复杂，如受体酪氨酸激酶、蛋白偶联受体等RTK GGPCR MAPK级联反应是典型的信号传导路径，从细胞膜到细胞核，通过一系列磷酸化事件最终激活转录因子如、等信号通路的异常与多种疾病特别是癌症密切相关AP-1Elk-1复制、转录、翻译的时空协调核质分隔与调控细胞周期与协调空间定位与局部翻译mRNA•复制和转录在细胞核内进行•复制限制在期进行•某些可定位到特定细胞区域DNA DNAS mRNA•翻译主要在细胞质中进行•转录在整个间期都可发生•局部翻译增强蛋白质功能效率•核膜孔复合体控制和蛋白质的核质转运•细胞分裂期转录活性大幅降低•神经元树突中的局部蛋白质合成对突触可塑性RNA重要•核糖体蛋白合成于核仁，组装成熟后输出到细•检查点机制确保复制完整性DNA胞质•定位信号通常位于区域mRNA3UTR真核细胞中，核膜将复制和转录过程与翻译过程在空间上分隔，形成重要的调控机制核质分隔使转录产物经过多重加工和质量控制后才能进入翻译过程，同时也允许不同调控机制作用于基因表达的不同阶段在时间上，细胞周期各阶段的基因表达模式也存在明显差异例如，组蛋白基因在期高水平表达以满足新合成染色质的需求；有丝分裂周期蛋白的周期性表达和降解驱动S了细胞周期的进展这种时空协调确保了细胞过程的有序进行，维持了细胞的正常功能组学技术与大数据基因组学转录组学蛋白组学研究生物体全部遗传物质的结构和功能技术包研究特定细胞或组织在特定时间点表达的全部研究生物体内全部蛋白质的表达、结构和相互作括高通量测序、基因芯片、全基因组关联研究和单细胞转录组测序可提供基用质谱技术是蛋白质鉴定和定量的核心方法RNARNA-Seq等人类基因组计划解析了全部亿个因表达谱的全景图，揭示不同条件下基因表达的蛋白质相互作用网络分析揭示了复杂的细胞信号GWAS30碱基对序列，为疾病研究提供了基础动态变化和细胞异质性和调控机制组学技术的发展与大数据分析方法的进步相辅相成，极大地推动了生命科学研究高通量测序成本的下降使得个体化基因组分析成为可能，助力精准医疗的发展生物信息学、人工智能和云计算等计算技术在海量生物数据分析中发挥关键作用多组学数据的整合是当前研究热点，通过结合基因组、转录组、蛋白组、代谢组等多层次信息，可更全面地理解生物系统的复杂性和疾病机制，为药物研发和疾病治疗提供新思路分子生物学常用实验方法总览核酸技术蛋白质技术细胞技术•提取和纯化•蛋白质提取与定量•细胞培养与转染DNA/RNA•聚合酶链式反应•电泳•免疫荧光染色PCR SDS-PAGE•核酸电泳与可视化•印迹•流式细胞术Western•测序和基因克隆•免疫沉淀和质谱分析•细胞分选和单细胞分析DNA•核酸杂交•和蛋白质芯片•基因编辑Southern/Northern ELISACRISPR分子生物学实验方法的进步极大地推动了生命科学研究的发展从传统的核酸和蛋白质分析技术到现代高通量组学技术，这些方法使科学家能够从分子水平理解生命现象和疾病机制技术原理及应用PCR变性°高温使双链解开，形成单链这一步骤通常持续秒左右，高温破坏94-98C DNA30分子间的氢键，但不影响磷酸二酯键DNA退火温度降至°，允许引物与模板互补区域结合退火温度取决于引物长50-65C DNA度、含量和特异性要求，通常比引物值低约°GC Tm5C延伸温度升至°，耐热聚合酶如聚合酶从引物端开始合成互补链72CDNATaq3延伸速率约为每分钟个核苷酸，延伸时间取决于目标片段长度1000聚合酶链式反应是由于年发明的革命性技术，能在体外指数级扩增PCRKary Mullis1983特定片段一个标准反应包含模板、一对特异性引物、、耐热聚DNA PCRDNA dNTPsDNA合酶和适当的缓冲液经过个循环，目标片段可被扩增数十亿倍25-40DNA技术应用广泛，包括基因克隆、遗传分析、病原体检测、法医鉴定和分子诊断等领域PCR变种技术如反转录、巢式、多重和数字等进一步拓展了其应用PCRRT-PCR PCR PCR PCR范围的发明被认为是分子生物学领域最重要的技术突破之一PCR实时定量（）PCR qPCR原理数据分析实时定量结合了扩增和荧光检测技术，能在反应进行基于阈值循环数值分析值与初始模板量成反比主要定量方法PCRqPCR PCRCtCt的同时监测扩增产物的积累通过测量荧光信号强度的变化，可包括DNA计算出初始模板的量，实现对核酸的精确定量•绝对定量基于标准曲线检测方法•相对定量基于法，利用内参基因校正ΔΔCt主要有两种数据分析需考虑效率、基线设置、阈值设定等因素，确保结果准确PCR可靠熔解曲线分析可用于评估产物特异性•非特异性染料法如，结合双链后荧光增强SYBR GreenDNA•特异性探针法如探针，基于荧光共振能量转移原理TaqMan已成为基因表达研究、病原体检测和基因拷贝数变异分析的金标准方法在基因表达研究中，通常使用反转录实时定量，先qPCR PCRRT-qPCR将反转录为，再进行分析与传统相比，具有更高的灵敏度、特异性和更宽的线性范围RNA cDNAqPCR PCR qPCR数字是的进一步发展，将反应混合物分成数千个独立反应单元，每个单元要么含有一个靶分子，要么不含通过计算阳性反应的PCRdPCR qPCR比例，可实现更精确的绝对定量，特别适用于稀有变异检测和低丰度样本分析测序技术DNA第一代测序第三代测序1977-2010-测序法，基于链终止原理，使用荧光标记的双脱氧核苷酸人类基因组计划主要使单分子实时测序，如和技术提供更长读长，解决复杂重复序Sanger PacBioOxford Nanopore用此技术，耗时年，耗资亿美元列问题，无需扩增1330PCR123第二代测序2005-高通量测序，如测序，基于边合成边测序原理大幅降低成本和提高通量，应用Illumina于全基因组和转录组分析测序技术的发展极大推动了基因组学研究第一代测序法虽读长较长，但通量低，成本高第二代高通量测序技术虽读长较短，但大大提高了测序通DNA Sanger700-900bp75-300bp量并降低成本，使得个人基因组测序成为可能，目前主导临床和科研应用第三代长读长测序技术能产生数千至数十万碱基的读长，有助于解决复杂基因组组装和结构变异检测的难题近年来，测序成本持续下降，从完成首个人类基因组的亿美元降至如今的不到30美元，推动了基因组学在医学研究、个体化医疗和农业育种等领域的广泛应用

1000、、杂交分析Southern NorthernWestern分析方法检测对象基本步骤应用领域杂交酶切凝胶电泳分离转膜基因鉴定、分析、基因结构研究Southern DNA

1.DNA

2.

3.RFLP杂交标记探针洗脱和显影

4.

5.杂交提取变性电泳转膜基因表达分析、大小测定、剪接研Northern RNA

1.RNA

2.

3.

4.RNA杂交标记探针洗脱和显影究

5.杂交蛋白质蛋白质提取电泳蛋白表达、翻译后修饰、蛋白质量分析Western

1.

2.SDS-PAGE

3.转膜抗体孵育显色或化学发光

4.

5.检测这三种杂交技术都基于分子识别原理，利用特异性结合检测目标分子杂交年由发明利用核酸互补配对原理，使用标记的核酸探针检测特定Southern1975Edward Southern序列杂交借鉴方法检测，特别是用于分析基因表达DNA NorthernSouthern RNA杂交则利用抗原抗体特异性结合检测蛋白质，通常使用一抗和标记的二抗两步法提高灵敏度随着新技术如、、高通量测序和质谱的发展，这些传统杂交技Western-PCRqPCR术的使用减少，但其基本原理和方法仍是分子生物学的重要基础基因克隆基础流程目的基因制备通过扩增、酶切或化学合成获取目的基因可从基因组或中扩增特定片段，引PCRPCRDNA cDNA物设计通常含酶切位点酶切与纯化DNA使用限制性内切酶处理目的基因和载体，产生互补的粘性末端通过凝胶电泳和胶回收纯化酶DNA切产物，去除酶和小片段连接反应连接酶催化目的基因与载体之间的连接，形成重组质粒此过程在特定温度和缓冲液中进T4DNA行，通常需要几小时转化与筛选将重组质粒导入感受态细菌，通过抗生素筛选获得转化子通过、酶切或测序验证克隆的正确PCR性基因克隆是将目的基因片段插入载体并在宿主细胞中扩增的过程，是基因工程的基础技术现代克隆技术还包括无缝克隆、组装和克隆等，这些方法可以实现多片段一步连接，提高克隆效率Gibson Golden Gate表达载体包含启动子、多克隆位点、筛选标记和复制起点等元件根据实验目的，可选择含有不同标签如、His、等的载体，便于后续蛋白质纯化或检测基因克隆广泛应用于基因功能研究、蛋白质表达、疫苗开发和GST GFP基因治疗等领域质粒与载体的种类克隆载体主要用于片段的克隆和扩增，通常具有较高的拷贝数典型例子包括系列和，DNA pUCpBluescript它们含有蓝白筛选系统，便于识别重组克隆因其小巧的分子量和高拷贝数pUC18/

192.7kb拷贝细胞而广泛使用500-700/表达载体用于蛋白质表达，含有强启动子如或大肠杆菌表达载体如系列能在诱导下高效表T7CMV pETIPTG达蛋白真核表达载体通常含有细胞类型特异的启动子和增强子，如系列用于哺乳动物细胞表pcDNA达穿梭载体能在不同宿主中复制和表达的载体，通常含有多个复制起点酵母人工染色体、细菌人工YACBAC染色体和人工染色体可克隆大片段，用于基因组研究和大基因克隆PACP1DNA50-300kb病毒载体基于病毒改造的载体，用于高效基因转导腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体广泛用于基因治疗AAV和基因功能研究病毒载体通常具有较高的转导效率但克隆容量有限载体选择应考虑多种因素，包括插入片段大小、宿主类型、表达需求和下游应用现代合成生物学技术使载体设计更加灵活，能根据特定需求进行定制，如加入诱导系统、荧光报告基因或多种标签选择转化与转染方法细菌转化方法真核细胞转染方法化学转化脂质体转染₂处理制备感受态细胞•阳离子脂质体与带负电的形成复合物

1.CaCl DNA与感受态细胞冰浴孵育•通过内吞作用进入细胞

2.DNA热激°，秒促进进入•转染效率中等，毒性较低

3.42C30-90DNA冰浴回复后加入培养基培养

4.其他转染方法电转化•钙磷酸共沉淀简便经济，但细胞类型限制•利用高压电脉冲在细胞膜形成瞬时孔•电转染适用于难转染细胞，但可能影响细胞活力1500-2500V•转化效率高，适用于大片段•显微注射精确但费时，常用于受精卵DNA•对盐离子敏感，需使用低导电率缓冲液•病毒转导高效但需病毒包装和安全设施转化和转染效率受多种因素影响，包括纯度和浓度、细胞状态、转化转染试剂和操作条件等高质量质粒通常具有更高的转染效率，细胞密度DNA/和生长状态也是关键因素瞬时转染适用于短期基因表达，而稳定转染则通过筛选标记整合入基因组，实现长期表达新型转染技术如纳米颗粒载体、生物医用高分子和物理方法如声波穿孔不断发展，提高了转染效率并扩大了适用细胞范围分子杂交与探针探针类型标记方法杂交应用•探针单链，通过碱基互补配对识•放射性标记等同位素，灵敏度高•原位杂交检测细胞或组织中的特定核酸DNA DNA³²P,³⁵S ISH别目标•非放射性标记生物素、地高辛，结合特异蛋•荧光原位杂交染色体定位和结构分析FISH•RNA探针通常由体外转录产生，结合更稳定白检测•微阵列杂交高通量基因表达和遗传变异分析•肽核酸PNA探针具有更高特异性和稳定性•荧光标记FITC、Cy

3、Cy5等荧光染料，•液相杂交如分子信标技术，用于实时检测可多重检测•寡核苷酸探针短而特异，适合单核苷酸多态性检测•化学发光标记与酶偶联，产生光信号探针设计是分子杂交成功的关键理想的探针应具有高特异性、适当长度和适宜的含量通常探针特异性可通过等生物信息学工具进行评估，避免与GC40-60%BLAST非靶序列的交叉反应杂交条件如温度、盐浓度和变性剂浓度影响杂交效率和特异性，需进行优化基因工程的基本流程目的基因获取1从基因组或文库中分离目的基因；或通过、化学合成DNA cDNAPCR等方法获取现代基因合成技术可定制长达数千碱基的片段，无DNA需模板2载体构建将目的基因克隆入适当载体，构建重组分子设计合理的表达盒，DNA包含启动子、终止子和调控元件，确保目的基因在宿主中高效表达宿主转化将重组载体导入适当宿主细胞细菌、酵母、动物或植物细胞根据实验目的选择合适宿主系统，平衡表达量、翻译后修饰和经济性考虑筛选与鉴定通过抗生素筛选、分子生物学方法或功能检测鉴定阳性转化体对重组体进行测序确认，并通过表达分析验证基因功能表达与分析诱导目的基因表达，检测表达产物，并进行功能分析优化表达条件温度、诱导剂浓度、培养时间等提高产量和活性基因工程技术已从传统克隆发展到高通量合成生物学平台，能快速构建和筛选大量基因元件组合新技术如组装、组装和基因编辑极GoldenGateGibson CRISPR大地提高了基因工程的效率和精确性限制性内切酶与连接酶23600+酶切末端类型限制酶类型已知限制酶限制酶产生粘性末端或平末端型、型和型限制酶发现自不同细菌种类I II III限制性内切酶特点连接酶功能DNA限制性内切酶是细菌和古细菌中的防御系统，能特异识别并切割序列连接酶催化片段之间磷酸二酯键的形成，是复制和修复的关DNA DNA DNADNA根据识别位点、切割位置和辅因子需求分为型、型和型，其中型最常用键酶在分子克隆中，连接酶最为常用，源自噬菌体IIIIII IIT4DNA T4于分子克隆连接酶特点T4DNA型限制酶特点II•能连接粘性末端和平末端•识别的特定序列，通常为回文序列4-8bp•需要作为能量来源ATP•在识别位点内部或附近切割•最适温度为°粘性末端或室温平末端16C•产生粘性末端如或平末端如EcoRISmaI•连接效率受浓度、末端互补性影响DNA•酶活性受温度、值、离子强度影响pH限制酶和连接酶的发现和应用是现代基因工程的基础近年来，随着合成生物学的发展，出现了更多精确操作工具，如Ⅲ型限制酶可产生非回文识别位DNA点、核酸酶如和无缝克隆技术等，提供了更多基因操作的可能性Cas9外源基因导入动物细胞微注射法•直接将DNA注入受精卵原核•操作精确但技术要求高•常用于制备转基因小鼠•插入效率约10-30%电穿孔法•电脉冲在细胞膜形成瞬时孔•适用于多种细胞类型•可处理大量细胞•可能影响细胞活力病毒载体法•利用病毒感染机制导入基因•转导效率高，可达80-90%•可实现稳定整合或瞬时表达•克隆容量和安全性需考虑基因敲入与敲除•基于同源重组的精确基因编辑•CRISPR/Cas9系统大幅提高效率•可创建基因突变或插入报告基因•广泛用于功能基因组学研究基因转移技术使外源基因能在动物细胞中表达，为基因功能研究和基因治疗奠定基础根据基因整合方式，可分为稳定转染和瞬时转染稳定转染中，外源基因整合到宿主基因组，在连续传代中持续表达；瞬时转染则不整合，表达通常维持数天基因编辑技术的进步，特别是系统的应用，极大提高了基因修饰的精确性和效率通过设计特定的向导，可实现基因的定点敲除、CRISPR/Cas9RNA敲入或突变，为疾病模型构建和基因功能研究提供强大工具植物基因工程方法农杆菌介导法利用农杆菌主要是根癌农杆菌的质粒将外源导入植物细胞质粒上的区域可被修饰为携带目的基因，通过农杆菌的自然感染机制转移到植物基因组此方法广泛用A.tumefaciens TiDNA TiT-DNA于双子叶植物转化基因枪法将包被在微小金或钨颗粒上，通过高压气体或电击将颗粒加速射入植物组织这种物理方法不受宿主限制，适用于单子叶植物如水稻、玉米和难以用农杆菌转化的物种缺点是转化效率较低，DNA可能导致多拷贝整合原生质体转化去除细胞壁获得原生质体后，通过电穿孔或处理导入这种方法便于实验室操作和筛选，但再生完整植株困难，主要用于瞬时表达和基础研究PEG DNA植物基因工程面临独特挑战，如细胞壁屏障、组织再生难度和基因沉默现象植物再生通常依赖体细胞胚胎发生或器官发生，需要优化的激素组合和培养条件筛选常使用抗生素如卡那霉素或除草剂如草丁膦抗性标记成功的植物转基因体系需要高效的基因导入方法、适合的选择标记、有效的植株再生途径和稳定的基因表达近年来，基因编辑技术特别是系统在植物中的应用取得显著进展，提供了更精确的基因修饰手段CRISPR/Cas9转基因动物的实例绿色荧光蛋白小鼠疾病模型小鼠经济价值转基因动物GFP表达海来源的，全身组织在紫外光携带人类疾病相关基因突变或缺失，模拟人类疾转基因猪表达人类调控蛋白，降低器官移植排斥jellyfish GFP下呈现绿色荧光这种小鼠可用于细胞追踪、发病表型如转基因小鼠阿尔茨海默病反应；转基因奶牛产奶中含人类乳铁蛋白或其他APP/PS1育研究和组织移植实验通过组织特异性启动子模型、小鼠杜氏肌营养不良模型和生物药物；转基因鱼表达生长激素基因，生长速mdxob/ob调控表达，可标记特定细胞类型或在特定发小鼠肥胖和糖尿病模型这些模型用于研究疾度增加这些动物具有显著的经济和医疗价值GFP育阶段表达病机制和药物筛选转基因动物的创建方法从最初的前核注射发展到现在的基因编辑技术，效率和精确性大幅提高技术使多基因同时编辑和精确基因修饰成CRISPR/Cas9为可能，加速了转基因动物模型的建立转基因动物的应用涉及基础研究、医学研究、生物药物生产和农业生产等多个领域随着技术进步和伦理讨论的深入，转基因动物在研究和应用方面的潜力将进一步发挥，同时需要严格的监管和伦理考量确保安全和负责任使用基因编辑技术CRISPR-CasCRISPR-Cas9TALEN ZFN基因治疗的进展单基因遗传病治疗单基因疾病如地中海贫血、重症联合免疫缺陷症和脊髓性肌萎缩症是基因治疗的首β-SCID SMA选目标通过基因替代、基因修饰或基因抑制策略恢复基因功能已批准产品包括用于的SMA和治疗遗传性视网膜营养不良的Zolgensma Luxturna癌症基因治疗细胞疗法是癌症基因治疗的突破，通过基因修饰细胞表达嵌合抗原受体识别并攻CAR-T TCAR击肿瘤细胞和等产品已获批用于治疗特定白血病和淋巴瘤其他策Kymriah YescartaCAR-T略包括肿瘤溶解病毒和肿瘤抑制基因修复递送系统优化基因递送系统是基因治疗的关键挑战病毒载体腺病毒、慢病毒和具有高转导效率但AAV有免疫原性和包装容量限制非病毒系统如脂质纳米颗粒用于疫苗、聚合物和纳米mRNA材料提供了替代选择体外基因编辑结合自体细胞移植规避了部分体内递送问题基因治疗领域近年取得重大进展，从概念验证阶段过渡到临床应用截至年，全球已有多款基因治2023疗产品获批上市，治疗范围从稀有遗传病到血液系统恶性肿瘤随着等基因编辑技术成熟，治疗CRISPR策略从基因替代扩展到精确基因修饰尽管取得进展，基因治疗仍面临多重挑战，包括免疫反应、脱靶效应、长期安全性和极高治疗成本针对复杂多基因疾病的基因治疗策略仍处于早期研究阶段随着技术进步和监管经验积累，基因治疗有望成为更多疾病的常规治疗选择干扰与疾病研究RNA病毒感染癌症靶向病毒基因组或必需转录本，抑制病毒siRNA通过抑制致癌基因表达或恢复抑癌基因功siRNA复制研究显示针对、乙肝病毒和流感HIV-1能研究靶点包括、和等KRAS VEGFBcl-2病毒的治疗潜力挑战包括靶点保守性和siRNA联合化疗可减少药物抵抗，提高疗效递送系统设计神经退行性疾病眼部疾病针对亨廷顿舞蹈症、帕金森病等疾病相关的异常眼球作为相对封闭系统，适合局部递送siRNA蛋白基因如已获Onpattropatisiran FDA针对血管内皮生长因子的用于治VEGF siRNA批准治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性多发性神经疗湿性黄斑变性，减少异常血管生成病干扰是一种序列特异性的基因沉默机制，通过小干扰或微降解靶或抑制其翻译自年RNARNAiRNAsiRNA RNAmiRNAmRNA1998和发现机制以来，该技术已成为基因功能研究和疾病治疗的重要工具Fire MelloRNAi药物开发面临递送挑战，需克服血清核酸酶降解、肾脏清除和细胞摄取障碍脂质纳米颗粒、共轭物如乙酰半乳糖胺共轭和外泌体RNAiN-等递送系统不断改进化学修饰如甲基化和修饰可增强稳定性随着递送技术的创新，疗法有望在更多疾病领域取得2-O-2-F siRNARNAi突破体外表达与蛋白工程大肠杆菌表达系统酵母表达系统优势生长快速、成本低、遗传背景清晰、操作简便、产量高系统使用启动优势真核生物系统，能进行基本翻译后修饰，分泌效率高，培养条件简单且成本适pET T7子，诱导表达，产量可达总蛋白以上中毕赤酵母使用甲醇诱导子实现高效表达IPTG30%局限不能进行复杂的翻译后修饰，蛋白质可能形成包涵体，需复性处理主要用于简局限糖基化模式与人不同，某些高级修饰缺失广泛应用于疫苗如疫苗和工业HPV单蛋白质、抗原和酶的生产酶生产哺乳动物细胞表达系统其他表达系统优势翻译后修饰最接近人源蛋白，适合复杂蛋白质和抗体生产细胞和昆虫细胞杆状病毒系统适合膜蛋白表达；植物表达系统生产成本低，适合大规模CHO细胞是最常用的宿主细胞系生产；无细胞表达系统快速产生小量蛋白，特别适合有毒蛋白HEK293局限成本高，培养周期长，产量相对较低是单抗和复杂治疗性蛋白如凝血因子的主要生产系统蛋白工程通过分子进化或理性设计改变蛋白质结构和功能定点突变、结构域融合、定向进化和计算机辅助设计等技术广泛应用于酶工程、抗体工程和生物传感器开发重组蛋白药物已成为生物制药的重要组成部分，包括胰岛素、生长激素、干扰素、红细胞生成素和单克隆抗体等选择适当的表达系统对产品质量和生产效益至关重要随着基因编辑和合成生物学技术的发展，蛋白表达系统正向更高效、更精确的方向发展单克隆抗体技术免疫小鼠注射特定抗原刺激细胞产生抗体B细胞融合细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤B筛选与扩增分离单克隆杂交瘤细胞并大量培养抗体纯化从培养上清中分离纯化单克隆抗体单克隆抗体技术由科勒和米尔斯坦于年发明，基于细胞融合形成能持续产生特定抗体的杂交瘤细胞1975株传统技术使用小鼠免疫系统，但鼠源抗体在人体内可能引起免疫反应为克服这一问题，发展了嵌合抗体约人源、人源化抗体约人源和全人源抗体技术65%95%现代单抗技术通常结合抗体基因文库和噬菌体展示技术，或使用转基因小鼠产生全人源抗体单抗已成为重要的治疗工具，用于癌症如曲妥珠单抗治疗阳性乳腺癌、自身免疫性疾病如英夫利昔单抗治疗HER2类风湿关节炎和感染性疾病等随着抗体工程技术发展，双特异性抗体、抗体药物偶联物和单域抗体等-新型抗体药物不断涌现分子诊断技术在临床中的应用遗传病检测无创产前诊断癌症早期筛查基于、测序和芯片技术的遗传病通过分析母体外周血中的胎儿游离循环肿瘤检测可识别PCR DNActDNA检测已广泛应用于单基因疾病如地中进行产前筛查，可检早期癌症信号，实现无创癌症筛查DNAcfDNA海贫血、囊性纤维化和杜氏肌营养不测三体综合征等染色体异常，准多组学技术结合液体活检和人工智能21良第二代测序技术使多基因测试和确率超过这种非侵入性方法分析，提高癌症早期发现率精确测99%全外显子组测序成为临床实践，帮助显著降低了传统羊水穿刺的风险定肿瘤基因突变，指导靶向治疗药物诊断复杂遗传病选择感染性疾病检测核酸扩增技术如、在病PCR LAMP原体检测中应用广泛新冠疫情期间，成为诊断金标准，而基RT-PCR于的和CRISPR SHERLOCK系统提供快速、便携的检DETECTR测选择分子诊断技术融合了分子生物学、医学检验和信息技术，实现疾病的早期诊断、精确分型和治疗监测随着技术进步，检测速度提高、成本降低，使基因检测逐渐成为常规医疗的一部分精准医疗模式下，分子诊断对个体化治疗方案制定至关重要如肿瘤基因分型指导靶向药物选择，药物代谢酶基因多态性检测预测药物反应未来，随着单细胞技术、微流控设备和人工智能的发展，分子诊断将更加精准、快速和普及转基因作物与食品安全主要转基因作物安全性评估全球种植的主要转基因作物包括转基因作物上市前需经过严格安全评估，包括•抗虫棉表达蛋白源自苏云金芽孢杆菌，抵抗鳞翅目害虫分子特性插入基因及其表达产物的特性Bt

1.如棉铃虫等同性分析与传统品种的营养成分比较

2.•抗除草剂大豆表达酶，对草甘膦除草剂耐受EPSPS毒理学评价急性和慢性毒性测试

3.•抗虫玉米表达多种蛋白，防治欧洲玉米螟等害虫Bt致敏性评估新蛋白的潜在致敏性

4.•抗病毒木瓜表达木瓜环斑病毒外壳蛋白基因，产生抗病毒免环境风险对生物多样性和生态系统的影响

5.疫转基因作物的发展始于年代，目前全球种植面积超过亿公顷主要种植国包括美国、巴西、阿根廷、加拿大和印度转基因技术

19901.9为农业带来显著好处，包括减少农药使用、提高作物产量和改善应对气候变化的能力新一代转基因作物注重营养品质改良，如富含胡β-萝卜素的黄金大米可帮助解决维生素缺乏问题A尽管科学研究支持转基因作物的安全性，公众接受度仍存在差异各国监管体系不同，欧盟采取较严格的预防性原则，而美国则基于实质等同性原则中国对转基因作物采取积极研究、谨慎推广、加强管理的政策，建立了严格的安全评价和标识制度合成生物学与未来前景人工生命系统最终目标是创造完全人工的生命形式1全基因组合成设计并合成完整基因组代谢通路工程3设计人工代谢网络生产有用化合物基因线路设计构建具有逻辑功能的基因调控网络标准生物元件开发模块化、可重复使用的部件DNA合成生物学是一门融合生物学、工程学和计算机科学的新兴学科，旨在设计和构建具有新功能的生物系统该领域采用设计构建测试学习的工程循环，通过模块化、标准化和理性---设计原则，创造不存在于自然界的生物功能合成生物学已取得多项重要进展，如完成细菌最小基因组设计、合成酵母染色体计划、开发药物前体生物合成途径等未来应用前景包括生物燃料生产、环境污染治理、生物传感器开发和生物医学治疗等随着合成成本下降和计算工具发展，合成生物学将为解决能源、环境、医疗和材料等领域的挑战提供创新解决方案DNA分子生物学与人类健康罕见病研究精准医学实践新型治疗技术•全基因组和全外显子组测序帮助发现罕见病致•基因组学指导个体化治疗方案制定•基因治疗修复或替代缺陷基因病基因•药物基因组学预测药物反应和不良反应•干扰靶向抑制特定基因表达RNA•单基因遗传病机制研究为靶向治疗提供基础•肿瘤分子分型指导靶向药物选择•免疫治疗如细胞疗法靶向消灭癌细胞CAR-T•基因编辑技术为罕见遗传病提供潜在治疗方法•基因风险评估用于疾病预防和早期干预•基因编辑修复遗传突变CRISPR•模式生物和疾病模型加速病理机制研究和药物筛选分子生物学技术正深刻改变医学实践和人类健康管理方式从基因诊断到个体化治疗，从疾病预防到长期健康管理，分子层面的理解为医学带来革命性变化多组学技术的整合与人工智能分析方法结合，使疾病的早期检测和精确干预成为可能分子生物学与基因工程的伦理与社会问题基因编辑伦理争议基因隐私保护转基因监管与标识年首例基因编辑婴儿事件引发全球争议，突显随着基因检测的普及，个人基因数据保护成为重要议转基因生物的安全性评估和标识要求在全球各地存在2018了人类生殖细胞基因编辑的伦理界限问题科学界普题基因信息可能揭示健康风险、血缘关系和种族背差异美国采用实质等同性原则，仅当产品特性显遍认为，在技术安全性和伦理共识达成前，应暂停人景，若被滥用可能导致歧视和隐私侵犯各国正制定著不同时才要求特别标识欧盟则要求所有含转基因类生殖细胞系编辑然而，对治疗性体细胞基因编辑法规保护基因隐私，如美国《基因信息非歧视法》禁成分的食品明确标识，无论其是否在最终产品中检测的研究仍在积极推进止基于基因信息的保险和就业歧视到生物技术的快速发展与伦理、法律和社会框架的适应之间存在张力生物安全是重要关切，实验室生物安全等级划分和转基因生物环境释放评估等措施旨在防止潜在风险科学共同体需要与公众、政策制定者和伦理学家密切沟通，确保技术发展符合社会价值观和伦理准则中国在生物技术监管方面不断完善法律体系，包括《生物安全法》、《人类遗传资源管理条例》等，既支持科技创新，又确保负责任研究国际合作对建立全球生物技术治理框架至关重要，需平衡技术进步、风险管控与伦理考量课程总结与复习核心知识点回顾未来研究方向职业发展路径本课程系统介绍了分子生物学的基础理论和前沿技分子生物学与基因工程正向多个前沿方向发展单细分子生物学与基因工程专业知识为多个领域的职业发术从的基本结构到基因表达调控，从实验方胞组学技术将揭示细胞异质性；空间转录组学提供基展提供基础，包括学术研究、生物医药产业、农业生DNA法到应用技术，我们全面探讨了生命科学的分子基因表达的空间信息；多组学数据整合和人工智能分析物技术、法医鉴定和生物信息学等跨学科融合是当础课程强调了中心法则蛋白质的加速发现；基因编辑技术不断优化，向更高效率、更前趋势，例如生物医学工程、计算生物学和分子诊断DNA→RNA→核心地位，同时展示了现代研究对这一简化模型的丰高精度方向发展等领域的发展富和完善随着技术进步和知识积累，分子生物学与基因工程将继续拓展我们对生命本质的理解，并为解决人类面临的健康、环境和资源挑战提供创新解决方案学科边界日益模糊，与计算科学、材料科学、医学等领域的交叉融合将催生新的研究范式和应用领域希望通过本课程的学习，同学们不仅掌握了基本理论和技能，更培养了科学思维和创新意识在今后的学习和工作中，请保持对新知识的好奇心和对科学本质的尊重，将所学知识应用于解决实际问题，为科学进步和人类福祉做出贡献。