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文本内容:
一谷胱甘肽还原酶（GR）活性
一、材料、仪器设备及试剂
（一）材料棉花
（二）仪器设备研钵，高速冷冻离心机，紫外分光光度计，试管数支
（三）试剂
10.1M pH
7.5磷酸缓冲液PBS,含1%PVP;
0.2mM EDTA;
1.5mM MgC12;
0.025mM NADPH;
0.25mM氧化型谷胱甘肽GSSG
二、实验步骤
1、酶液提取取1g棉花叶片于预冷的研钵中，加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5mlo取5nli于1r/min下离心20min,上清液即为GR粗提液
2、显色反应取透明度好、质地相同的15mniXl50nlm试管4支，2支为测定管，另2支为对照管按下表加入各种溶液（测定时按表格中各溶液的量加倍，以便于重复测定两次）显色反应试剂配制表试剂名称用量ml
0.Imol/L磷酸缓冲液PBS
0.2对照2支管不加酶液
0.
11.5mmol/L MgC
120.2mmol/L EDTA
0.
10.025mmol/L NADPH
0.
20.25mM氧化型谷胱甘肽GSSG
0.2酶液
0.2蒸储水2总体积3混匀后比色，3min内每30s记录一次数据
三、结果计算GR总活性=A-As XVT/A°X
0.5X6股＜V式中GR总活性以酶单位每克鲜重表示；Ao——为照光对照管的吸光度；人一一为样品管的吸光度；V——为样品液总体积ml;5mlTV、——为测定时样品用量ml;
0.2mlFW-----为样品鲜重g;1g二H202含量测定
二、仪器与用具分光光度计、离心机、研钵、5mli支，容量瓶10ml7个、移液管
0.2ml,离心管5nli8支
三、试剂及其配制1100uM H202丙酮试剂取30%分析纯H20257ul,溶于100ml丙酮中，此液稀释100倍22M硫酸3丙酮4浓氨水55%W/V硫酸钛
60.3%H0:吸取
0.5ml30%O2用50mmol/LPH
7.0的磷酸缓冲液PBS定容至50ml22
四、方法1标准曲线制作取10ml离心管7支，顺序编号，按表加入试剂离心管号试齐1234567H
20200.
10.
20.
40.
60.
81.04°C预冷丙酮
1.
00.
90.
80.
60.
40.205%硫酸钛
0.
10.
10.
10.
10.
10.
10.1浓氨水
0.
20.
20.
20.
20.
20.
20.23000r/min离心10min,弃去上清液，留沉淀2mol硫酸
5.
05.
05.
05.
05.
05.
05.0待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶，蒸储水冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml,415nm下比色2样品提取和测定
（1）称3g,按材料和提取剂1:1的比例加入4C下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆，转入离心管3000r/min下离心lOmin,弃去残渣，上清液即为样品提取液
（2）用移液管吸取1ml上清液，按表加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000r/min下离心lOmin,弃去上清液沉淀用丙酮重复洗涤5次，直到去除植物色素
（3）向洗涤后的沉淀中加入2moi硫酸5ml,待完全溶解后，转入10ml容量瓶中，用蒸储水冲洗离心管，定容至10ml,415nm下比色3结果计算每克鲜重植物组织中H202含量（umol/g）=C*Vt/FW*Vl式中C-----------标准曲线上查得样品中H202浓度（umol）Vt------样品提取液总体积（ml）VI----测定时用样品提取液体积（ml）FW——植物组织鲜重（g）三乙醇脱氢酶（ADH）活性测定
二、仪器与用具分光光度计、离心机、研钵，容量瓶，离心管
三、试剂1100mM HEPES250mM三羟甲基氨基甲烷Tris-Hcl缓冲液PH
8.0315mM二硫苏糖醇DTT420%乙醇
50.867mM氧化型辅酶1NAD
1、酶液提取称棉花叶片o.1g,加2IT11HEPES溶液，ImlDTT研磨成匀浆，转移到离心管中，10000r/min下离心15min上清液即为ADH粗提液
2、ADH活性测定在3ml反应体系中包括150Mm Tris-Hcl缓冲液1ml220%乙醇
0.5ml315mM DTT
0.45ml
40.867mM NAD1ml5酶液50ul对照加入50ul缓冲液代替，调零在340nm波长下测定吸光度，每隔30s读数一次，共测4min
3、结果计算ADH活性二△0D340*Vt/Vs*
0.01*t*FW酶活性单位为:U/g•min U:酶活单位将每分钟0D减少
0.01定义为1个活力单位△A’:反应时间内吸光度变化；t:为反应时间min;3min匕:提取酶液的总体积ml:3mlVs测定时取用酶液体积ml;
0.05mlFW:
0.1g四抗坏血酸过氧化物酶AsA—POD活性测定
一、仪器高速冷冻离心机、紫外分光光度计、研钵、试管
二、试剂及配置150mniol/LPH
7.0的磷酸缓冲液PBS:取61ml A母液+39ml B母液+蒸储水定容到400ml o母液之前配好2提取液——50mmol/LPH
7.0的磷酸缓冲液,含2mmol/LAsA和
0.lmmol/L EDTA—Na配置方法2o
①取61nli A母液+39ml B母液+蒸储水定容到400ml;
②称取
0.1409g的AsA溶到PBS中;
③称取
0.0148896g的EDTA—Na溶到PBS中
30.3mmol/L的AsA溶液:配100ml配置方法A法直接称取
0.052839g的AsA,用50mmol/LPH
7.0的磷酸缓冲液定容到100ml oB法
①先配置
0.3mol/L的AsA母液称取
5.2839g的AsA配置1L的母液
②取1ml
0.3mol/L的AsA母液用50mmol/LPH
7.0的PBS定容到100ml
40.2%H0:用移液抢吸取66714的30%上用50mmol/LPH
7.0的PBS定容到100ml222AsA的相对分子质量为
176.13;EDTA—NaZ的相对分子质量为
372.24
三、方法步骤
1、酶液的提取称取
0.5g叶片，按1:5加入预冷的提取液，在冰浴中研磨后，在4500r/min下离心15min,上清液为粗酶提取液研磨时加
2.5ml,洗钵再加
2.5ml,提取液共5ml.
2、酶活性测定反应体系如下
①50mmol/LPH
7.0的PBS:
1.8ml;
②
0.3mmol/L的AsA溶液:100心;
③粗酶提取液100R；对照加提取液代替，调零
④
0.2%110:1ml;22加入后立即在290nm波长下测定4min内OD29值的变化，计算酶活性
3、结果计算AsA-POD酶的活性=AA29°XV酶活性单位为U/g-min「V x
0.01x txFswU:酶活单位将每分钟0D减少
0.01定义为1个活力单位A A:反应时间内吸光度变化；290t:为反应时间min;4minVT提取酶液的总体积ml;5mlVs测定时取用酶液体积ml.
0.1ml。
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