《分子生物学实验方法与技巧》课件

分子生物学实验方法与技巧欢迎来到分子生物学实验方法与技巧课程本课程将全面介绍分子生物学领域的核心实验技术、操作规范与实用技巧，从基础原理到高级应用，助您掌握现代生命科学研究的基本工具我们将系统讲解核酸提取、电泳技术、PCR扩增、基因克隆、测序技术、蛋白质分析以及新兴的基因编辑方法，帮助您建立完整的实验思路，提升实验设计能力与动手操作技能分子生物学实验的意义基础研究价值应用研究价值分子生物学实验是探索生命本质的核心工具，通过对分子生物学技术已成为医学诊断、药物研发、农业育种等领DNA、RNA和蛋白质等生物大分子的研究，揭示细胞内信域的关键支撑基因测序、PCR检测广泛应用于疾病诊断与息传递和表达的分子机制，构建生命科学理论基础预防；基因编辑技术正在改变传统育种模式这些实验方法使我们能够深入了解基因功能、调控网络与进化关系，为理解复杂生命现象提供分子层面的解释，推动基础理论创新分子生物学实验的基本流程样品准备分子分离扩增分析检测验证//从生物材料中获取完整性好的样提取并纯化目标分子（DNA、使用PCR等技术扩增目标片段或通过电泳、测序、免疫检测等方品，包括组织采集、细胞分离和RNA或蛋白质），去除杂质进行分子特性分析法验证结果保存常用试剂与耗材简介分子生物学实验室常用试剂包括多种缓冲液系统，如TAE、TBE用于电泳，PBS用于细胞实验各类酶是实验的核心工具，包括DNA聚合酶、限制性内切酶、连接酶等，它们执行特定的生化反应引物是PCR反应的关键组分，通常由合成公司定制；抗体则用于蛋白质检测和免疫实验实验耗材主要包括各种规格的离心管、PCR管、移液器吸头以及过滤装置等，这些看似简单的材料对实验结果有着重要影响分子实验室安全规范个人防护设备生物安全与废弃物处理实验室工作必须穿着专用实不同危险等级的生物材料需验服，不同区域工作不交叉在相应级别的生物安全柜中使用配戴适当的手套（乳操作实验废弃物必须分胶/丁腈），处理有害物质类含DNA/RNA材料、时使用护目镜和面罩离开细胞组织、电泳凝胶等需经实验区前必须脱除防护装灭活处理后专门收集，不可备，防止污染扩散混入普通垃圾化学与辐射安全样品采集与保存方法动物样本采集植物样本采集动物组织样本采集需遵循动物伦理规植物材料采集应选择健康且无污染的范，使用无菌工具快速切取，避免部位，避免衰老或病变组织叶片、RNA降解血液样本应立即添加抗凝茎和根等不同组织需分别处理样品剂，并在4°C保存运输活体取材应应立即置于液氮中速冻，或使用在麻醉状态下进行，最小化动物痛RNAlater等保护液处理，防止核酸苦降解微生物样本采集微生物样本需使用适当的选择性培养基，确保所获菌株纯度环境微生物样本应记录采集点精确信息厌氧菌需在无氧环境下采集和运输，避免接触空气导致死亡所有生物样本采集后应立即进行适当处理，长期保存推荐使用-80°C超低温冰箱对于RNA研究，应考虑使用RNA保护试剂，防止降解影响后续实验质量准确的标记和详细的样本信息记录对后续研究至关重要核酸提取的基本原理细胞裂解蛋白质去除使用物理或化学方法破坏细胞膜和核通过酚-氯仿提取或盐析方法沉淀并除膜结构，释放胞内核酸去蛋白质和其他杂质溶解与储存核酸沉淀将核酸沉淀溶解在适当缓冲液中，制利用酒精使核酸沉淀，分离出纯净的备成工作液DNA或RNADNA与RNA提取原理相似，但在操作细节上有显著差异RNA提取过程中需特别注意RNA酶的污染问题，使用DEPC水和RNA酶抑制剂DNA提取则强调避免机械剪切导致的DNA片段化现代提取技术多采用硅胶吸附原理，在高盐条件下核酸与硅胶表面结合，洗涤后用低盐或无盐溶液洗脱，实现高纯度分离手工与试剂盒提取核酸比较比较项目传统手工法商业试剂盒时间成本通常需4-6小时仅需30-90分钟材料成本试剂成本低每个样品成本高技能要求需较高实验技能简易操作，易于掌握产量范围可大量提取量程固定，批次少纯度稳定性操作者依赖性强结果稳定可重复特定样本适用性可灵活调整方案不易应对特殊样本手工提取核酸方法灵活性高，可根据样本特性调整参数，适合大批量样本处理和特殊样本类型但操作复杂，容易受实验者技巧影响，批次间差异大商业试剂盒操作简便，结果一致性好，节省时间，是日常实验的首选在科研项目中，常根据样本类型和研究目的灵活选择提取方法对于珍贵样本或需要特别高质量核酸的项目，两种方法结合使用可能获得最佳效果基因组提取实操技巧DNA样品前处理动物组织应迅速切成小块，植物样本需液氮研磨成粉末细胞培养物应PBS洗涤并离心收集样品体积与裂解液比例至关重要，通常为1:10，确保充分裂解裂解与蛋白去除使用含SDS的裂解缓冲液和蛋白酶K消化，时间足够长（通常4-16小时）蛋白去除可用酚-氯仿混合液提取，注意相分离时轻柔操作，避免DNA剪切沉淀与纯化DNA使用无水乙醇或异丙醇沉淀DNA，缓慢倾析上清，避免DNA丢失70%乙醇洗涤2-3次去除盐分悬浮时使用宽口吸头，轻柔操作防止DNA剪切获取高分子量DNA的关键是避免机械力导致的DNA片段化使用剪切的吸头尖端可减少管壁摩擦；避免剧烈震荡和反复冻融；洗脱时使用预热（50-60°C）的TE缓冲液能提高收率完整的高分子量DNA在电泳时应呈现清晰的高位条带，无拖尾现象总提取与处理RNA专用试剂与材料RNARNA提取需使用DEPC处理的水和无RNA酶的塑料制品，所有玻璃器皿须经DEPC水处理后高压灭菌TRIzol试剂是常用的裂解剂，含有异硫氰酸胍和酚，能有效灭活RNA酶，同时分离RNA、DNA和蛋白质完整性评估RNA真核生物RNA质量可通过28S和18S核糖体RNA条带比例评估，理想比例约为2:1琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪可用于RNA完整性检测RNA完整性数值RIN≥

8.0通常视为高质量，适合转录组测序污染清除DNA基因组DNA污染是RNA研究的常见问题，需使用RNase-free DNase I处理样品DNase处理后须彻底灭活酶活性，否则会影响后续实验对于需要长期保存的RNA样品，添加RNase抑制剂并分装成小体积保存，避免反复冻融核酸浓度与纯度测定260nm

1.8-

2.

02.0-

2.2核酸最大吸收波长理想比值理想比值A260/A280A260/A230DNA和RNA在260nm波长处有最大吸收，利纯DNA的A260/A280约为

1.8，纯RNA约为反映多糖、酚等有机物污染情况，理想值在

2.0-用此特性可进行核酸定量

2.0，低于此值表明存在蛋白质污染

2.2之间核酸定量方法主要有紫外分光光度法和荧光定量法两大类紫外分光光度法操作简便，但不能区分DNA、RNA与游离核苷酸，且易受杂质影响荧光定量法如Qubit系统采用特异性荧光染料，只与双链DNA或RNA结合，排除单链核酸和降解产物的干扰，测量结果更准确，特别适用于低浓度样品电泳法虽不能精确定量，但可通过与标准品比较大致估计浓度，同时提供分子量分布信息，是评价核酸质量的重要补充手段电泳技术的基本原理带电分子在电场中迁移1核酸分子带负电荷，在电场作用下向阳极移动凝胶网状结构产生阻力凝胶基质形成分子筛，大分子受阻力大，移动慢分子大小与迁移率成反比DNA片段大小与其迁移距离的对数呈线性关系琼脂糖凝胶电泳是分离DNA片段的常用方法，凝胶浓度决定了分离范围

0.8%适合分离大片段（1-10kb），2%适合小片段（

0.1-1kb）在适当浓度下，条带分辨率可达到10bp差异电压也是影响分离效果的关键因素，过高电压会导致条带弥散，一般控制在5V/cm琼脂糖凝胶电泳具有操作简便、成本低廉的特点，但分辨率有限对于要求更高的实验，可选择聚丙烯酰胺凝胶电泳，后者能分辨单碱基差异，但操作复杂且有毒性风险琼脂糖凝胶电泳操作DNA凝胶配置根据目标分子量选择凝胶浓度（

0.8%-2%），将称量好的琼脂糖溶于TAE或TBE缓冲液中，微波加热至完全溶解，冷却至约60℃后加入核酸染料（如EB或SYBR Safe），混匀后倒入电泳槽，插入梳子，室温凝固样品处理与加样DNA样品与6X加样缓冲液混合（体积比5:1），加样缓冲液含有甘油增加密度，使样品沉入凝胶孔中，同时含有示踪染料显示迁移前沿选择适当的DNA分子量标准品（Marker）与样品一起加载电泳条件设定将凝胶置于电泳槽中，加入与制胶相同的缓冲液，没过凝胶连接电源，一般设置80-120V恒压电泳（约5V/cm）电泳时间根据目标片段大小和凝胶浓度调整，通常观察示踪染料移动到凝胶2/3处为宜结果观察与记录电泳结束后，将凝胶置于紫外凝胶成像系统上观察通过比较样品条带与Marker位置确定目标片段大小拍照存档时应调整曝光时间，确保条带清晰可见但不过曝注意紫外灯对眼睛和皮肤的伤害，佩戴防护面罩变性电泳技术RNA预防控制RNase使用DEPC水和无RNase试剂二级结构变性RNA甲醛或甲酰胺处理打断RNA分子内氢键完整性评估通过28S/18S rRNA比例判断质量RNA分子容易形成复杂的二级结构，影响电泳迁移率，因此必须在变性条件下进行电泳甲醛变性凝胶是常用的RNA电泳方法，在制备过程中添加甲醛破坏RNA分子内的氢键所有器材必须无RNase污染，最好专门用于RNA实验甲醛凝胶配制需在通风橱中进行，避免甲醛挥发对健康的危害电泳前样品也需经热变性处理（65℃，5分钟）后立即冰浴，防止二级结构重新形成优质的总RNA在电泳后应显示清晰的28S和18S核糖体RNA条带，比例约为2:1，条带下方无明显拖尾聚丙烯酰胺凝胶电泳（）PAGE原理与特点类型与应用PAGE PAGE聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体和交联剂双丙烯酰胺在引发变性PAGE添加尿素或甲酰胺作为变性剂，常用于DNA测序剂作用下聚合形成，具有更细的网状结构，分辨率远高于琼和微卫星分析非变性PAGE保持核酸或蛋白质的天然状脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶浓度一般为5%-20%，可分辨5-态，适用于结构差异分析蛋白质SDS-PAGE是最常用的500bp的DNA片段，甚至单碱基差异蛋白质分离方法，基于分子量区分蛋白质PAGE电泳常用于小片段DNA分析、蛋白质分离、SNP检梯度PAGE凝胶在凝胶垂直方向上浓度不同，可在一次电泳测和DNA序列分析其优势在于高分辨率和可重现性，但中同时分离广泛分子量范围的样品毛细管电泳是PAGE的操作复杂，丙烯酰胺单体有毒，需要特别注意安全防护自动化版本，具有快速、高效和低样品消耗的特点的基本原理PCR退火（）50-65°C温度降低，引物与模板互补配对结合变性（）94-98°C高温使双链DNA分离成单链，为引物结合做准备延伸（）72°CDNA聚合酶从引物3端开始合成互补链聚合酶链式反应（PCR）是体外扩增特定DNA片段的强大技术，利用热稳定DNA聚合酶（如Taq酶）在循环温度变化条件下进行每个循环理论上使目标DNA片段数量加倍，30个循环可将单个分子扩增至10亿个副本，实现极高灵敏度PCR扩增的专一性取决于引物设计、退火温度和反应体系优化非特异性扩增（杂带）和引物二聚体是常见问题梯度PCR和热启动PCR等改良技术可显著提高特异性PCR的高灵敏度也意味着极易受到污染影响，需严格设置阴性对照和防污染措施引物设计原则PCR基本参数控制热力学特性优化引物长度通常控制在18-30个核苷酸，正反向引物的熔解温度Tm差值应小GC含量40%-60%，避免连续4个以上于5°C，一般在55-65°C范围内Tm相同碱基引物5端可添加限制性酶切值可通过公式估算位点、TAG标签等功能序列，但3端必Tm≈2×A+T+4×G+C引物末端应须完全匹配目标序列以确保扩增效率避免含AT碱基对，最好在3端有1-2个GC，以增强延伸起始的稳定性二级结构预防避免引物序列内部互补形成发夹结构；避免正反向引物间互补，特别是3端互补易形成引物二聚体使用在线软件（如Primer

3、IDT OligoAnalyzer）检测潜在的二级结构风险，△G值应大于-3kcal/mol引物特异性是PCR成功的关键，应使用BLAST等工具检查引物在全基因组范围内的唯一性对于GC含量极高的区域，可添加DMSO、甜菜碱等添加剂改善扩增效果对于SNP分型，可采用3末端特异性设计策略，使引物3端正好位于SNP位点常规操作流程PCR反应体系配制•在无菌PCR管中依次加入水、缓冲液、dNTPs、引物、模板和聚合酶•总体积通常为25-50μL，各组分浓度需精确控制•操作过程避免交叉污染，使用滤芯吸头热循环程序设置•初始变性94-98°C，2-5分钟，完全解开DNA双链•30-40个循环变性（94-98°C，15-30秒）→退火（根据引物Tm值设定，30秒）→延伸（72°C，每kb约30-60秒）•最终延伸72°C，5-10分钟，确保所有产物完全合成产物检测与分析•取5-10μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳•通过与Marker比对确认产物大小是否符合预期•根据条带亮度初步判断反应效率扩增产物分析PCR理想产物特征非特异性扩增问题负载控制与定量分析PCR成功的PCR反应应在电泳图上显示单多条带现象意味着引物在非靶序列上结使用内参基因作为负载控制是半定量

一、明亮的特异性条带，大小与设计一合，常见原因有退火温度过低、引物特PCR的常用策略，选择表达稳定的家居致条带清晰锐利，无明显拖尾，表明异性不足或模板复杂性过高解决方法基因如GAPDH或β-actin通过目的基产物均一性好，没有非特异性扩增背包括提高退火温度、使用梯度PCR找到因与内参基因条带亮度比值进行相对定景干净，无弥散状杂带和引物二聚体最优条件、优化引物设计或使用热启动量对于需要精确定量的实验，应考虑聚合酶减少非特异性扩增使用实时荧光定量PCR实时荧光定量（）PCR qPCR法原理探针法原理SYBR GreenTaqManSYBR Green是一种非特异性双链DNA荧光染料，能插入TaqMan探针是含有荧光报告基团和淬灭基团的特异性寡核到双链DNA分子中，与单链DNA或RNA几乎不结合结合苷酸，设计与目标序列互补完整探针因FRET效应，荧光双链DNA后荧光强度显著增强，通过检测每个循环后的荧被淬灭PCR延伸阶段，Taq酶5-3外切酶活性将结合的探光强度，实现对PCR产物的实时监测和定量针切断，释放报告基团，产生荧光信号SYBR Green方法优点是成本低、操作简便，可用于多种靶TaqMan探针法具有高特异性和灵敏度，可进行多重PCR标检测缺点是缺乏特异性，会结合所有双链DNA，包括检测，适合SNP分型缺点是成本高、设计复杂，每个靶标非特异性产物和引物二聚体使用熔解曲线分析可部分解决需特定探针探针的存在提高了反应的特异性，避免了非特特异性问题异性产物的干扰ΔΔCT方法是qPCR相对定量的经典算法，通过比较目标基因与内参基因的Ct值差异来计算表达变化此方法假设PCR效率接近100%，对于效率不理想的反应，需使用标准曲线法校正qPCR数据分析需注意实验设计和统计方法的选择，遵循MIQE指南确保结果可靠性逆转录（）PCR RT-PCR扩增与分析PCR反转录合成cDNA使用cDNA作为模板进行常规PCR或qPCR引物高质量制备RNA选择适当的反转录酶（如MMLV、AMV或设计应跨越内含子，以区分基因组DNA污染同提取总RNA后，使用DNaseI处理彻底去除基因SuperScript）和引物策略引物可使用时设置RT负对照（不加反转录酶）验证无基因组组DNA污染RNA纯度通过分光光度法评估，oligodT（富集mRNA）、随机引物（适合所有DNA干扰对于低丰度转录本，可能需要增加A260/A280比值应在

1.8-

2.0之间RNA完整性RNA）或基因特异性引物（提高特异性）反应PCR循环数或使用巏式PCR策略通过电泳或生物分析仪确认，RIN值≥8为佳，避免温度通常为37-50°C，时间20-60分钟，根据使用使用降解的RNA样品的酶和RNA量优化逆转录PCR是研究基因表达的关键技术，通过将RNA逆转录为cDNA后进行PCR扩增实现RT-qPCR结合了RT-PCR和实时荧光定量PCR，是当前基因表达定量分析的金标准方法，具有高灵敏度、宽线性范围和良好的重复性克隆技术概述DNA载体准备目的片段制备质粒环化与线性化处理PCR扩增或限制性酶切获取目的基因连接反应DNA连接酶催化片段与载体连接阳性克隆筛选转化细胞抗生素筛选与PCR验证将重组DNA导入宿主细胞DNA克隆是分子生物学的核心技术，通过将外源DNA片段插入载体并在宿主细胞中扩增，获得大量相同的DNA分子载体选择是克隆成功的关键，常用载体包括pUC系列、pBR

322、pET等，根据插入片段大小、表达需求和宿主细胞类型选择合适的载体系统连接反应通常采用T4DNA连接酶，最佳反应条件为16°C，4-16小时载体插入片段的摩尔比通常为1:3至1:5现代分子克隆技术已发展出如Gibson Assembly、In-Fusion等多种无缝克隆方法，提高了克隆效率和准确性限制性内切酶的使用酶切位点选择反应条件优化双酶切策略根据载体多克隆位点每种限制酶有其最适同时使用两种限制酶和目的基因序列特反应条件，包括缓冲可确保插入片段定向点，选择合适的限制液组成、温度、钎离克隆，降低自连风性内切酶理想的酶子需求等不同来源险双酶切时需考虑切位点应满足不在的酶在活性、稳定性两种酶的缓冲液兼容目的基因内部切割；和特异性上存在差性，若不兼容，需先能产生兼容的黏性末异星状活性（非特用一种酶切割，纯化端；位于载体功能元异性切割）是高浓度后再用第二种酶切件（如启动子、终止酶或非最佳条件下的割双酶切效率可通子）适当位置使用常见问题，应严格控过琼脂糖凝胶电泳验NEBcutter等在线工制反应条件完全酶证，应观察到单

一、具预测酶切位点切通常需要2-4小时清晰的条带质粒载体的构建细菌转化实验技巧化学感受态制备电转化技术化学感受态细胞通过CaCl₂处理制备，使细胞膜更容易接受电转化利用高压电脉冲使细胞膜瞬时形成微孔，允许DNA外来DNA具体步骤包括培养细菌至对数生长期（OD₆₀₀进入电转化细胞制备需去除所有盐离子对数期细菌用冰约

0.4-

0.6）；4°C冷却，CaCl₂溶液洗涤细胞；冰浴孵育冷无菌水反复洗涤；最终悬浮于10%甘油溶液；分装后液氮30分钟；离心收集细胞；悬浮于含15%甘油的CaCl₂溶液；速冻分装后液氮速冻，-80°C保存电转化操作需使用专用电击杯和电穿孔仪，标准条件为制备过程中温度控制至关重要，所有操作需在低温下进行

2.5kV，25μF，200ΩDNA样品必须无盐，否则会导致化学感受态细胞通常在热休克（42°C，90秒）条件下转电弧放电电转化效率可达10⁹-10¹⁰CFU/μg，远高于化学化，转化效率约10⁶-10⁷CFU/μg质粒DNA转化，特别适用于大片段质粒或难转化菌株转化效率的优化策略包括使用超螺旋质粒提高效率；控制DNA纯度，去除蛋白和盐；转化后立即添加预热的SOC培养基进行细胞恢复；避免多次冻融感受态细胞对于高效表达载体，应使用低拷贝策略避免宿主细胞负担过重菌落与重组体筛选PCR15-3090%平均筛选数量典型成功率常规克隆实验需筛选的菌落数量优化后实验的阳性克隆比例2-3验证方法数推荐使用的不同验证技术数量菌落PCR是快速筛选重组克隆的有效方法，无需提取质粒，直接以菌落为模板进行PCR反应操作流程包括用无菌牙签或吸头轻触单个菌落；将少量菌体转入含PCR反应液的管中；95°C初始变性时间延长至5-10分钟，充分裂解细胞释放DNA；随后进行常规PCR扩增引物设计策略通常有两种一是使用载体特异性引物，扩增包含插入片段的区域，通过产物大小判断是否含有目的片段；二是使用一个载体特异性引物和一个插入片段特异性引物，只有成功插入目的片段才能得到特定大小的PCR产物阳性克隆筛选后应进行质粒提取和酶切或测序验证，确认克隆正确性测序技术Sanger测序反应原理测序反应配制Sanger测序基于双脱氧链终止测序反应体系包含模板DNA法，在常规DNA聚合反应中加（200-500ng质粒或50-入少量带有荧光标记的双脱氧核100ng PCR产物）、测序引物苷酸（ddNTPs）当ddNTP（

3.2pmol）、测序试剂盒（含并入新合成链时，由于缺少3-DNA聚合酶、dNTPs、荧光标OH基团，DNA链延伸终止，产记ddNTPs和缓冲液）反应程生不同长度的DNA片段，每个序通常为25-30个循环96°C变片段末端标记特定碱基的荧光性10秒，50°C退火5秒，60°C团延伸4分钟数据解读与质量控制测序仪通过毛细管电泳分离不同长度的DNA片段，激光激发荧光团，检测器记录荧光信号，转换为碱基序列和色谱图高质量测序数据应有清晰、均匀的峰，无明显背景干扰序列质量分数Q20值反映碱基准确度，通常要求95%的碱基达到Q20标准二代高通量测序简介测序平台IlluminaIllumina采用边合成边测序技术，通过桥式PCR在芯片表面生成DNA簇，再用荧光标记的终止子进行循环测序每个循环添加四种带可切除荧光基团的核苷酸，通过成像检测荧光信号确定碱基类型，然后切除荧光团继续下一循环特点是读长短（75-300bp）但通量极高，每次运行可产生数百G数据技术PacBio SMRTPacBio的单分子实时测序技术在零模波导孔（ZMW）中观察单个DNA聚合酶的合成过程，通过荧光标记的核苷酸在掺入DNA链时释放的荧光信号确定碱基序列特点是读长极长（平均15-20kb，最长可达100kb），适合全基因组组装和结构变异分析，但准确率相对较低，需较高覆盖度牛津纳米孔技术纳米孔测序利用单链DNA通过蛋白质纳米孔时引起的电流变化识别碱基DNA分子通过孔道时，不同碱基阻碍离子流动的方式不同，产生特征性电信号，通过算法转换为碱基序列其特点是设备小巧便携，读长超长（可达2Mb），实时数据输出，但原始错误率较高适合现场快速测序和复杂区域解析提取与检测RNA miRNA特殊结构miRNA19-25nt短RNA，具有特殊稳定性专用提取方法改良TRIzol或硅胶柱保留小分子特异性检测技术茎环RT-PCR或微阵列分析miRNA提取需特别注意RNA分子大小的选择性保留普通RNA提取方法可能会丢失这些小分子RNA改良的TRIzol方法使用更高浓度的乙醇促进小RNA沉淀；专用的小RNA提取试剂盒通常含有优化的结合缓冲液，确保硅胶膜能捕获小至18nt的RNA分子miRNA检测的最大挑战是其短小长度和序列相似性茎环引物RT-PCR是常用的定量方法，通过特殊设计的茎环结构引物增加反转录特异性miRNA芯片和RNA-seq是高通量检测手段，适合miRNA表达谱分析北方印迹虽然灵敏度较低，但能直接检测天然miRNA，无需扩增步骤，是验证新miRNA的重要工具蛋白质提取与定量裂解缓冲液选择蛋白酶抑制剂应用蛋白质提取的关键是选择合适的裂解蛋白质提取必须添加蛋白酶抑制剂鸡缓冲液，根据蛋白质亚细胞定位和性尾酒，防止内源蛋白酶降解目标蛋白质确定RIPA缓冲液（含SDS、常用抑制剂包括PMSF（丝氨酸蛋白NP-

40、脱氧胆酸钠）适合大多数可酶抑制剂）、蛋白酶抑制剂混合物溶性蛋白；NP-40缓冲液温和，适合（含胃蛋白酶、胰蛋白酶等多种抑制免疫沉淀；超声裂解缓冲液适合核蛋剂）、磷酸酶抑制剂（研究磷酸化蛋白提取；尿素缓冲液（8M尿素）适白必需）抑制剂应现用现配，合提取难溶性蛋白质和包涵体PMSF在水溶液中半衰期仅约30分钟定量方法比较BCA法基于蛋白质与Cu²⁺反应产生Cu⁺，后者与BCA试剂形成紫色复合物，562nm处测吸光度优点是灵敏度高，兼容大多数去垢剂，缺点是受还原剂干扰Bradford法基于考马斯亮蓝G-250与蛋白结合后颜色从红变蓝，595nm处测吸光度优点是快速简便，缺点是线性范围窄且受SDS干扰蛋白质电泳与转膜样品变性处理SDS和β-巯基乙醇打断结构分离SDS-PAGE按分子量大小分离蛋白质蛋白质转膜电转印至PVDF或硝酸纤维素膜转膜验证Ponceau S染色检查效率SDS-PAGE是蛋白质分析的基础技术，通过SDS使蛋白质变性并带负电荷，主要按分子量大小分离常用浓缩胶（5%）和分离胶（8-15%）组合系统，分离胶浓度根据目标蛋白大小选择大蛋白（100kDa）选用8%；中等蛋白（30-100kDa）选用10-12%；小蛋白（30kDa）选用15%蛋白质转膜有湿转和半干转两种主要方式湿转使用完全浸没在转膜缓冲液中的系统，转移效率高，特别适合大分子量蛋白，但耗时长（1-2小时）半干转使用缓冲液浸泡的滤纸夹持膜和胶，转移快（15-30分钟），但对大蛋白效率较低转膜电流和时间需根据蛋白质大小和性质优化实验流程Western Blot信号检测与定量分析抗体孵育与洗涤化学发光底物与HRP反应产生光信号，通过X膜封闭处理一抗孵育通常在4°C过夜，浓度根据抗体效价射线胶片或CCD相机捕获增强型化学发光转膜完成后，使用5%脱脂奶粉或BSA溶液在确定（典型稀释1:500-1:2000）充分洗涤ECL试剂可显著提高检测灵敏度荧光标记常温下封闭1小时，减少非特异性结合封闭液（TBST缓冲液，3次×10分钟）后，使用HRP二抗系统提供更宽的线性动态范围，适合精确的选择取决于抗体特性，磷酸化蛋白抗体通常偶联的二抗室温孵育1小时（典型稀释1:5000-定量通过内参蛋白（β-actin、GAPDH）校推荐使用BSA，因为奶粉中可能含有磷酸化蛋1:10000）二次洗涤更为关键，TBST洗涤4-正样品间差异，实现相对定量分析专业图像白干扰信号封闭不充分会导致背景高，封闭5次，每次10分钟，彻底去除非特异性结合抗分析软件可测量条带灰度值，进行统计比较过度可能降低信号强度体免疫共沉淀（）技术Co-IP抗体孵育结合细胞裂解物制备特异性抗体与目标蛋白及其相互作用伙伴结合温和条件下裂解细胞，保持蛋白相互作用1蛋白琼脂糖捕获A/G蛋白A/G介导抗体-蛋白复合物沉淀分离与检测SDS-PAGE Western鉴定共沉淀的相互作用蛋白多次洗涤去除非特异结合严格洗涤条件确保特异性免疫共沉淀是研究蛋白质-蛋白质相互作用的经典方法成功的Co-IP实验关键在于保持蛋白复合物的完整性，因此裂解缓冲液通常选用温和成分（如NP-40或Triton X-100），避免使用强变性剂SDS抗体选择也至关重要，应具有高特异性且不影响目标蛋白与其相互作用伙伴的结合为提高特异性，可采用交联抗体与琼脂糖珠策略，减少抗体重链和轻链在Western中的干扰阴性对照（非相关抗体或IgG）和输入对照（未免疫沉淀的裂解物）是实验质量控制的必要组成部分反向Co-IP（使用相互作用伙伴的抗体进行沉淀）是验证相互作用真实性的重要补充证据免疫荧光与共定位分析免疫荧光技术通过特异性抗体和荧光标记物检测细胞内目标蛋白的定位细胞固定方法显著影响结果多聚甲醛（PFA）保持细胞结构完整性但可能掩盖抗原；甲醇/丙酮固定渗透性好但可能破坏某些抗原结构细胞穿透通常使用

0.1-

0.5%Triton X-100或

0.05-

0.1%Saponin处理，使抗体进入细胞内部多色标记是研究蛋白共定位的重要技术，要求使用特异性高的抗体组合和互不干扰的荧光标记物常用荧光团组合包括FITC绿/TRITC红或Alexa488绿/Alexa594红共聚焦显微镜通过光学切片减少背景荧光，提高图像质量定量共定位分析可计算Pearson相关系数或Manders重叠系数，客观评估蛋白共定位程度核酸杂交技术杂交技术类型检测目标探针类型应用特点Southern Blot基因组DNA放射性或非放射性检测特定基因的存在和DNA探针结构变异Northern BlotRNA转录本cDNA或RNA探针分析基因表达和转录本大小原位杂交ISH组织中的核酸寡核苷酸或核酸探针定位组织中特定RNA/DNA表达位置荧光原位杂交FISH染色体DNA荧光标记DNA探针染色体异常和基因定位分析微阵列杂交多个基因表达固定在芯片上的寡核苷高通量基因表达谱分析酸核酸杂交技术基于互补核酸链之间的特异性结合，是分子生物学研究的重要工具探针标记方法多样放射性标记（³²P）灵敏度高但有安全隐患；生物素标记可与链霉亲和素-HRP结合，实现化学发光检测；荧光标记直观但可能存在光漂白问题杂交条件优化是确保特异性的关键，主要通过调整温度、盐浓度和甲酰胺浓度控制杂交严谨性高温、低盐和高甲酰胺浓度增加杂交严谨性，适合高同源序列区分；反之则提高杂交效率，适合探测低丰度靶标洗涤条件同样关键，通常使用逐渐降低的盐浓度和升高的温度去除非特异性结合基因编辑操作CRISPR/Cas9系统原理设计与评估突变体筛选与验证CRISPR/Cas9gRNACRISPR/Cas9系统由两个关键组分组成高效gRNA设计遵循严格标准目标序列长度基因敲除后的细胞筛选通常采用PCR扩增靶Cas9核酸酶和单导向RNAsgRNA为20nt，紧邻PAM位点；避免基因组中的非区域并进行测序、T7E1酶切法或Surveyor酶sgRNA包含CRISPR RNAcrRNA和反式靶位点；偏好GC含量为40-60%；避免四个切法检测错配基于荧光或抗性标记的表达载激活CRISPR RNAtracrRNA的融合体，指以上连续相同碱基；sgRNA的5端核苷酸最体可辅助富集转染细胞单克隆分离对于获得导Cas9靶向特定DNA序列Cas9识别互补好为G用于U6启动子多种在线工具纯合突变体至关重要，通过有限稀释或细胞分于sgRNA的DNA序列和邻近的PAM原型相CHOPCHOP、CRISPOR、Benchling选方法实现最终的突变体验证应包括DNA邻基序，通常为NGG，切割双链DNA，产提供脱靶风险评估和效率预测，选择脱靶得分序列确认和蛋白水平Western blot的功能生双链断裂DSB低且活性预测高的gRNA丧失证明干扰（）实验RNA RNAi设计原则siRNA有效的siRNA序列通常为19-23个核苷酸，GC含量30-60%，避免连续超过3个相同碱基靶向基因的编码区（CDS）比非翻译区效果更稳定，避开启动密码子附近和终止密码子后70nt的区域使用多个针对同一基因不同区域的siRNA可提高抑制可靠性，减少脱靶效应影响构建策略shRNAshRNA是由载体表达的发夹结构RNA，可在细胞内持续表达，实现长期基因沉默设计包括19-29nt的正义链、6-9nt的环状结构和反义链，克隆入U6或H1启动子控制的表达载体与siRNA相比，shRNA提供持久的抑制效果，适合建立稳定敲低细胞系和体内研究转染方法优化脂质体转染Lipofectamine适用于大多数培养细胞，但对原代细胞效率低；电穿孔对难转染细胞效果好，但细胞存活率低；病毒介导的转导效率高，适合原代细胞和体内实验转染效率评估可通过共转荧光蛋白GFP或使用荧光标记的siRNA监测，最佳转染参数因细胞类型而异抑制效果评估RNAi效果验证应同时在mRNA和蛋白质水平进行qRT-PCR定量mRNA降低程度；Westernblot分析蛋白表达变化抑制效率通常在转染后24-72小时达到峰值，根据目标蛋白半衰期不同而异设置阴性对照（非靶向序列）和阳性对照（已知有效的siRNA）是实验可靠性的关键保证基因表达分析质粒构建与报告基因系统启动子区域克隆PCR扩增目标基因调控区域载体连接与转化插入报告基因载体前端功能验证转染细胞检测报告基因活性报告基因系统是研究基因表达调控的有力工具，通过将潜在调控序列与易检测的报告基因（如荧光蛋白或荧光素酶）连接，可视化和定量研究转录活性荧光蛋白报告系统（如EGFP）优点是可直接观察活细胞中的表达，适合单细胞水平分析和动态监测；缺点是背景荧光干扰和定量不精确荧光素酶报告系统（如萤火虫和海肾荧光素酶）具有极高的灵敏度和宽广的线性范围，特别适合定量分析双荧光素酶系统使用两种不同的荧光素酶，一种作为实验报告（萤火虫），另一种作为内参控制（海肾），有效校正转染效率差异转染效率评估常通过共转染表达GFP的质粒并计算荧光阳性细胞比例，或使用β-半乳糖苷酶活性测定常用分子生物学仪器离心机类型与应用分子生物学实验中离心机是核心设备，常见三种类型微量离心机（最高15,000g，适合小体积样品处理）；高速离心机（最高30,000g，细胞分离和大体积核酸提取）；超速离心机（可达100,000g以上，亚细胞组分分离和病毒纯化）使用时需注意转子类型、温度控制和平衡，特别是高速运转时必须严格平衡样品以避免损坏设备移液器使用技巧准确的移液是实验成功的基础单通道移液器常用于精确加样，使用时应保持垂直姿势，缓慢匀速吸放液体，避免气泡多通道移液器提高高通量实验效率，使用前需检查各通道一致性电动移液器减少重复性劳损，增加精确度定期校准移液器确保准确性，不同黏度的液体可能需要不同吸放技巧仪选择要点PCRPCR热循环仪分为普通型和梯度型，后者可在单次实验中同时测试不同退火温度选择时考虑升降温速率（影响实验时长和特异性）、温度均一性（影响重复性）、样品容量和兼容性实时荧光定量PCR仪增加了荧光检测系统，可同时进行核酸扩增和产物检测，但成本更高，需根据实验需求选择合适的通道数量实验设计与优化思路明确科学问题确定清晰、可验证的研究假设实验策略规划选择适当方法和技术路线对照系统设计设置阳性、阴性和内部对照样本量确定确保统计学意义的最小重复数条件优化系统调整关键参数获得最佳结果科学的实验设计是获得可靠结果的基础对照组设置至关重要阴性对照确认无假阳性，阳性对照验证实验体系有效性，内部对照（如看家基因）校正操作和样本差异单一变量原则是优化实验的关键，每次只改变一个参数，保持其他条件不变，确保清晰了解每个变量的影响生物实验的样本量决定结果的可靠性，通常需至少3次独立重复，每次重复包含多个技术重复功效分析可以科学确定检测预期效应所需的最小样本量正交实验设计可高效探索多个因素的最优组合随机化分组和盲法评估是减少主观偏差和系统误差的重要策略数据记录与分析工具实验记录规范数据分析软件应用科学的实验记录是研究工作的基础，应遵循完整性、准确性GraphPad Prism是生物医学领域常用的统计分析和作图和可追溯性原则电子实验记录本ELN系统如软件，提供直观的界面和丰富的统计测试，特别适合t检LabArchives、Benchling提供结构化记录框架，支持多验、ANOVA、生存分析等R语言及其生物信息学包如媒体内容和版本控制标准记录内容包括日期时间、实验DESeq

2、edgeR是高通量数据分析的强大工具，具有高目的、详细材料与方法、原始数据、计算过程、结果分析和度灵活性和可扩展性，但学习曲线较陡结论ImageJ是开源的图像分析软件，广泛用于凝胶定量、细胞实验记录应提供足够信息使他人能重复工作，包括试剂批计数和形态测量MEGA用于分子进化分析和系统发育树构号、设备型号和设置参数记录过程中的注意事项、意外观建专业数据库资源如NCBI、Ensembl、UniProt提供序察和失败尝试同样有价值定期备份电子记录并设置适当权列检索和注释信息，是数据解释的重要参考选择合适的分限控制，确保数据安全性和知识产权保护析工具取决于数据类型、分析复杂度和用户熟悉程度实验结果的质控与重现性空白对照设计阳性阴性对照策略空白对照No TemplateControl,阳性对照确认实验系统正常工作，常用NTC是检测试剂污染的关键，特别是已知结果的样品或标准品阴性对照验在PCR等高灵敏度实验中应在每批证特异性，使用不应产生信号的样品次实验中设置不含模板的反应，通过相对照选择应尽可能接近实验样品特性同流程处理连续出现的阳性NTC表阈值设定需基于对照结果，通常在阴性明系统污染，需彻底清洁工作区和更换对照信号分布的3个标准差以外多重试剂在酶促反应中，空白对照还应包检测时，每个靶标均需设置相应对照括无酶对照，验证观察到的活性确实来自目标酶批间差与误差来源分析批间差是重复性问题的主要来源，可通过实验设计减轻所有比较样品应在同一批次处理；使用随机区组设计分布样品；纳入可跨批次比较的标准样品系统识别误差来源的方法包括控制图分析跟踪关键指标变化；方差分析ANOVA量化不同因素贡献；预实验评估关键步骤稳定性常见实验问题解析无扩增问题PCRPCR反应无产物的常见原因包括模板质量差（降解或含抑制物）；引物设计不当（非特异结合或形成二级结构）；MgCl₂浓度不适（影响聚合酶活性）；热循环程序不合适（变性不充分或退火温度过高）；聚合酶失活系统排查应从最简单的检查开始使用已知可用的阳性对照验证试剂和仪器；梯度PCR寻找最佳退火温度；添加DMSO或甜菜碱改善高GC区域扩增杂带问题PCR非特异扩增（杂带）的主要原因有退火温度过低导致引物错配结合；引物设计不够特异；高浓度Mg²⁺降低扩增严谨性；过多的PCR循环数改进措施包括提高退火温度（每增加1°C可显著减少非特异性）；使用热启动聚合酶减少初始阶段的错误扩增；采用触碰降落PCRTouch-down PCR策略，从高温开始逐渐降低；优化引物设计，检查全基因组特异性电泳条带不清晰电泳图像质量不佳的原因多样样品DNA降解产生拖尾；盐浓度过高导致条带弯曲或扩散；电压过高引起局部过热；凝胶浓度不适合目标片段大小；溴化乙锭浓度或染色时间不足解决方案包括使用新鲜制备的缓冲液；控制加样量，避免过载；保持适当电压（一般5V/cm）；选择最适合目标片段的凝胶浓度；考虑使用灵敏度更高的SYBRGreen等染料解决策略与经验分享试剂质量控制•定期检查试剂有效期，特别是酶类产品•酶试剂避免反复冻融，分装成小体积使用•核酸酶处理的水和缓冲液应严格防止污染实验条件优化•梯度实验确定最佳参数，如退火温度、盐浓度•正交设计高效探索多因素最优组合•引入内部对照监测实验完整性问题排查流程•从最简单的可能原因开始排查•控制变量法，每次只改变一个参数•建立对照系统验证每个关键步骤试剂的储存和管理直接影响实验成功率酶类试剂储存需特别注意大多数酶应保存在-20°C，避免频繁冻融；工作液应在冰上操作，使用后立即放回冰箱；对温度敏感的试剂如蛋白酶K可能在室温下快速失活判断试剂是否失效可通过活性测试或使用已知可行的对照反应验证PCR体系优化案例针对低扩增效率的GC含量70%区域，可采用以下策略增加变性温度至98°C；延长变性时间至30秒；添加5-10%DMSO降低DNA解链温度；使用专门的GC增强型PCR缓冲液；选择对高GC区域更有效的聚合酶，如Q5或Phusion这些措施组合通常能解决难扩增区域的问题实验伦理与数据规范原始数据保存规范实验可溯性要求伦理审批与合规原始数据是科学研究的基础，应按照严可溯性是指通过文档记录追踪实验全过涉及人类样本或动物实验的研究必须事格标准长期保存实验原始记录（无论程的能力理想的记录应能从最终结果先获得伦理委员会批准人类样本研究纸质或电子形式）通常要求保存至少5追溯到原始样本和操作步骤这要求详需知情同意文件和隐私保护措施；动物年，某些特殊领域如临床研究可能需要细记录所有试剂批号、仪器设置、操作实验应遵循3R原则（替代、减少、优更长时间数据存储应包含完整的元数流程和参数调整可溯性不仅支持结果化）基因编辑和病原体研究可能需特据（实验条件、样本信息、设备参数验证，也是故障排除和优化的宝贵资源，殊生物安全审批数据共享时应考虑隐等），确保数据可解释性符合GLP优良实验室规范要求私保护和知识产权问题，遵循相关法规和机构政策案例分析一基因敲除方案靶点选择与设计对目标基因进行序列分析，选择保守区域和功能域设计多对sgRNA靶向不同外显子，优先考虑基因起始部分利用在线工具预测脱靶风险，选择特异性高的靶点检查目标区域附近是否有载体构建与验证SNP可能影响sgRNA识别将设计的sgRNA序列克隆入表达载体，通常使用含Cas9和筛选标记（如GFP或抗性基因）的质粒构建完成后进行测序验证，转染与筛选确认插入序列准确无误体外转录sgRNA并与Cas9蛋白进行体外切割实验，预评估效率根据细胞类型选择合适的转染方法，如脂质体转染、电穿孔或病毒转导转染48小时后，通过FACS分选GFP阳性细胞或进行抗性筛选，富集编辑细胞采用有限稀释法将细胞分散至96孔板，基因型鉴定培养获得单克隆从单克隆细胞提取基因组DNA，PCR扩增目标区域并测序分析DNA序列确认编辑位点和突变类型（插入、缺失或替换）表型分析5T7E1或Surveyor酶切法可作为初筛手段，但最终需通过测序确认检测潜在脱靶位点，验证编辑特异性通过Western blot或免疫荧光验证目标蛋白表达缺失根据基因功能设计特异的表型测试，如细胞增殖、凋亡、迁移等与野生型细胞比较，确认基因敲除引起的功能变化必要时进行基因回补实验，确认表型变化确实由目标基因缺失导致案例分析二外源基因表达表达载体构建基因片段获取选择合适启动子的载体系统克隆基因1PCR扩增或基因合成制备目标序列宿主细胞转化转染真核细胞或转化原核表达系统5蛋白纯化分析亲和层析或色谱方法纯化目标蛋白表达条件优化调整温度、诱导剂浓度最大化表达量外源基因表达系统选择是成功表达的关键原核表达系统（如大肠杆菌BL21DE3）优点是生长迅速、成本低廉、产量高，缺点是缺乏真核翻译后修饰，易形成包涵体；真核表达系统（如哺乳动物细胞CHO、HEK293）能实现正确的蛋白折叠和翻译后修饰，但成本高、产量低；昆虫细胞-杆状病毒系统和酵母表达系统在二者之间，提供中等水平的修饰和较高产量目标蛋白的性质决定了最佳表达策略对于复杂的膜蛋白和糖蛋白，通常需选择真核系统；对于功能性酶，原核系统常能满足需求表达载体设计时，可融合标签（如His、GST、FLAG）便于检测和纯化；考虑添加分泌信号肽提高可溶性；根据密码子偏好优化基因序列，提升表达效率表达条件优化通常需系统测试温度、诱导时间和诱导剂浓度的影响分子生物学新技术与趋势单细胞测序技术单细胞测序突破了传统混合组织分析的限制，能够揭示细胞异质性和罕见细胞类型主流技术包括液滴微流控（10X Genomics）、微孔板（SMART-seq）和组合标记（Drop-seq）等方法单细胞技术已扩展至多组学整合分析，同时检测单细胞的基因组、转录组和表观组，全面解析细胞状态该技术在肿瘤异质性、发育过程和免疫细胞多样性研究中发挥关键作用空间转录组技术空间转录组技术保留了组织空间信息的基因表达分析方法，弥补了传统测序中位置信息丢失的缺陷代表性方法包括基于原位杂交的MERFISH和seqFISH，可检测数百至数千个基因；基于组织切片捕获的Visium和Slide-seq，提供全转录组水平的空间分辨率分析这些技术正在改变我们理解组织微环境、细胞通讯和疾病进展的方式精准基因编辑新方法基因编辑技术持续创新，超越传统CRISPR/Cas9碱基编辑器（CBE和ABE）能实现单碱基精准替换，无需双链断裂；prime编辑技术可直接写入短序列，提高特异性；第三代RNA导向核酸酶如Cas

12、Cas13拓展了编辑靶点范围这些技术为遗传病治疗提供了更精确的工具，减少了脱靶风险表观基因组编辑系统则可修改DNA甲基化和组蛋白修饰，调控基因表达而不改变序列小结与互动问答核心知识点回顾实验技能培养本课程系统介绍了分子生物学实验的基本技能掌握需要理论指导与实践结合建议原理、操作技巧和质量控制，从核酸提取、初学者从基础技术入手，如核酸提取、PCR扩增、基因克隆到蛋白质分析和基PCR和电泳，在掌握这些基本操作后，因编辑技术我们强调了科学的实验设计、逐步尝试更复杂的克隆、表达和基因编辑严谨的操作规范和系统的故障排除思路，技术实验中遇到问题是常态，培养系统这些是成功开展分子生物学研究的基础排查和解决问题的能力同样重要实验记录的规范性和完整性是提升实验技能的关键环节常见问题解答学员常见问题包括PCR失败和非特异性扩增的解决方法；RNA提取过程中避免降解的关键步骤；蛋白表达量低的优化策略；Western Blot高背景的处理方法；基因编辑效率提升技巧等这些问题往往涉及多个因素，需综合考虑实验条件优化、试剂质量控制和操作细节改进分子生物学技术在生命科学研究中扮演着核心工具的角色，其应用范围正在不断扩展随着单细胞测序、空间组学和精准基因编辑等新技术的发展，研究人员需要持续学习和掌握新方法我们鼓励学员在实验实践中不断反思和总结，形成自己的技术体系和问题解决思路，这是成为优秀分子生物学研究者的必由之路。