《分子生物实验技术》课件

分子生物实验技术欢迎来到《分子生物实验技术》课程本课程旨在系统介绍分子生物学研究中常用的实验技术和方法，帮助学生掌握从核酸提取到基因编辑的全面实验技能分子生物学基础DNA结构RNA结构蛋白质结构DNA由脱氧核糖、磷酸基团和四种碱基RNA由核糖、磷酸基团和碱基（A、U、蛋白质由氨基酸通过肽键连接形成，具（A、T、G、C）组成，呈现双螺旋结G、C）组成，通常为单链结构根据功有一级、二级、三级和四级结构其结构两条多核苷酸链通过碱基配对（A-能可分为信使RNA、转运RNA和核糖体构决定功能，是生命活动的主要执行T，G-C）形成复合体，这种特异性互补RNA等多种类型，在基因表达中发挥重者，也是许多分子生物实验的研究对配对是分子生物学实验的基础要作用象分子生物实验发展史11950年代沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，揭开了分子生物学的序幕同时，Sanger开发了蛋白质序列测定方法，为后续研究奠定基础21970年代限制性内切酶和DNA连接酶被发现，促成了重组DNA技术的诞生同期，Sanger和Gilbert开发了DNA测序技术，彻底改变了基因研究方式31980年代Mullis发明PCR技术，极大提高了DNA扩增效率Western blot等蛋白质检测技术也在此时得到广泛应用，推动了蛋白质研究的发展2000年后高通量测序、CRISPR基因编辑等技术相继出现，分子生物学实验进入了大数据和精准编辑时代，研究效率和精度大幅提升主要实验技术分类核酸技术蛋白质技术•DNA/RNA提取与纯化•蛋白质提取与纯化•聚合酶链式反应（PCR）•蛋白质电泳（SDS-PAGE）•核酸电泳与成像•Western Blot•基因克隆与重组•免疫沉淀与免疫共沉淀•DNA测序与基因组学•质谱分析•基因编辑（CRISPR等）•酶联免疫吸附测定（ELISA）细胞与组织技术•细胞培养与转染•流式细胞术•免疫组织化学染色•原位杂交•单细胞分析技术分子生物实验技术可以根据研究对象和目的进行分类核酸技术主要研究DNA和RNA的结构与功能，蛋白质技术聚焦于蛋白质的表达、纯化与功能分析，而细胞与组织技术则关注细胞和组织水平的分子事件这些技术相互补充，共同构成了分子生物学研究的技术体系实验室常见仪器总览离心机离心机利用离心力原理分离混合物中的不同组分，根据转速可分为普通离心机、高速离心机和超速离心机用于细胞沉淀、核酸纯化等过程，是分子生物实验室必备的基础设备PCR仪PCR仪（热循环仪）能够精确控制温度变化，实现DNA变性、引物退火和延伸等步骤循环进行，从而快速扩增特定DNA片段现代PCR仪配有梯度、触摸屏等功能，提高了实验效率和精确度凝胶电泳仪凝胶电泳仪用于分离不同大小的核酸或蛋白质分子由电泳槽、电源和凝胶模具组成，利用带电分子在电场中的迁移率差异进行分离，是核酸和蛋白质分析的基本工具除上述设备外，现代分子生物实验室还常配备核酸定量仪、酶标仪、生物安全柜、荧光显微镜等专业设备熟练掌握这些仪器的使用方法和原理，是开展分子生物学研究的基础技能实验室安全与管理个人防护原则生物安全防护化学品安全管理进入实验室必须穿着实验服，操作有处理细胞和微生物样本时应遵循生物所有试剂必须贴有清晰标签，有毒化害物质时要佩戴手套和护目镜处理安全等级要求，使用生物安全柜感学品应存放在专用柜中废液和固体易挥发有毒物质应在通风橱内进行，染性物质必须在指定区域操作，使用废弃物按规定分类收集处理，了解紧避免吸入有毒气体或气溶胶离开前后进行高压灭菌处理定期对工作台急处理方案，掌握洗眼器和应急淋浴彻底洗手，不将实验服带出实验区面消毒，严格分区管理减少交叉污的使用方法域染实验室安全是分子生物学研究的首要前提建立完善的安全管理制度，定期开展安全培训，确保所有实验人员熟悉紧急情况处理程序，才能在保障人身安全的前提下开展高效的科学研究工作实验样本的准备与保存多种样本类型涵盖血液、组织、细胞、微生物等预处理方法包括匀浆、裂解、固定等关键步骤保存条件选择涉及温度、添加剂和容器等因素不同类型的实验样本需要特定的采集和保存方法血液样本常用EDTA或肝素抗凝，组织样本可用液氮速冻或RNAlater保存短期保存可使用4℃冰箱，长期保存则需-20℃冰箱（DNA样本）或-80℃超低温冰箱（RNA和蛋白样本）样本的质量直接影响实验结果的可靠性采集过程应避免污染和降解，记录详细的样本信息，建立规范的样本库管理系统，确保样本的可追溯性和有效利用冻融循环会导致样本质量下降，应尽量避免反复冻融提取与纯化DNA细胞裂解蛋白质去除破坏细胞膜和核膜，释放核酸去除蛋白质及其他细胞成分洗涤与溶解DNA沉淀去除残留盐分并溶解获得纯DNA使用乙醇或异丙醇沉淀DNADNA提取方法根据样本类型可分为多种类型传统的酚-氯仿法利用有机溶剂分离蛋白质和核酸，提取效率高但操作复杂；盐析法操作简便但纯度较低；柱层析法利用硅胶膜选择性吸附DNA，纯度高且操作标准化市面上有多种商用试剂盒可选择，如天根、Qiagen、TaKaRa等品牌，针对不同样本类型（血液、组织、植物、微生物等）有专门的产品，大幅简化了提取流程，提高了实验效率和重复性选择合适的方法应考虑样本特性、DNA用途和实验室条件提取的关键步骤DNA细胞裂解使用裂解缓冲液（含SDS、Triton X-100等表面活性剂）破坏细胞膜结构对于植物和真菌，可能需要机械破碎；对于细菌，可能需要溶菌酶处理；对于动物组织，可能需要蛋白酶K消化裂解的彻底性直接影响DNA的产量蛋白质去除通过酚-氯仿抽提或高盐沉淀法去除蛋白质酚-氯仿法利用有机相和水相的分离实现蛋白质和核酸的分离；盐析法则利用高浓度盐使蛋白质变性沉淀这一步骤对提高DNA纯度至关重要DNA纯化与回收通常使用乙醇或异丙醇沉淀DNA，再经过70%乙醇洗涤去除残留盐分在柱纯化法中，DNA被选择性吸附在硅胶膜上，通过一系列洗涤去除杂质，最后用低盐缓冲液或水洗脱得到纯化的DNADNA提取过程中的每一步都可能影响最终DNA的质量和产量裂解不充分会导致DNA产量低，而蛋白质去除不彻底则会影响下游实验在操作过程中应避免剧烈振荡（导致DNA断裂）和RNase污染，同时注意防止交叉污染质量与浓度检测DNA紫外分光法荧光定量法利用DNA在260nm波长处有最大吸收的特性进行测定使用特异性荧光染料（如PicoGreen）结合双链DNA后产生荧光A260/A280比值约为

1.8表示DNA纯度较高，低于

1.8表明可能有信号，通过标准曲线计算DNA浓度该方法灵敏度高，可检测低蛋白质污染，高于

2.0则可能有RNA污染A260/A230比值应大至pg级别的DNA，且不受RNA、蛋白质和游离核苷酸的干扰于

1.5，低值表明有残留的有机物或盐类常用仪器有传统分光光度计和微量核酸测定仪（如常用仪器包括Qubit荧光计和荧光酶标仪荧光法虽然需要额外NanoDrop），后者仅需1-2μl样本，操作简便快捷，已成为实验的试剂和标准品，但对于低浓度样本和高精度要求的实验（如室常规设备NGS文库构建）是首选方法此外，凝胶电泳也是评估DNA完整性和纯度的重要方法完整的基因组DNA应在凝胶顶部呈现清晰的单一条带，而降解的DNA则呈现出弥散的条纹电泳还可以检测RNA污染（表现为凝胶底部的弥散区域）和蛋白质污染（表现为加样孔中的残留物）提取与纯化RNA样本裂解使用强变性剂（如异硫氰酸胍）快速灭活RNase并裂解细胞相分离加入氯仿后离心，RNA分布在水相，DNA和蛋白质在有机相和中间相RNA沉淀用异丙醇从水相沉淀RNA，离心收集RNA沉淀洗涤与溶解用75%乙醇洗涤RNA沉淀，去除盐分后溶解于无RNase水中RNA提取的特殊挑战在于RNA分子稳定性低，易被RNase降解实验室应设立RNA专用工作区，使用DEPC处理的水和RNase抑制剂，佩戴无粉手套，并用RNase清除剂处理工作台面和仪器TRIzol法是最常用的RNA提取方法，适用于多种样本类型且经济实惠此外，硅胶膜柱纯化法（如RNeasy试剂盒）操作简便且RNA纯度高，但成本较高对于含多糖或多酚的植物样本和脂肪丰富的样本，需采用特殊的提取方案定量与质量检测RNARNA定量常用方法包括分光光度法和荧光法分光光度法测定RNA在260nm的吸光度，RNA纯度通过A260/A280比值（应为

2.0左右）和A260/A230比值（应大于

2.0）评估荧光法使用特异性RNA荧光染料，精确度高但需要标准曲线RNA完整性分析是评估RNA质量的关键传统方法是通过琼脂糖凝胶电泳观察28S和18S rRNA条带，28S:18S亮度比约为2:1表示RNA完整现代方法如生物分析仪（Bioanalyzer）可计算RNA完整性数值（RIN），1-10分，RIN7表示高质量RNA，适合用于下游分析RNA样本应避免反复冻融，长期保存于-80℃，加入RNase抑制剂可提高稳定性对于关键实验，建议同时采用多种方法评估RNA质量，确保实验结果可靠核酸凝胶电泳技术原理带电原理分子筛效应可视化方法核酸分子中的磷酸基团带琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶常用溴化乙锭（EB）、负电，在电场作用下向正形成网状结构，充当分子SYBR Green等染料与核酸极移动DNA和RNA由于筛较小的核酸分子在凝结合，在紫外光照射下发磷酸骨架结构相似，都具胶中移动速度更快，因此出荧光现代无毒染料如有这一特性能够根据大小分离不同长GelRed和GelGreen提供了度的核酸片段更安全的替代选择DNA和RNA电泳存在一些关键区别DNA电泳通常使用琼脂糖凝胶（

0.8%-2%，根据目标片段大小调整浓度），在TAE或TBE缓冲液中进行RNA电泳则需加入甲醛或胍盐等变性剂防止RNA二级结构形成，常使用MOPS缓冲液，且所有溶液应经DEPC处理以灭活RNase电泳结果分析可通过与标准DNA分子量标记物比较，确定目标核酸的大小通过凝胶成像系统获取的电泳图像，可进行条带强度分析，实现半定量评估凝胶电泳尽管技术简单，但仍是核酸分析的基础和必备技术凝胶电泳具体操作DNA凝胶配制根据目标DNA片段大小选择合适浓度的琼脂糖样品制备2DNA样品与上样缓冲液混合电泳分离施加电压使DNA片段按大小分离凝胶配制时，根据目标片段大小选择合适浓度的琼脂糖大片段（5kb）使用

0.7%凝胶，中等片段（

0.5-5kb）使用

1.0-

1.2%凝胶，小片段（500bp）使用

1.5-

2.0%凝胶将琼脂糖粉末加入TAE或TBE缓冲液中，加热至完全溶解，冷却至约60℃后加入核酸染料，倒入带有梳子的凝胶模具中凝固样品制备需将DNA样品与6×上样缓冲液（含甘油和示踪染料）混合，以增加样品密度并可视化迁移位置电泳条件通常为80-120V恒压，运行时间根据凝胶大小和分辨率要求调整，通常为30-60分钟在解析大片段时应使用低电压，防止过热导致凝胶变形和条带弥散电泳结果分析和成像12凝胶成像条带分析使用紫外凝胶成像系统对染色后的凝胶进行可视化通过分子量标记物确定目标片段大小3半定量分析利用条带强度进行相对定量分析凝胶成像系统通常由紫外光透射台、CCD相机和图像处理软件组成传统系统使用紫外光（302nm）激发核酸染料，而新型系统则采用更安全的蓝光LED成像时应调整曝光时间，确保条带既清晰可见又不过度曝光通过与已知分子量标记物的迁移距离比较，可确定目标核酸的大小大多数成像系统配备分析软件，可自动计算分子量并执行条带强度分析基于条带亮度的半定量分析受多种因素影响，包括染料浓度、紫外曝光时间和核酸浓度等，因此仅适用于相对比较对于需要后续实验的DNA条带，可在蓝光透照仪上进行胶回收，将目标条带切下并使用胶回收试剂盒纯化DNA，用于克隆、测序等下游应用技术原理与应用PCR退火50-65℃使引物与模板DNA互补结合变性95℃高温使双链DNA分离成单链延伸72℃下DNA聚合酶合成新链聚合酶链式反应（PCR）能够在几小时内将特定DNA片段扩增数百万倍，是分子生物学中最为重要的技术之一一个完整的PCR反应需要模板DNA、两条特异性引物、耐热DNA聚合酶、dNTPs和适当的缓冲液PCR技术应用广泛，包括基因克隆（扩增目标基因用于重组表达）、基因诊断（检测特定病原体或遗传变异）、分子标记分析（用于遗传多态性和进化研究）、测序文库构建（为DNA测序准备模板）、突变体筛选和基因编辑验证等近年来，随着高保真聚合酶和优化体系的发展，PCR技术不断创新，出现了多种改良版本如巢式PCR、多重PCR和数字PCR等常用酶与反应体系PCRTaq DNA聚合酶高保真DNA聚合酶最常用的PCR酶，来源于嗜热菌，具有如Pfu、Q5和Phusion等，具有3→5校5→3聚合酶活性和5→3外切酶活性，对功能，错误率低至但缺乏3→5校对功能适合常规1×10⁻⁶~1×10⁻⁷适用于需要高精度PCR，错误率约为1×10⁻⁵在72℃具扩增的情况，如基因克隆和测序缺点有最佳活性，半衰期约为40分钟是价格较贵且扩增效率可能低于Taq酶热启动DNA聚合酶在室温下被抑制，需要初始变性步骤（95℃）激活，减少非特异性扩增和引物二聚体形成常用于多重PCR和敏感检测，提高PCR特异性和产量标准PCR反应体系（50μl）通常包含1-10ng模板DNA、

0.2-1μM正向和反向引物各一条、200μM dNTPs、1-

2.5单位聚合酶、1×反应缓冲液（含Mg²⁺）和无核酸酶水反应缓冲液通常含有50mM KCl、10mM Tris-HCl和

1.5mM MgCl₂镁离子浓度对反应特异性和效率有重要影响，可根据需要优化建立和优化PCR反应体系时，应考虑模板复杂度、GC含量、引物设计和扩增片段长度等因素对于复杂模板和高GC区域，可添加DMSO或甜菜碱等助剂改善扩增效果实验设计与优化PCR引物设计原则PCR条件优化PCR引物通常为18-30个核苷酸，GC含量40-60%，避免长序列重影响PCR特异性和效率的关键因素包括退火温度（过低导致非复和发卡结构引物末端最好以G或C结尾，增强结合稳定性特异性扩增，过高降低扩增效率）、镁离子浓度（影响聚合酶活退火温度（Tm值）一般为55-65℃，正反引物Tm值差异应小于性和引物结合）、引物浓度（过高促进非特异产物形成）和循环5℃引物末端避免互补序列，防止形成引物二聚体数（过多增加非特异扩增和突变累积）引物设计可使用Primer Premier、Primer3等软件进行，需检查梯度PCR是一种高效的优化方法，可在单次实验中测试多个退火特异性（通过BLAST）和二级结构形成可能性针对特殊应用温度，快速确定最佳条件对于难扩增模板，可采用添加（如定点突变、添加酶切位点）需注意额外设计要求DMSO、甜菜碱、甘油等增强剂或使用特殊缓冲液（如GC缓冲液）改善结果PCR失败的常见原因包括模板DNA质量差（降解或含抑制剂）、引物设计不当（非特异性结合或形成二级结构）、反应组分配比不适（如Mg²⁺浓度不适）、循环条件不合适（时间或温度设置错误）这些问题可通过系统优化和控制实验变量解决设计PCR实验时应始终包括阳性和阴性对照实时荧光定量（）技术PCR qPCRSYBR Green法TaqMan探针法数据分析基础SYBRGreen是一种能够嵌入双链DNA的荧光染料，TaqMan探针是一种两端分别标记了荧光基团和淬qPCR数据分析基于阈值循环数（Ct值），即荧光在未结合状态下几乎不发荧光，与双链DNA结合后灭基团的寡核苷酸在PCR过程中，Taq酶的5→3信号达到设定阈值时的循环数Ct值与起始模板量荧光强度显著增强随着PCR产物的增加，荧光信外切酶活性将结合在模板上的探针水解，使荧光基成反比关系，用于绝对定量（通过标准曲线）或相号逐渐增强，实现实时监测该方法简单经济，但团与淬灭基团分离，产生荧光信号该方法特异性对定量（通过ΔΔCt法比较样本间基因表达差缺乏特异性，需要通过熔解曲线分析排除非特异扩高，可进行多重检测，但成本较高，探针设计要求异）影响数据可靠性的关键因素包括扩增效率、增和引物二聚体的干扰严格阈值设定和基线校正qPCR技术在基因表达分析、病原微生物检测、基因拷贝数变异分析、SNP分型和环境样本监测等领域有广泛应用相比传统PCR，qPCR具有定量准确、灵敏度高、污染风险低等优势，已成为分子生物学研究和临床诊断的重要工具实验注意事项qPCR对照设置技术重复与生物重复•阴性对照（NTC）不含模板DNA，检测试•技术重复同一样本多次检测，反映方法精剂或环境污染确性，通常设置2-3个重复•阳性对照确认实验体系有效性，避免假阴•生物重复不同来源的同类样本，反映生物性结果变异性，至少3个独立重复•无逆转录对照（-RT）用于RNA样本，检•重复间Ct值差异应小于

0.5，过大表明操作不测基因组DNA污染精确或样本异质性高•内参基因对照用于校正样本间差异，如上•离群值处理需遵循统计学原则，不可随意舍样量、提取效率等弃数据标准化方法•相对定量常用ΔΔCt法目标基因相对表达量=2^-ΔΔCt•内参基因选择应具有表达稳定性，常用GAPDH、β-actin、18S rRNA等•多内参基因校正可提高数据可靠性，如使用GeNorm算法•扩增效率校正当效率不接近100%时，需进行效率校正qPCR实验需遵循MIQE准则（Minimum Informationfor Publicationof QuantitativeReal-Time PCRExperiments），确保结果可靠性和可重复性此外，样本质量控制、试剂保存条件、仪器校准和防污染措施等细节同样重要针对不同应用场景，如绝对定量、基因表达分析或高通量筛选，应采用不同的实验设计和数据分析策略分子克隆技术概述目的基因获取1PCR扩增或DNA合成载体与片段处理酶切、退火或末端修饰连接反应连接酶催化或同源重组转化与筛选引入宿主细胞并筛选阳性克隆鉴定与验证酶切分析与DNA测序确认分子克隆技术是将目的基因片段插入合适的载体中，在宿主细胞内扩增并表达的过程重组DNA技术的核心是限制性内切酶（能在特定DNA序列位点切割）和DNA连接酶（能连接DNA片段）的应用，这使得研究人员能够精确操作基因分子克隆在生命科学研究中有广泛应用，包括基因功能研究（构建过表达载体或敲除载体）、基因工程蛋白生产（制备用于结构和功能研究的蛋白质）、基因治疗（开发治疗性核酸或病毒载体）和生物技术（生产重组蛋白如胰岛素、生长激素等）现代克隆技术已发展出无缝克隆、Gibson组装、Golden Gate等高效克隆方法，简化了实验流程，提高了成功率基因载体与重组质粒构建克隆载体基本结构载体制备与处理插入片段准备克隆载体通常包含以下关键元件复制起点（ori，控制载体制备通常采用碱裂解法提取质粒，然后用限制性内插入片段可通过PCR扩增（使用含酶切位点的引物）、在宿主细胞中的复制）、选择标记（通常为抗生素抗性切酶酶切对于传统克隆，需选择能产生相同或兼容粘从其他质粒中酶切获得或直接合成PCR产物通常需要基因，用于筛选转化成功的细胞）、多克隆位点（MCS，性末端的酶对载体和插入片段进行处理为防止载体自纯化去除多余引物和dNTPs，并可能需要通过A-尾添加含多个限制性内切酶识别位点，便于插入目的片段）和连，通常使用碱性磷酸酶（CIP或SAP）去除载体5末端或平末端修复进行进一步处理高保真聚合酶对于减少启动子（控制插入基因的表达）根据研究目的，载体的磷酸基团非传统克隆方法如同源重组克隆（In-PCR引入的突变至关重要，尤其是表达载体构建时根可能还包含报告基因、融合标签或特定表达控制元件Fusion、Gibson组装）则需要不同的载体处理方式据分子克隆策略的不同，可能需要在插入片段两端添加特定的序列载体选择应根据实验目的（基因克隆、蛋白表达、报告基因检测等）、宿主细胞类型（大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等）和所需表达级别来确定常用的克隆载体包括pUC系列、pBluescript；表达载体有pET系列（原核）、pcDNA系列（真核）；特殊功能载体如pGL系列（报告基因）、病毒载体等了解载体特性和兼容性对实验成功至关重要连接限制性内切酶与连接酶——限制性内切酶类型酶切反应条件根据切割方式分为产生粘性末端（如EcoRI、每种限制酶有其最适缓冲液和温度（通常37℃）BamHI）和平末端（如SmaI、EcoRV）两类Ⅰ型消化反应时间根据酶的活性和DNA量确定，通常1-412和Ⅲ型酶切割位点与识别位点不同，较少用于分子小时需注意某些酶具有星状活性（非特异性切克隆；Ⅱ型酶在识别位点内切割，是分子克隆的主割），应避免过量酶用量或过长消化时间多酶消力；Ⅳ型酶切割甲基化或非甲基化DNA，用于特殊化时需考虑缓冲液兼容性和消化顺序应用连接反应优化DNA连接酶特性载体:插入片段摩尔比通常为1:3-1:5，但可根据片段T4DNA连接酶源自T4噬菌体，能连接粘性末端和平大小调整反应温度影响连接效率，粘性末端通常末端DNA连接反应需要ATP作为能源，最适温度43在16℃反应1小时，平末端在16℃反应过夜或使用为16-22℃T3DNA连接酶和T7DNA连接酶也可用快速连接酶PEG和分子拥挤剂可提高连接效率，于特定应用，而大肠杆菌DNA连接酶只能连接粘性尤其对平末端连接有明显促进作用末端，使用较少除传统的限制酶-连接酶方法外，现代分子克隆技术还包括多种替代策略TA克隆利用Taq酶添加A尾特性，适合快速克隆PCR产物；同源重组克隆如Gibson组装、In-Fusion和无缝克隆（Seamless Cloning）利用片段间重叠序列，适合多片段连接；Golden Gate克隆利用Ⅱ型限制酶特性实现定向组装这些新技术大大提高了克隆效率和成功率，简化了实验流程质粒转化与宿主细胞感受态细胞制备处理细胞使其能接收外源DNADNA添加与热激DNA与细胞混合并进行热休克恢复与培养添加营养液促进修复与生长涂板与筛选在含抗生素平板上筛选转化子感受态制备方法包括化学法（CaCl₂处理，简便但效率较低）、电转法（电击使细胞膜瞬时形成孔洞，效率高但需专用设备）和热转法（主要用于酵母）商业感受态细胞通常根据转化效率分级，常规克隆可使用10⁶cfu/μg效率的细胞，而连接产物转化或大质粒转化则需要10⁸-10⁹cfu/μg的高效感受态常用宿主菌株包括DH5α（常用于质粒扩增，具有高转化效率和稳定性），JM109（适合蓝白斑筛选，含lacZΔM15），TOP10（适合不稳定克隆），Stbl3（适合重复序列丰富的质粒如慢病毒载体），BL21及其衍生菌株（用于蛋白表达）不同菌株有特定遗传背景和用途，选择合适的宿主对实验成功至关重要转化效率的关键因素包括感受态细胞质量、DNA纯度、热激时间和温度、恢复培养条件等操作过程中应保持无菌条件，避免反复冻融感受态细胞，并注意DNA与感受态的比例菌落筛选与阳性克隆鉴定蓝白斑筛选是最常用的初筛方法，基于lacZα互补原理含有lacZα片段的载体（如pUC系列）在含X-gal和IPTG的平板上可形成蓝色菌落；而目的片段插入破坏lacZα基因后，则形成白色菌落该方法简便直观，但仅适用于特定载体系统，且有时可能出现假阳性菌落PCR是一种快速检测插入片段的方法，直接以菌落为模板进行PCR反应，无需提取质粒通常使用针对插入片段或载体-插入片段连接处的引物，可同时筛选多个克隆虽然快速，但可能存在假阴性和假阳性风险，需进一步验证对初筛阳性克隆进行小量质粒提取后，通常采用限制性内切酶酶切分析验证插入片段的存在和方向最终确认则需通过DNA测序完全验证插入片段序列的正确性，尤其对于表达载体构建更为重要，可排除PCR引入的突变和潜在的框架偏移测序技术基础DNASanger测序原理高通量测序技术Sanger测序（链终止法）是第一代测序技术，基于DNA聚合酶高通量测序（Next-Generation Sequencing,NGS）包括多种平延伸过程中掺入带有荧光标记的双脱氧核苷酸（ddNTPs）导致台，如Illumina（合成测序法）、Ion Torrent（半导体测序）、链终止的原理延伸反应生成一系列不同长度的DNA片段，通过PacBio（单分子实时测序）和Oxford Nanopore（纳米孔测序）毛细管电泳分离后，根据荧光信号顺序确定DNA序列等其共同特点是可并行测序数百万至数十亿DNA分子，大幅提高测序通量，降低成本Sanger测序精确度高（错误率

0.1%），读长可达700-1000bp，适合单个基因和小片段测序，仍是分子克隆验证的金标准其局不同NGS平台各有优缺点Illumina准确度高但读长短（75-限性在于通量低、成本高、不适合全基因组测序300bp）；PacBio和Nanopore能产生长读长（10kb）但错误率较高高通量测序已广泛应用于全基因组测序、转录组测序、表观基因组学和宏基因组学等研究领域DNA测序技术是分子生物学革命性技术之一，从Sanger开创的链终止法到现代高通量测序平台，测序成本已从最初的人类基因组计划时的30亿美元降至现在的不到1000美元测序技术的发展极大推动了基因组学、个性化医疗、病原微生物检测和生物信息学等领域的进步测序反应步骤Sanger模板准备测序模板可以是纯化的PCR产物或质粒DNAPCR产物需进行琼脂糖凝胶电泳检查特异性并纯化；质粒模板应高纯度（A260/A280≈

1.8）且浓度适中优质模板是获得良好测序结果的前提，浓度通常需要50-100ng/μl（PCR产物）或100-200ng/μl（质粒）测序反应循环测序反应混合物包含模板DNA、单一测序引物、dNTPs、荧光标记的ddNTPs和DNA聚合酶现代测序通常使用BigDye Terminator试剂盒（含预混试剂）反应经过变性、退火和延伸循环，产生各种长度的终止片段每种ddNTP（A、T、G、C）带有不同颜色的荧光标记，使得一个反应管中可完成全部测序产物纯化与检测反应产物需纯化去除未掺入的ddNTPs、盐和酶等，通常使用乙醇沉淀法或商业柱纯化试剂盒纯化产物溶于适当缓冲液后，通过自动测序仪的毛细管电泳系统进行分离，实时检测荧光信号并转换为碱基序列分析软件会生成测序图谱（chromatogram）和对应的碱基序列测序结果质量评估基于测序图谱中峰的清晰度和背景噪声水平高质量测序图谱应有清晰分离的峰、低背景噪声和一致的信号强度测序质量通常在序列两端较低，中间区域质量最高测序读长通常为700-1000bp，超过这一范围信号质量显著下降发生测序失败的常见原因包括模板污染、模板量不足、引物设计不当或DNA二级结构强烈区域高通量测序应用实例基因编辑技术启动1996锌指核酸酶（ZFNs）首个基因组定点编辑工具2010转录激活样效应因子核酸酶（TALENs）提高了靶向特异性和效率2012CRISPR/Cas9系统革命性简化了基因编辑流程2020+改良CRISPR系统发展出高精度、多功能编辑工具CRISPR/Cas9系统源自细菌和古细菌的获得性免疫系统，成为最主流的基因编辑工具其核心组件包括Cas9核酸酶（能切割特定DNA序列）和单向导RNA（sgRNA，引导Cas9到靶序列）Cas9在PAM（原型邻近基序，通常为NGG）附近切割DNA，产生双链断裂，随后通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）途径修复，从而实现基因敲除或精确编辑与ZFNs和TALENs相比，CRISPR/Cas9具有设计简单、成本低、多靶点编辑能力强等优势，已在基础研究、作物改良和疾病治疗等领域广泛应用然而，脱靶效应（非特异性编辑）仍是需要克服的挑战新型CRISPR系统如Cas

12、Cas13扩展了编辑对象和应用场景，而碱基编辑器和质粒编辑器则提供了不需双链断裂的精确编辑方式实验设计与质粒构建CRISPR靶点选择sgRNA设计质粒构建靶序列通常选择在基因起始密码子附近或功能域sgRNA通常为20个核苷酸长度，通过在线工具常见载体系统包括全在一（all-in-one）载体（同编码区，以确保有效敲除基因功能靶点应具有（如CHOPCHOP、CRISPOR）设计，综合考虑切时表达Cas9和sgRNA）和双载体系统（Cas9和合适的PAM序列（SpCas9使用NGG），且在基因割效率和脱靶可能性高GC含量（40-80%）通常sgRNA分别在不同质粒）sgRNA通常通过退火组中具有唯一性避免选择DNA甲基化区域，因有利于提高特异性，且应避免连续4个以上相同碱的寡核苷酸插入特定载体，也可通过PCR或合成为这可能降低Cas9结合和切割效率基和强烈的二级结构设计多个sgRNA针对同一方式获得质粒构建后必须通过测序验证sgRNA基因可提高敲除成功率序列正确性脱靶分析是CRISPR实验设计的关键步骤生物信息学工具可预测潜在脱靶位点，通常基于与靶序列的相似度和错配位置实验验证脱靶可通过T7E1酶切分析、靶向深度测序或全基因组测序方法降低脱靶效应的策略包括使用高保真Cas9变体（如eSpCas

9、SpCas9-HF1）、调控Cas9表达水平或使用Cas9昵酶进行双昵缺口（nickase）策略在CRISPR实验中，转染或转导效率对编辑成功率有重要影响胞内Cas9表达水平和持续时间需根据细胞类型和编辑目的优化对难转染细胞可考虑慢病毒系统或电转染法编辑效率评估通常结合T7E1酶切分析、限制性位点丢失分析（RFLP）、Sanger测序和后续功能验证蛋白表达与纯化基础原核表达系统大肠杆菌（E.coli）是最常用的原核表达宿主，具有生长快速、成本低、产量高等优势适合表达不需要复杂翻译后修饰的蛋白质常用菌株包括BL21DE3及其衍生物，如Rosetta（含稀有tRNA）和Arctic Express（低温表达）主要挑战包括包涵体形成（可通过优化表达条件或融合标签改善）和内毒素污染（需要额外纯化步骤）真核表达系统哺乳动物细胞（CHO、HEK293等）可实现正确的翻译后修饰，适合复杂蛋白如抗体和受体的表达昆虫细胞-杆状病毒系统结合了高表达量和适度翻译后修饰能力，是膜蛋白表达的首选酵母系统（酿酒酵母、毕赤酵母）提供了真核表达和高密度培养的优势，适合大规模生产真核系统通常需更复杂的培养条件和更高成本无细胞表达系统直接使用细胞提取物和转录-翻译机器进行蛋白质合成，绕过细胞培养步骤优势在于快速（小时级而非天级），能表达对细胞有毒的蛋白，方便添加非天然氨基酸常用系统包括兔网织红细胞裂解液、小麦胚芽提取物和重组细菌提取物主要局限是成本高和产量相对较低，适合小规模表达和特殊蛋白蛋白表达系统选择应基于目标蛋白特性（分子量、结构复杂性、翻译后修饰需求）、预期产量、成本考虑和下游应用针对难表达蛋白（如膜蛋白、大分子复合物），通常需要尝试多种表达系统和优化策略实验设计时应考虑融合标签的选择（His标签、GST、MBP等），这不仅影响表达水平和可溶性，也决定了后续纯化策略蛋白过表达载体与菌株常用表达载体宿主菌株选择pET系列是最流行的大肠杆菌表达载体，基于T7启动子-RNA聚BL21DE3是标准表达菌株，缺少lon和ompT蛋白酶，减少外源合酶系统，表达受IPTG诱导不同pET变体提供各种融合标签选蛋白降解BL21DE3pLysS含有T7溶菌酶，降低基础表达水择，如C/N端His标签、S标签等pGEX系列含GST融合标签，平，适合表达有毒蛋白Rosetta菌株提供稀有密码子tRNA，改可增加蛋白可溶性并便于亲和纯化pMAL系列使用MBP标签，善基因密码子使用偏好性不匹配问题对提高蛋白可溶性特别有效特殊菌株包括Origami（细胞质形成二硫键）、Arctic Express此外，pBAD载体（阿拉伯糖诱导）和pCold载体（冷休克启动（低温表达提高可溶性）和SHuffle（工程化表达含二硫键的蛋子）可实现表达水平的精细调控，适合毒性蛋白或易形成包涵体白）与质粒和蛋白特性匹配的菌株选择对表达成功至关重要的蛋白多标签表达载体允许多步纯化，提高产品纯度真核表对于复杂蛋白，可能需要筛选多个菌株以优化表达条件达载体则需要适合的启动子（如CMV）和信号肽序列表达优化关键因素包括:诱导条件（IPTG浓度通常

0.1-1mM，较低浓度可减少包涵体形成）、诱导温度（标准37℃或低温16-25℃增加可溶性）、诱导时间（2-24小时，需平衡产量和降解）和培养基选择（标准LB或富集培养基如TB、2×YT增加生物量）针对具体蛋白，常需进行小规模优化实验，测试不同条件组合以获得最佳表达效果蛋白纯化方法亲和层析法是基于蛋白质与特定配体间的特异性相互作用进行分离的技术金属螯合亲和层析（IMAC）利用His标签与镍或钴树脂的结合，是最常用的方法；GST标签蛋白可通过谷胱甘肽树脂纯化；抗原标签（如FLAG、HA、c-Myc）则使用特异性抗体树脂亲和纯化通常一步可达到中等纯度（80%），操作简便，但成本较高且可能影响蛋白功能离子交换层析基于蛋白质表面电荷与固定相离子基团的相互作用，分为阳离子交换（适合碱性蛋白）和阴离子交换（适合酸性蛋白）通过pH和盐浓度梯度洗脱实现分离，分辨率高且容量大，常作为第二步纯化或无标签蛋白的首选方法凝胶过滤（分子排阻层析）根据分子大小分离蛋白质，可用于最终纯化和分子量测定也可用于缓冲液交换和去除聚集体其他常用方法还包括疏水作用层析（基于疏水性差异）和沉淀分离（铵盐或有机溶剂分级沉淀）现代蛋白纯化通常采用快速蛋白液相色谱系统（FPLC）实现自动化和高重复性蛋白检测技术SDS-PAGE原理与应用Western Blot原理十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是分离和分析蛋Western Blot结合电泳分离和免疫检测，实现高特异性蛋白质检测和白质最基本的技术SDS是强阴离子表面活性剂，使蛋白质变性并赋定量工作流程包括SDS-PAGE分离蛋白质；转膜（将蛋白从凝胶予均一负电荷，使蛋白质主要按分子量分离聚丙烯酰胺浓度（通常转移到PVDF或硝酸纤维素膜）；封闭（减少非特异性结合）；一抗

7.5%-15%）根据目标蛋白大小调整，分子量小的蛋白需高浓度凝孵育（特异识别目标蛋白）；二抗孵育（结合一抗并带有检测标记如胶酶、荧光团或放射性同位素）；显色/成像检测信号常用考马斯亮蓝（CBB）染色，灵敏度约100ng；银染可提高灵敏度Western Blot特异性高，可检测复杂混合物中的特定蛋白；灵敏度至1-5ng，但线性范围较窄；荧光染料（如SYPRO系列）兼具高灵敏高，可检测低至皮克级蛋白；能区分不同修饰形式和剪切变体缺点度和宽线性范围SDS-PAGE可用于纯度评估、分子量测定和定量分是操作耗时且依赖抗体质量现代改良包括多通道荧光检测、自动化析，是蛋白研究的基础方法仪器和数字化分析软件变性与非变性PAGE是两种互补的电泳技术非变性PAGE（Native-PAGE）保持蛋白质天然构象和活性，能分析蛋白质复合物和构象异构体，但分离主要基于电荷而非大小二维电泳则结合等电聚焦（IEF，按等电点分离）和SDS-PAGE，能够高分辨率分离复杂蛋白混合物，常用于蛋白质组学研究毛细管电泳和微流控芯片电泳则代表了蛋白电泳技术的未来发展方向，提供更高通量和自动化程度具体流程Western Blot电泳转膜SDS-PAGE分离后的蛋白质需转移到固相膜上（PVDF或硝酸纤维素）常用方法有湿转（完全浸没在转移缓冲液中，转移效率高但耗时）、半干转（使用湿滤纸夹持凝胶和膜，速度快但大蛋白转移效率低）和干转（商业化系统如iBlot，极快但成本高）转移条件（电压、时间、缓冲液组成）需根据目标蛋白大小优化，大蛋白需更长时间或添加SDS促进转移抗体孵育转膜后先用含封闭剂（5%脱脂奶粉或BSA）的TBST或PBST缓冲液处理1小时，减少非特异性结合一抗孵育通常在4℃过夜或室温2-3小时，浓度根据抗体效价确定（通常为1:500-1:5000）严格洗膜（TBST，3-5次，每次5-10分钟）后进行二抗孵育（室温1小时，浓度通常1:5000-1:10000）二抗通常结合HRP（辣根过氧化物酶）、碱性磷酸酶或荧光团，匹配一抗的种属来源信号检测与分析HRP标记系统使用发光底物（ECL），产生的化学发光信号可通过X光片或CCD相机检测荧光标记系统直接使用荧光扫描仪检测，具有更宽的线性范围数字图像获取后，可使用软件（如ImageJ）分析条带强度，实现半定量分析可通过内参蛋白（如β-actin、GAPDH）校正加样量差异，提高定量准确性Western Blot常见问题及解决方案背景高（增加洗涤次数，优化抗体浓度，使用更好的封闭剂）；无信号（检查抗体质量，增加蛋白量，延长曝光时间）；非特异条带（提高抗体特异性，优化洗涤条件）；条带弱或不均匀（改善转膜效率，检查蛋白降解问题）多重检测可通过剥离重染（stripping）或多色荧光标记实现，提高实验效率和数据可比性蛋白定量与活性分析BCA法联噻唑墨（BCA）蛋白定量法基于蛋白质还原Cu²⁺为Cu⁺，后者与BCA形成紫色复合物，在562nm有最大吸收该法灵敏度高（

0.5-20μg/ml），耐受多种缓冲组分和去垢剂，但容易受还原剂和某些金属离子干扰BCA法操作简单，线性范围广，已成为最常用的蛋白定量方法之一Bradford法考马斯亮蓝G-250在酸性条件下与蛋白质结合后从465nm转变为595nm最大吸收方法快速（2-5分钟）且试剂稳定，但蛋白种类间差异大，线性范围较窄（1-20μg/ml）容易受碱性和去垢剂干扰，不适合膜蛋白分析常用于快速初筛和不含干扰物的样品分析酶活性测定酶活性分析根据酶类型采用不同策略水解酶常使用显色或荧光底物；氧化还原酶可通过辅因子（如NAD⁺/NADH）吸光度变化监测；激酶活性可通过ATP消耗或底物磷酸化检测标准测定条件包括最适pH、温度、底物浓度和辅因子，确保结果可靠性和可比性其他常用蛋白定量方法包括Lowry法（经典方法，基于酪氨酸与Folin试剂反应）、UV吸收法（280nm处吸光度，简便但受核酸污染影响大）、荧光染料法（如NanoOrange，高灵敏度但需特殊仪器）选择适当方法应考虑样品特性、所含缓冲成分和所需精确度蛋白质功能分析还包括多种生物物理学方法，如圆二色谱（CD，分析二级结构）、热稳定性分析（DSF，评估蛋白稳定性和配体结合）、同位素标记动力学分析（HDX-MS，探测构象变化）和分析超速离心（AUC，研究蛋白寡聚状态）这些方法与活性分析相结合，可提供蛋白质功能和结构关系的全面理解分子杂交技术Southern Blot检测特定DNA片段的位置和数量Northern Blot分析RNA转录本的大小和表达水平原位杂交在组织或细胞中定位特定核酸序列探针设计是分子杂交技术的关键DNA探针通常为100-1000bp长度，可通过PCR、克隆或直接合成获得标记方法包括放射性同位素标记（³²P，高灵敏度但有安全隐患）、非放射性标记（如生物素、地高辛，可通过酶联显色或化学发光检测）和荧光标记（用于FISH）探针特异性应通过序列比对分析确认，避免与非靶序列交叉反应杂交条件优化是实验成功的关键杂交温度通常设定在Tm值以下5-10℃；链长、GC含量和非完全互补性影响Tm值杂交缓冲液通常含有甲酰胺（降低Tm值）、SDS（减少非特异性结合）、盐（稳定双链）和封闭剂（如鲑鱼精DNA，减少背景）洗涤条件的严格程度（温度和盐浓度）决定了杂交特异性，可根据需要调整现代技术如微阵列已部分替代传统杂交方法，但基本原理相同实验步骤Southern BlotDNA酶切与电泳基因组DNA（5-10μg）经限制性内切酶完全消化后，通过琼脂糖凝胶电泳分离不同大小的片段为保证大片段的有效分离，通常使用

0.7-

0.8%的低浓度凝胶，并添加溴化乙锭实时观察DNA迁移情况标准分子量标记物有助于后续确定目标片段大小完成电泳后，在紫外透射仪上照相记录电泳结果，同时用刻度尺标记凝胶位置变性与转膜电泳结束后，将凝胶先在变性液（

0.5M NaOH,

1.5M NaCl）中浸泡20分钟，使DNA变成单链；再用中和液（

0.5M Tris-HCl pH

7.5,

1.5M NaCl）处理20分钟随后通过毛细管转移法将DNA从凝胶转移到尼龙膜上，通常使用20×SSC作为转移缓冲液，转移过夜转膜完成后，用紫外交联仪或80℃烘烤2小时固定DNA到膜上杂交与检测预杂交膜在杂交液（含封闭剂如鲑鱼精DNA）中42-65℃预杂交1-2小时，减少非特异性结合杂交加入已变性的标记探针，42-65℃杂交12-24小时洗膜先用低严格度缓冲液（2×SSC,

0.1%SDS），再用高严格度缓冲液（

0.1×SSC,

0.1%SDS）在适当温度洗涤，去除非特异性结合的探针检测根据探针标记类型选择相应检测方法，如X射线胶片曝光（放射性探针）或化学发光底物显色（非放射性探针）现代Southern Blot技术虽已被PCR和测序等方法部分替代，但在某些应用中仍不可替代，如基因组重排、基因拷贝数分析、转基因整合位点验证等改良技术包括反向Southern（膜上固定探针，样本在溶液中）和点杂交（直接将DNA点在膜上）提高灵敏度的策略包括使用高活性探针、优化杂交条件和采用高灵敏度检测系统，如增强化学发光（ECL）实验流程Northern Blot变性RNA电泳使用含甲醛的琼脂糖凝胶破坏RNA二级结构转膜与固定通过毛细作用将RNA转移到尼龙膜并固定探针杂交用标记探针特异识别目标RNA序列Northern Blot与Southern Blot原理相似，但专门用于RNA分析，需要特殊处理防止RNA降解RNA样品（5-20μg总RNA或1-5μg mRNA）需在含有甲醛或胍盐等变性剂的缓冲液中加热变性，破坏二级结构，确保按分子量线性分离电泳通常在含甲醛的琼脂糖凝胶和MOPS缓冲系统中进行，所有溶液应使用DEPC处理的水配制，防止RNase污染转膜后的杂交步骤与Southern类似，但探针设计需针对RNA特点DNA探针是最常用的，但RNA探针（通过体外转录制备）具有更高亲和力和特异性杂交温度和洗膜条件需根据探针类型和特异性要求优化检测完成后，通常需通过内参基因（如GAPDH、β-actin或18S rRNA）进行标准化，校正不同样本间的RNA量差异Northern Blot的主要优势在于能同时检测转录本大小和丰度，鉴别可变剪接体，并直接比较不同样本间的表达水平现代改进包括使用DIG标记探针替代放射性标记，采用甲基汞或脲作为更安全的变性剂，以及开发自动化杂交和检测系统尽管qRT-PCR和RNA-Seq提供了更高灵敏度和通量的RNA分析方法，Northern Blot在特定应用中仍具不可替代的价值原位杂交与荧光原位杂交原位杂交原理荧光原位杂交优势原位杂交（In Situ Hybridization，ISH）是直接在完整组织或细胞中荧光原位杂交（Fluorescence InSituHybridization，FISH）使用直检测特定核酸序列的技术，保留了空间位置信息与传统杂交方法不接标记荧光团的探针，在荧光显微镜下观察FISH具有更高的敏感性同，ISH无需提取核酸，而是在样本固定和渗透后直接进行杂交探和分辨率，支持多色检测（使用不同荧光团标记不同探针），可同时针可检测DNA（如基因组定位）或RNA（如基因表达模式），提供基监测多个基因荧光信号可直接定量，提供更准确的表达水平评估因在时空维度上表达和分布信息标准ISH使用非荧光标记（如地高辛、生物素）的探针，通过免疫组现代FISH技术拓展到多种应用染色体FISH用于检测染色体异常；织化学方法检测（酶联发色反应），使目标序列在光学显微镜下可间期FISH可检测基因扩增或缺失；RNA-FISH能追踪单个RNA分子的见该技术使组织学形态和基因表达得以关联，广泛应用于发育生物亚细胞定位；组合标签FISH（seqFISH、MERFISH）实现数百至数千学和病理学研究基因的高通量检测，为单细胞空间转录组学研究提供新方法ISH/FISH在多个研究领域有广泛应用发育生物学（研究胚胎发育过程中的基因表达模式）、神经科学（分析神经元特异基因表达和神经环路）、肿瘤诊断（检测特异性基因改变如HER2扩增）、微生物学（环境样本中未培养微生物的鉴定）和染色体异常分析（如唐氏综合征筛查）探针设计、样本制备和杂交条件优化是实验成功的关键近年来，ISH/FISH与其他技术如免疫组织化学、超高分辨率显微镜和图像分析算法的结合，进一步拓展了其应用范围和深度流式细胞术（）Flow Cytometry基本原理样本制备流式细胞术使单细胞悬液通过一个或多个激光获取单细胞悬液是流式分析的首要步骤血液束，测量散射光和荧光信号前向散射（FSC）样本需红细胞裂解；组织样本需酶消化或机械反映细胞大小，侧向散射（SSC）反映细胞内分离；贴壁细胞需胰酶消化细胞通常需经固部复杂性和颗粒度荧光信号来自细胞内源荧定（保持形态和抗原）、渗透（允许抗体进入光（如GFP）或荧光标记的抗体、染料等现细胞内）和封闭（减少非特异性结合）荧光代流式细胞仪可同时检测12-40个参数，实现标记可通过直接标记抗体、间接标记（一抗+细胞的多维表征荧光二抗）或荧光染料（如PI、DAPI用于DNA染色）实现数据分析流式数据分析使用专用软件（FlowJo、FCS Express等），通过门控（gating）策略识别和分离不同细胞群体常用展示方式包括直方图（单参数分布）和散点图（两参数关系）数据分析关键步骤包括排除碎片和聚集物、荧光补偿（消除不同荧光通道间的串扰）、门控策略确定和统计分析现代分析方法包括聚类算法、降维技术（如t-SNE、UMAP）和机器学习，助力复杂数据集的解析流式细胞术在免疫学、肿瘤学、细胞生物学等领域有广泛应用免疫分型利用细胞表面标志物（如CD分子）区分免疫细胞亚群，是临床血液学和免疫学诊断的常规方法细胞周期分析通过DNA含量评估细胞分布在G0/G

1、S和G2/M期的比例，常用于药物筛选和肿瘤研究凋亡检测可通过Annexin V（识别膜磷脂翻转）和PI（DNA染色剂）的组合，区分早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞免疫共沉淀与免疫沉淀抗体结合固相捕获特异性抗体与目标蛋白形成复合物蛋白A/G磁珠或琼脂糖珠结合抗体洗脱与分析洗涤除杂回收目标蛋白并通过SDS-PAGE分析去除非特异结合的蛋白质免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用抗体特异性结合并沉淀目标蛋白的技术，可从复杂混合物中分离纯化特定蛋白免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）则进一步检测与目标蛋白相互作用的蛋白，是研究蛋白质-蛋白质相互作用的重要方法IP/Co-IP步骤包括细胞/组织裂解（使用温和的非变性裂解液保持蛋白质相互作用）、抗体孵育（可预先与固相载体偶联，或先与蛋白结合后再加载体）、洗涤（去除非特异结合）和洗脱（通常使用SDS样品缓冲液）IP/Co-IP实验中的关键考虑因素包括抗体选择（特异性、亲和力和交叉反应性），裂解条件（缓冲液组成影响蛋白可溶性和相互作用保留），固相载体选择（蛋白A、蛋白G或两者混合，根据抗体种属和亚型选择），以及阴性对照（如同型对照抗体）设置常见问题包括抗体重链/轻链干扰目标蛋白检测（可使用特殊二抗或交联抗体到载体解决）和弱相互作用检测难度（可使用化学交联剂稳定）酶标仪与技术ELISA基因芯片与高通量技术DNA芯片DNA芯片（基因芯片）是将大量已知DNA序列（如寡核苷酸或cDNA）按特定排列固定在固体支持物上，通过杂交检测样本中核酸序列的技术平台样本（如mRNA）经反转录和荧光标记后与芯片杂交，根据荧光信号强度分析基因表达谱或基因组变异DNA芯片在基因表达分析、SNP分型和基因组拷贝数变异检测等方面有广泛应用蛋白芯片蛋白芯片将大量蛋白质或抗体固定在芯片表面，用于高通量分析蛋白表达、相互作用和修饰常见类型包括分析型芯片（固定抗体检测样本中蛋白质）、功能型芯片（固定纯化蛋白研究相互作用）和反向相芯片（固定组织或细胞裂解物检测特定蛋白）蛋白芯片在蛋白质组学、生物标志物发现和药物筛选中发挥重要作用数据分析高通量技术产生的海量数据需要专业生物信息学方法处理基本分析流程包括图像获取与处理（背景扣除、信号归一化）、质量控制（评估重复性和信噪比）、统计分析（差异表达基因识别）和功能注释（GO富集、KEGG通路分析）常用软件包括R语言的Bioconductor包、GeneSpring和Partek等商业软件除芯片技术外，其他高通量分析平台包括大规模平行测序技术（NGS，如RNA-Seq、ChIP-Seq）、质谱技术（LC-MS/MS）和高内涵筛选（HCS，结合自动显微镜和图像分析）等这些技术共同推动了组学时代的到来，使研究者能从全局角度理解生物系统芯片技术虽在某些应用中已被NGS替代，但因其成本优势和数据分析相对简单，在某些领域仍保持竞争力单细胞分子生物实验技术单细胞分离流式细胞分选、微流控和显微操作技术信号放大全基因组/转录组扩增和条形码技术高通量检测3测序、质谱和多重组学分析数据分析算法开发和可视化工具单细胞分子生物学技术突破了传统组织和细胞群体水平分析的局限，实现了对单个细胞分子特征的精确解析，揭示细胞异质性和罕见细胞亚群单细胞分离是实验的第一步，常用方法包括流式细胞分选（FACS，高通量但可能影响细胞活性）、微流控系统（如10x Genomics平台，平衡效率和成本）和激光显微切割（精确但低通量）细胞分选后，通常采用特殊的裂解方法和信号放大技术处理极少量起始材料单细胞RNA测序（scRNA-seq）是最成熟的单细胞组学技术，已发展出多种方案Smart-seq2提供全长转录本信息；10x Genomics系统实现高通量分析；Drop-seq和microwell-seq降低了成本此外，单细胞基因组测序（scDNA-seq）用于研究体细胞突变和CNV；单细胞表观基因组学（scATAC-seq、scChIP-seq）分析染色质状态；单细胞蛋白质组学（质谱或CyTOF）检测蛋白表达谱多组学集成分析（如CITE-seq同时检测RNA和表面蛋白）提供了更全面的细胞特征描述单细胞技术在发育生物学、肿瘤异质性、免疫学和神经科学等领域有广泛应用前沿与新兴实验技术第三代测序技术代表了核酸测序的最新发展牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore）通过检测DNA分子通过蛋白质纳米孔时产生的电流变化识别碱基，可产生超长读长（100kb），适合复杂基因组和结构变异分析PacBio SMRT测序基于单分子实时检测原理，具有长读长和直接检测DNA修饰的能力这些技术虽然错误率相对较高，但通过算法优化和高覆盖度可显著提高准确性数字PCR将传统PCR反应分成数千至数百万个独立反应单元（如微滴或微孔），实现绝对定量而无需标准曲线其优势在于高精确度（CV5%）、高灵敏度（检测低至单拷贝目标）和抗干扰能力（对抑制剂不敏感）数字ELISA采用类似原理，将抗原-抗体反应分隔在独立微反应器中，实现单分子蛋白检测，灵敏度提高1000倍，为低丰度生物标志物检测带来突破其他新兴技术还包括空间转录组学（保留组织空间信息的基因表达分析）、单细胞多组学（同时分析单细胞的DNA、RNA和蛋白质）、全基因组CRISPR筛选（高通量基因功能研究）和生物正交化学（扩展生物系统的化学能力）等，这些技术正在重塑分子生物学的研究方法和视野实验设计与数据处理科学问题确立明确研究目标和假设，这决定了后续所有实验设计实验设计优化样本分组、对照设置、重复设计和盲法原则统计分析方法选择合适的统计方法验证结果可靠性结果可视化使用恰当的图表展示数据和结论实验重复分为技术重复和生物重复技术重复是对同一样本进行多次测量，评估方法精确度和操作一致性；生物重复则使用来自不同个体的样本，反映生物变异性建议实验至少设置3个生物重复，关键结论可增加至5-6个合理的对照设置包括阴性对照（确认特异性）、阳性对照（验证方法有效性）、载体对照（消除载体影响）和处理对照（排除非特异反应）统计分析在分子生物学研究中至关重要t检验适用于两组间比较；方差分析（ANOVA）用于多组比较；非参数检验适用于不符合正态分布的数据需注意统计显著性（p值）与生物学意义的区别，显著的统计差异不一定有生物学意义数据可视化应遵循清晰、准确和诚实原则，常用图表包括柱状图（均值比较）、散点图（分布展示）、热图（多维数据）和主成分分析图（降维分析）图表应包含误差棒（通常为标准差或标准误）和样本量信息案例分析与成果展示研究目标技术路线关键创新点应用价值肿瘤免疫微环境分析单细胞测序+空间转揭示肿瘤异质性空间指导免疫治疗精准用录组学分布模式药新型冠状病毒变异监高通量测序+数字开发超敏检测系统与支持疫情防控与疫苗测PCR生物信息分析流程更新基因治疗载体优化CRISPR筛选+AAV改定向进化获得高效脑提升神经系统疾病基造部靶向AAV因治疗效果案例一2022年《自然》发表的肿瘤微环境研究利用单细胞RNA测序和空间转录组技术相结合，对肝癌患者样本进行了多维分析研究者首先通过单细胞测序鉴定了关键免疫细胞亚群，随后利用空间转录组技术确定了这些细胞在肿瘤不同区域的分布特征研究发现肿瘤边缘区存在特殊的免疫抑制微环境，诱导T细胞功能耗竭基于这一发现，研究团队设计了靶向该机制的组合免疫治疗策略，在小鼠模型中取得显著疗效案例二中国科研团队在新冠病毒研究中应用高通量测序和数字PCR技术，开发了能够检测低至5拷贝/mL的超高灵敏度检测系统该系统结合了核酸富集、数字PCR和生物信息学分析流程，不仅能准确检测感染，还能同时监测已知变异并发现新变异这项技术已应用于多个省市的疫情监测，为变异株的早期预警和疫苗策略调整提供了重要依据这些案例展示了分子生物学实验技术的创新应用如何解决重大科学问题和现实挑战实验常见问题与故障排查核酸提取与检测问题蛋白质实验障碍•DNA产量低检查起始材料质量，优化裂解条件，•表达蛋白形成包涵体降低培养温度，使用可溶延长沉淀时间性标签，优化诱导条件•RNA降解严格防RNase污染，快速处理样本，•蛋白纯化效率低调整结合缓冲液组成，延长结使用RNase抑制剂合时间，检查标签完整性•PCR无扩增检查引物设计，优化退火温度，排•Western Blot背景高增加封闭时间，优化抗体除抑制剂干扰浓度，延长洗涤步骤•测序质量差提高模板纯度，排除二级结构影响，•ELISA灵敏度不足检查抗体质量，优化包被条确保足量DNA件，延长孵育时间细胞实验难题•转染效率低优化细胞密度，检查质粒质量，筛选最佳转染试剂•CRISPR编辑效率差优化sgRNA设计，调整Cas9表达量，改进筛选策略•细胞污染严格无菌操作，使用抗生素预防，定期检测支原体•免疫荧光背景强调整固定条件，增加洗涤次数，使用合适的封闭剂实验记录是问题排查的重要基础详细记录每个实验步骤、试剂配方、仪器参数和环境条件，有助于回溯问题根源建立标准操作流程（SOP）并严格执行，可显著减少实验失败率解决复杂问题时，采用系统性排查方法从样本制备、实验条件到数据分析，逐一排除各环节可能的故障点分子生物学实验中的常见误区包括过度依赖单一技术或方法而忽视互补验证；忽视阴性对照和阳性对照的重要性；样本大小不足导致统计结论不可靠；盲目追求新技术而忽视基础方法的优化克服这些误区需要扎实的理论基础、严谨的科学态度和丰富的实践经验对于关键结果，应采用不同原理的方法进行验证，增强结论可信度课程总结与展望核酸分析技术蛋白质研究方法1从经典PCR到单分子测序的演进从电泳分离到高通量互作网络2单细胞分析基因操作技术从群体平均到单细胞精准解析从重组克隆到精准基因编辑本课程系统介绍了分子生物学实验的核心技术体系，从基础的核酸提取、电泳和PCR，到高级的测序、蛋白组学和基因编辑技术这些方法构成了现代生命科学研究的技术基础，支撑着从基础研究到临床应用的广泛领域通过掌握这些技术的原理、操作要点和问题排查策略，您已具备开展分子生物学研究的基本能力未来分子生物学技术将向多方向发展微型化和自动化（如微流控芯片实验室、全自动实验平台）提高通量并降低成本；多组学整合分析实现从基因到蛋白功能的系统解析；活体成像和单分子检测技术突破时空分辨率限制；人工智能辅助的实验设计和数据分析提升研究效率这些进步将深刻改变生物医学研究模式，加速从科学发现到临床应用的转化过程作为未来的科研工作者，保持学习热情，不断更新知识结构和技术技能，将使您在这一充满机遇的领域中取得成功。