《分子生物学实验技术》课件

《分子生物学实验技术》欢迎大家参加《分子生物学实验技术》课程本课程旨在介绍当代分子生物学领域中最重要的实验方法和技术，从基础概念到实际操作，系统地指导学生掌握分子生物学实验的核心技能我们将从分子生物学的基本概念开始，逐步深入探讨DNA和RNA提取、基因克隆、PCR技术、分子杂交、蛋白质分析以及最新的基因编辑技术等内容希望通过本课程的学习，能够为大家今后的科研工作打下坚实的基础目录1分子生物学概述定义、发展历程及主要研究领域2主要实验技术简介基因克隆、PCR技术、Western Blot及基因测序技术3实验安全与规范实验室安全须知、废弃物处理和个人防护措施4核心实验技术详解DNA/RNA提取、基因克隆、PCR、分子杂交、Western Blot和基因编辑

1.分子生物学概述生命科学基础学科分子生物学是研究生命过程中生物大分子结构与功能的科学研究核心以DNA、RNA和蛋白质为核心，探索基因表达与调控机制实验方法体系建立了独特的实验技术体系，如基因工程、基因组学和蛋白质组学等

1.1分子生物学定义学科定义核心研究对象分子生物学是研究生物体在分子DNA（脱氧核糖核酸）、RNA水平上的结构、功能及其相互关（核糖核酸）和蛋白质是分子生系的学科它聚焦于生物大分子物学的三大核心研究对象，这三（主要是核酸和蛋白质）以及它者构成了分子生物学的中心法则们如何在生命过程中相互作用DNA复制、DNA转录为RNA、RNA翻译为蛋白质研究目标揭示生命活动的分子基础，解释生命现象背后的分子机制，并通过对这些机制的干预和操控，实现对生命过程的理解与应用

1.2发展历程11869年弗里德里希·米歇尔首次分离出DNA，称为核素21953年沃森和克里克提出DNA双螺旋结构模型，揭示遗传信息的载体31970年代基因工程技术诞生，限制性内切酶和DNA连接酶的应用开启分子克隆时代41980年代PCR技术发明，彻底革新了分子生物学研究方法52000年后基因组学和CRISPR基因编辑技术等新兴领域发展，推动分子生物学进入新阶段

1.3主要研究领域蛋白质组学基因组学研究生物体内所有蛋白质的表达、结构和功研究生物体基因组的结构、功能和进化能•全基因组测序•蛋白质分离与鉴定•基因组注释12•蛋白质相互作用网络•比较基因组学•翻译后修饰研究分子细胞生物学基因表达与调控研究细胞内分子相互作用与细胞功能研究基因如何被激活和抑制•信号转导•转录因子•细胞周期•表观遗传学•分子运输•非编码RNA调控

2.主要实验技术简介核酸操作技术蛋白质分析技术包括DNA和RNA的提取、纯包括蛋白质提取、纯化、分离、化、定量、电泳分析、杂交、鉴定和功能分析等，Western扩增和测序等技术，这些是分Blot是其中最常用的蛋白质检子生物学实验的基础其中测方法，利用抗体特异性识别PCR（聚合酶链式反应）技术目标蛋白质质谱分析则为蛋因其高效扩增DNA片段的能白质组学研究提供了强大工具力，成为最广泛应用的技术之一基因工程技术包括基因克隆、表达载体构建、基因转移和基因编辑等，这些技术使研究人员能够操控基因，研究其功能CRISPR-Cas9已成为新一代基因编辑的主流技术，因其精确性和高效性而广受关注

2.1基因克隆技术目的基因片段获取通过PCR扩增或酶切等方法获取目标DNA片段，需确保片段两端含有适当的限制性酶切位点，便于后续与载体连接载体制备选择合适的克隆载体（如质粒、噬菌体等），通过限制性内切酶处理，使其产生与目的基因片段相配的粘性末端或平端连接反应使用DNA连接酶催化目的基因片段与载体分子的连接，形成重组DNA分子，这一反应通常在特定的缓冲液中进行转化与筛选将重组DNA导入宿主细胞（通常是大肠杆菌），通过抗生素筛选获得含有重组DNA的克隆，再进行验证确认目的基因的正确插入

2.2PCR技术原理退火250-65°C中温使引物与互补的DNA单链结合，形成引物-模板杂交体变性94-96°C高温处理使双链DNA分离为单链，通常持续30秒至几分钟延伸72°C条件下，DNA聚合酶从引物3端起合成新链，沿模板链5→3方向延伸聚合酶链式反应（PCR）通过上述三个步骤循环进行，每次循环理论上使目标DNA片段数量翻倍通常进行25-35个循环，可将极少量的DNA模板扩增至可检测水平整个反应在热循环仪中自动完成，使DNA扩增成为快速、高效且特异性强的实验技术

2.3Western Blot技术蛋白质提取与分离从样品中提取总蛋白，通过SDS-PAGE胶进行电泳分离转膜将凝胶上分离的蛋白质转移到PVDF或硝酸纤维素膜上抗体结合用特异性抗体识别目标蛋白质显影与分析通过显色或发光方式检测抗体-蛋白质复合物Western Blot是一种强大的免疫印迹技术，用于检测特定蛋白质的表达情况其优势在于特异性高、灵敏度好，可定性乃至半定量分析蛋白质该技术广泛应用于蛋白质表达研究、蛋白质组学、药物筛选和疾病诊断等多个领域

2.4基因测序技术第一代测序第二代测序第三代测序以Sanger测序为代表，通过荧光标记的又称高通量测序或下一代测序NGS，代以PacBio和Oxford Nanopore为代表，链终止法测定DNA序列具有准确度高表技术包括Illumina、Ion Torrent等平能够测序单个DNA分子，产生更长的读的特点，至今仍用于小片段DNA测序和台特点是大规模并行测序，一次可以长验证产生大量数据主要优势是读长长、检测修饰碱基的能原理利用双脱氧核苷酸终止DNA合成核心策略是边合成边测序，利用荧光信力强，能更好地解决复杂基因组区域的链，通过毛细管电泳分离不同长度的号或pH值变化实时监测碱基的加入，实拼接问题，但准确度相对较低DNA片段，并通过激光激发荧光标记进现高通量测序行检测

3.实验安全与规范健康安全至上实验人员健康安全是首要考虑因素遵循实验规范严格按照标准操作程序进行实验熟悉实验材料3了解所使用试剂和设备的特性与危险性规范废弃物处理按类别正确处理各类实验废弃物分子生物学实验涉及多种生物试剂和化学药品，部分具有毒性、腐蚀性或致癌性此外，实验过程中可能接触病原微生物或转基因材料，存在生物安全风险因此，严格遵守实验安全规范不仅关系到实验人员的健康安全，也事关环境保护和实验结果的可靠性

3.1实验室安全须知防护眼镜实验手套消防设备洗眼器处理任何化学品或生物材根据操作类型选择适当的熟悉灭火器、消防毯的位了解洗眼器和紧急淋浴器料时必须佩戴，防止液体手套材质处理苯酚、氯置和使用方法分子生物的位置和使用方法若化溅入眼睛特别是在使用仿等有机溶剂时应使用丁学实验中使用的无水乙醇、学品不慎溅入眼睛，应立紫外线、强酸碱、有机溶腈手套；接触生物材料时甲醇等均为易燃液体，必即使用洗眼器冲洗至少剂等情况下，防护眼镜是应使用一次性乳胶手套；须远离明火，并了解如何15分钟，并寻求医疗帮不可或缺的安全装备避免交叉污染和保护实验应对火灾紧急情况助人员

3.2实验废弃物处理生物废弃物化学废弃物锐器废弃物•含有微生物、细胞或组织的材料•苯酚、氯仿等有机溶剂•包括针头、注射器、载玻片等•需先经高压灭菌处理（121°C，20•强酸强碱等腐蚀性物质•必须放入专用锐器盒中分钟）•分类收集在专用废液桶中•锐器盒装满3/4后密封•灭菌后装入专用的生物废弃物袋•不同类别化学品不可混装•按医疗废物处理流程处置•交由专业机构进行终末处理•定期由专业机构回收处理

3.3个人防护措施基础防护实验服、口罩、手套和防护眼镜是最低要求进阶防护2处理危险材料时增加面罩和特殊防护手套生物安全防护在生物安全柜内操作病原体或转基因材料在分子生物学实验中，个人防护不仅是保护自身安全的措施，也是防止样品交叉污染的重要手段进入实验室时，应先穿戴好实验服和合适的鞋子，然后根据具体实验内容选择适当的防护装备使用超声破碎仪等产生气溶胶的设备时，必须佩戴N95口罩和面罩接触感染性材料或高危试剂（如溴化乙锭）时，需使用双层手套并频繁更换离开实验区域前，应摘除所有防护装备，并彻底洗手消毒任何防护用品出现污染或损坏时，应立即更换

4.实验前准备实验原理学习详细了解实验的理论基础和技术原理，掌握每一步骤的科学依据在进行任何分子生物学实验前，充分理解实验原理能帮助预见可能的问题并采取预防措施实验计划制定设计详细的实验流程，包括时间安排、试剂用量、操作步骤和对照设置良好的计划能够提高实验效率，减少材料浪费，保证实验的顺利进行材料与设备准备提前准备所需的试剂、耗材和仪器设备，检查设备状态和试剂有效期在分子生物学实验中，试剂的纯度和活性对实验结果有着决定性影响预实验验证对关键步骤或新方法进行小规模预实验，验证其可行性并优化条件这一步对于复杂或首次进行的实验尤为重要，可以大大提高正式实验的成功率

4.1实验材料与设备清单基础设备主要试剂实验耗材•离心机（台式和微量）•分子生物学级别水•各种规格移液枪头•PCR仪•各类缓冲液（如TE、TAE、TBE）•微量离心管（

0.2ml、

0.5ml、

1.5ml）•电泳槽与电源•DNA/RNA提取试剂盒•PCR管与PCR板•紫外分析仪•PCR反应组分•一次性手套•分光光度计•限制性内切酶•培养皿与培养管•振荡器•DNA连接酶•无菌接种环•水浴锅•琼脂糖•过滤器与滤膜•恒温培养箱•DNA/RNA染料•转移膜（PVDF、硝酸纤维素）•高压灭菌锅•抗生素•标记笔与标签•超纯水系统

4.2实验流程设计确定研究问题明确实验目的与预期结果设计实验步骤制定详细操作流程与时间表设置对照组包括阳性、阴性和空白对照确定样本数量考虑生物学重复与技术重复良好的实验设计是获得可靠结果的关键在分子生物学实验中，需要考虑多个因素，包括样本类型、实验条件、技术路线和数据分析方法等合理的流程设计不仅能提高实验效率，还能减少试剂消耗和操作失误在实验流程设计中，应当充分考虑可能的变数和风险点，并设置相应的预案例如，在进行长时间实验时，可以设置中间检查点以评估进展；处理珍贵样本时，应当准备备份方案以应对意外情况此外，实验设计还应考虑数据收集和统计分析的需求

4.3预实验与注意事项条件优化方法验证对关键参数进行小规模测试，如PCR验证自行设计的引物特异性、检测方退火温度梯度实验、酶切反应时间优法的灵敏度与准确性、新建立的实验化、抗体稀释比例测定等这些预实方案可行性等特别是使用新方法或验可以帮助确定最佳实验条件，提高改进现有方法时，验证步骤尤为重要，正式实验的成功率和数据质量可以及早发现并解决潜在问题试剂检测测试新批次试剂的活性和效果，包括酶活性测定、抗体特异性验证、培养基适用性检查等试剂质量对实验结果有直接影响，尤其是关键酶类和抗体等生物活性试剂需要定期检测在进行大规模或重要实验前，预实验是不可或缺的步骤通过预实验，不仅可以验证方法的可行性，还能熟悉操作流程，发现并解决潜在问题，从而大大提高正式实验的成功率预实验数据也可以作为正式实验的参考基准

5.DNA提取与纯化细胞裂解使用物理方法或裂解缓冲液破坏细胞膜和核膜，释放DNA去除蛋白质通过蛋白酶K消化或苯酚-氯仿抽提去除蛋白质DNA沉淀加入乙醇或异丙醇使DNA沉淀DNA溶解用TE缓冲液或无菌水溶解DNA沉淀质量检测通过分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和完整性

5.1常见DNA来源微生物DNA植物DNA动物DNA环境DNA来自细菌、酵母等微生物植物组织含有多酚类、多可从血液、组织、毛发、从土壤、水、空气等环境的DNA提取相对简单，因糖等干扰物质，提取时需口腔拭子等多种样本中提样本中提取的DNA，反映细胞壁结构不同，提取方要特殊处理通常选择幼取血液提取常采用柱式环境中微生物群落组成法有差异革兰氏阳性菌嫩叶片作为材料，加入试剂盒，组织样本需先匀提取过程需去除腐殖酸等需要溶菌酶处理，酵母需CTAB、PVP等试剂去除干浆后进行裂解提取的抑制剂环境DNA分析被要解离细胞壁的特殊酶如扰物适用于农业基因组DNA广泛应用于基因诊断、用于生物多样性监测、微裂壁酶处理提取的DNA学、遗传多样性分析、转亲子鉴定、群体遗传学等生物生态学和环境污染评适用于克隆、基因组测序基因检测等研究研究估等研究等研究

5.2DNA提取方法经典提取法盐析法试剂盒法传统的苯酚-氯仿法是最经典的DNA提取盐析法利用高浓度盐溶液使蛋白质变性商业试剂盒通常基于硅胶膜吸附原理，方法之一该方法利用有机溶剂分层分沉淀，而DNA保持溶解状态，随后通过DNA在高盐条件下选择性吸附于硅胶膜，离核酸和蛋白质，然后通过醇类沉淀回醇类沉淀回收DNA经过洗涤后用低盐或水洗脱收DNA•优点不使用有机溶剂，操作简便•优点操作标准化，纯度高，耗时短•优点成本低，适用样本量大，可获•缺点DNA纯度较低，可能含有得高产量RNA污染•缺点成本较高，样本量和产量有限•缺点操作复杂，使用有毒试剂，耗•适用快速提取，如PCR模板制备时长•适用需要高纯度DNA的应用•适用大量样本提取，如基因组提取

5.3纯度与浓度检测紫外分光光度法凝胶电泳法基于核酸在260nm处有最大吸收通过琼脂糖凝胶电泳可以直观评峰的原理DNA纯度通过估DNA的完整性和纯度高分子A260/A280比值评估，理想范围量基因组DNA应显示为清晰的高为

1.8-

2.0；低于

1.8表示蛋白质污位条带，无明显拖尾；降解的染，高于

2.0可能有RNA污染DNA表现为弥散条带或拖尾现象A260/A230比值用于检测多糖、电泳还可以通过与已知浓度的标酚类等污染，理想值大于

2.0准品比较，估算DNA浓度常用DNA浓度计算公式浓度ng/μL染料包括溴化乙锭EB和SYBR=A260×稀释倍数×50Green等荧光定量法使用特异性DNA荧光染料（如Qubit、PicoGreen等）进行定量这些染料只与双链DNA结合并发出荧光，不受RNA、蛋白质、核苷酸等干扰，因此比紫外吸收法更准确特别适用于低浓度DNA样品的定量，检测限可达pg/μL级别缺点是需要专门的荧光计和标准曲线

6.RNA提取与纯化RNase防护1防止RNA降解的关键步骤样本快速匀浆彻底破碎细胞释放RNA有机相分离3区分RNA、DNA和蛋白质RNA沉淀与洗涤获得纯净的RNA样品RNA提取是分子生物学中的关键技术，由于RNA容易降解且结构不稳定，其提取过程比DNA更为复杂和严格RNA提取的主要挑战是防止内源性和外源性核糖核酸酶（RNase）的污染，这些酶极其稳定且广泛存在于环境和生物样本中在进行RNA相关实验前，必须使用DEPC处理的水和无RNase的试剂，并戴无粉手套操作提取得到的RNA通常需要进行DNase处理以去除DNA污染提取的RNA可用于RT-PCR、基因表达分析、RNA测序等多种下游应用

6.1RNA来源与特性总RNA mRNA包含细胞内所有类型的RNA携带编码蛋白质信息的RNA•rRNA占80-85%•具有5帽子结构•tRNA占10-15%1•3端有polyA尾巴•mRNA仅占1-5%•丰度低但信息量大RNA的不稳定性小RNA相比DNA更容易降解4包括miRNA、siRNA等•含2-OH基团易水解•分子量小（约20-30nt）•RNase普遍存在•参与基因表达调控•提取存储需特殊条件•提取需特殊方法

6.2RNA提取方法酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿法硅胶膜柱式提取法磁珠法TRIzol法是最经典的RNA提取方法，基基于RNA在高盐条件下能特异性结合硅利用功能化磁性微球在特定条件下选择于Chomczynski和Sacchi开发的单步酸胶膜的原理样品先用裂解缓冲液处理，性结合核酸的特性样品裂解后，添加性硫氰酸胍-苯酚-氯仿法该法利用硫氰然后加入乙醇调整结合条件，通过离心磁珠与RNA结合，用磁力架分离磁珠-酸胍同时完成细胞裂解和RNase失活，使RNA结合于柱子，洗涤去除杂质后用RNA复合物，洗涤后洗脱RNA苯酚-氯仿混合物分离RNA与DNA和蛋白无RNase水洗脱•优势自动化程度高，可处理多样本质•优势操作简便，无需有机溶剂分离•优势高效回收各种长度RNA，成本•局限回收率可能略低于其他方法低•局限较小RNA（200nt）可能流•适用大规模样本处理和自动化平台•局限操作复杂，需接触有毒试剂失•适用几乎所有类型样本的总RNA提•适用需要快速获得高纯度RNA的情取况

6.3RNA完整性检测琼脂糖凝胶电泳毛细管电泳分析RT-qPCR验证传统的RNA完整性评估方法，基于变性凝胶利用Agilent Bioanalyzer或Bio-Rad通过检测不同长度转录本或基因5端和3端电泳完整的总RNA应显示清晰的28S和Experion等微流控系统进行的高分辨率RNA的比率来评估mRNA完整性这种方法特别18S rRNA条带，28S:18S的亮度比约为2:1分析系统自动计算RNA完整性数值RIN，适用于评估特定转录本的降解情况，但不能降解的RNA表现为弥散的条带或条带下方的范围从1完全降解到10完全完整RIN≥7全面反映样品中所有RNA的完整性，更适合拖尾虽然简便，但这种方法分辨率有限，通常被认为适合大多数下游应用，如RNA-于特定转录本的质量控制且主观性强Seq要求RIN≥8RNA完整性是RNA相关实验成功的关键前提降解的RNA会导致基因表达分析偏差、cDNA库构建失败和RNA测序数据不可靠因此，在进行任何RNA下游实验前，必须进行完整性评估，尤其是对于珍贵或难以重复获取的样本

7.基因克隆技术详解目的基因制备通过PCR扩增、限制性酶切或基因合成获取目标DNA片段PCR扩增需设计含有适当酶切位点的引物；限制性酶切通常从质粒或基因组DNA直接切出目标片段；基因合成则由专业公司根据序列直接合成载体准备选择合适的表达载体或克隆载体，经限制性酶切后处理常用载体有pUC系列、pBR

322、pET系列等载体切割后通常需进行去磷酸化处理，防止自连接，提高重组效率DNA连接将目的基因与载体混合，用T4DNA连接酶催化连接连接反应通常在16°C进行数小时或4°C过夜影响连接效率的关键因素包括插入片段与载体的摩尔比例、DNA纯度和酶活性等宿主转化将重组质粒导入宿主细胞（通常是大肠杆菌）常用的转化方法包括化学转化法和电转化法转化后的菌液涂布在含有选择性抗生素的培养基上，筛选携带重组质粒的克隆阳性克隆筛选通过菌落PCR、限制性酶切分析或测序鉴定含有正确插入片段的克隆筛选后的阳性克隆可进行质粒提取，用于后续实验或保存

7.1载体选择克隆载体表达载体穿梭载体融合表达载体适用于DNA片段的扩增和保用于目的蛋白的表达，含有能在不同宿主细胞中复制的含有标签序列或融合蛋白序存，通常具有高拷贝数和多强启动子和终止子常用的载体，通常含有两种复制起列的表达载体常见标签如克隆位点代表性载体如原核表达载体如pET系列，点如pYES2可在大肠杆菌His标签、GST、MBP和pUC系列、pBluescript，含有T7启动子和lac操纵子，和酵母中复制；pBHR1可在FLAG等，可便于蛋白纯化拷贝数可达500-700/细胞可通过IPTG诱导表达真核大肠杆菌和假单胞菌中复制和检测融合表达还可以提这类载体通常含有抗生素抗表达载体如pcDNA系列，穿梭载体方便在不同宿主中高蛋白的溶解性和稳定性，性基因和蓝白筛选系统，便含有CMV或SV40等强启动进行基因操作和表达，广泛或赋予蛋白特定的功能，如于阳性克隆的筛选子，适合在哺乳动物细胞中用于基因功能研究荧光蛋白标记可用于亚细胞表达外源蛋白定位研究

7.2质粒DNA处理质粒提取限制性酶切DNA纯化从携带质粒的宿主细胞中分离纯化质粒使用限制性核酸内切酶在特定识别序列酶切后需要纯化DNA片段，去除限制性DNA，是基因克隆的第一步常用方法处切割DNA，为后续连接做准备酶、缓冲液和杂质常用方法包括凝胶包括碱裂解法和硅胶膜吸附法回收法和柱纯化法酶切反应需考虑缓冲液、温度、时间等碱裂解法原理是利用不同pH条件下质粒条件双酶切时需确认两种酶的缓冲液凝胶回收法可分离特定大小的DNA片段，DNA和染色体DNA的变性和复性差异进兼容性为提高效率，载体酶切后通常但回收率较低直接柱纯化适用于单一行分离商业试剂盒通常结合碱裂解与需要进行去磷酸化处理，防止自连接片段的纯化，操作简便且回收率高硅胶膜纯化，操作简便且产量高酶切产物应通过琼脂糖凝胶电泳验证，质粒提取应注意避免机械剪切力造成的确认切割完全且片段大小正确纯化后的DNA应测定浓度并进行电泳验DNA断裂，以及RNA和蛋白质的污染证，确保纯度和完整性满足连接反应要求

7.3目的基因插入末端处理根据连接策略对载体和插入片段进行相应处理粘性末端连接需使用相同或兼容的限制性酶切位点；平末端连接则需要对PCR产物进行末端修复浓度计算计算载体与插入片段的最佳摩尔比例，通常为1:3至1:5计算公式插入片段ng=载体ng×插入片段kb÷载体kb×摩尔比连接反应使用T4DNA连接酶催化磷酸二酯键形成反应通常在16°C进行4-16小时，或4°C过夜需要ATP作为能量来源，避免反复冻融无缝克隆新型克隆技术如Gibson Assembly、In-Fusion、SLIC等，可在一步反应中连接多个片段，无需限制性酶切位点，大大提高克隆效率DNA连接是基因克隆的关键步骤，连接效率直接影响克隆的成功率影响连接效率的因素包括DNA末端类型、DNA浓度和纯度、连接酶活性、反应时间和温度等对于难以克隆的片段，可尝试增加载体去磷酸化处理、优化插入片段与载体比例、延长连接时间或使用无缝克隆等新技术

7.4转化与筛选感受态细胞制备制备能够摄取外源DNA的感受态细胞常用方法包括氯化钙法和电穿孔法氯化钙处理使细胞膜通透性增加；电穿孔则通过瞬时电场在细胞膜上形成微孔不同菌株有特定的制备方法和转化效率，如DH5α适合质粒扩增，而BL21DE3适合蛋白表达转化操作将连接产物与感受态细胞混合，使DNA进入细胞化学转化通常需要冰浴孵育、热激和冰浴恢复的过程；电转化则需要去离子水洗涤细胞并使用特定的电转设备转化后通常加入SOC培养基恢复1小时，使细胞修复膜损伤并开始表达抗性基因3转化菌涂板将恢复后的细胞涂布在含有选择性抗生素的琼脂平板上抗生素浓度和类型取决于载体上的抗性基因对于含有蓝白筛选系统的载体，需在平板中添加X-gal和IPTG涂布量需根据预期的转化效率调整，一般为50-200μL阳性克隆鉴定对生长的单菌落进行筛选和验证初筛方法包括蓝白筛选、菌落PCR和限制性酶切分析等蓝白筛选基于β-半乳糖苷酶基因的破坏；菌落PCR直接使用菌落作为模板扩增插入片段；酶切分析则通过提取质粒并进行酶切分析验证插入片段的存在和方向

8.PCR实验流程与优化反应体系配制PCR循环参数设置1准确混合模板DNA、引物、dNTPs、聚合酶优化退火温度、延伸时间和循环数和缓冲液条件优化PCR产物分析调整关键参数以提高特异性和产量通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果聚合酶链式反应PCR是分子生物学中最基础也最重要的技术之一，具有特异性高、灵敏度好、操作简便、周期短等优点一个成功的PCR实验需要精确控制各个环节，包括引物设计、反应体系组成和循环条件等PCR技术已派生出多种变体，如巢式PCR提高特异性，实时定量PCR用于基因表达分析，反转录PCR用于RNA研究，多重PCR同时扩增多个目标，长片段PCR扩增长达数万碱基的片段这些技术扩展了PCR应用范围，使之成为分子生物学实验的核心工具

8.1引物设计原则基本参数特异性考量特殊应用考量•长度通常为18-30个核苷酸•确保引物对模板具有特异性结合位点•克隆引物需添加适当的限制性酶切位点•GC含量保持在40%-60%之间•使用BLAST比对检查引物特异性•实时定量PCR引物产物长度应在80-150bp•5端和中部区域碱基组成均衡•避免引物与非靶序列的同源性•突变引物需在中央区域包含突变位点•3端最好以G或C结尾，但避免连续三•考虑DNA二级结构对引物结合的影响个以上•退火温度可使用公式估算•对于同源基因家族成员，选择差异区域Tm=2A+T+4G+C•引物间Tm值差异应小于5°C设计引物•复杂模板可考虑使用简并引物•避免引物自身形成发夹结构或二聚体

8.2PCR反应体系成分终浓度50μL体系用量功能模板DNA1-10ng基因组1-2μL提供目标序列

0.1-1ng质粒正向引物

0.2-1μM1μL10μM提供DNA合成起点反向引物

0.2-1μM1μL10μM提供DNA合成起点dNTPs各200μM1μL10mM DNA合成原料MgCl₂

1.5-4mM3μL25mM聚合酶辅助因子PCR缓冲液1×5μL10×提供适宜反应环境DNA聚合酶1-

2.5U

0.5μL5U/μL催化DNA合成无菌水-补至50μL调整反应体积PCR反应体系的优化是获得高特异性、高产量PCR产物的关键各组分浓度需根据具体情况调整模板量过多可能导致非特异性扩增，过少则可能扩增失败；Mg²⁺浓度影响聚合酶活性和特异性，需要针对不同引物和模板进行优化；聚合酶的选择应考虑扩增片段长度、保真度要求和抗抑制剂能力等

8.3PCR循环条件初始变性94-98°C，2-5分钟，完全解开双链DNA并灭活核酸酶变性94-98°C，10-30秒，每循环解链DNA退火45-68°C，15-60秒，引物与模板结合延伸72°C，时间取决于片段长度和聚合酶，通常每kb30-60秒最终延伸72°C，5-10分钟，确保所有产物完全延伸PCR循环条件的优化是提高扩增效率和特异性的重要手段退火温度是最关键的参数之一，通常设置在比理论Tm值低5°C左右温度过高会减少产量，过低则可能导致非特异性扩增对于GC含量高的模板，可添加DMSO或甜菜碱等助剂，帮助解开二级结构循环数通常设置为25-35次，过多循环可能积累非特异产物和引入突变，过少则产量不足对于低丰度模板，可采用热启动策略和触摸降落Touch-downPCR技术提高特异性扩增困难模板时，可尝试梯度PCR确定最佳退火温度，或调整反应体系中的Mg²⁺浓度

8.4结果分析与检测琼脂糖凝胶电泳定量分析最常用的PCR产物分析方法通常对PCR产物进行定量有多种方法，使用1-2%的琼脂糖凝胶，浓度根据包括凝胶成像系统可通过与标准目标片段大小调整凝胶中加入核品比较估算产量；分光光度计可测酸染料（如溴化乙锭、SYBR Safe量纯化后产物的浓度；实时定量等）用于可视化DNA条带电泳后PCR可在反应过程中监测产物积累，在紫外或蓝光下观察，特异性PCR并通过标准曲线进行准确定量产产物应显示单一清晰条带，且大小物定量对下游应用如克隆、测序等与预期一致非特异条带、弥散条步骤的成功率有重要影响带或无条带均表明PCR反应需要优化产物验证确认PCR产物的特异性和正确性是必要的质控步骤常用方法包括限制性酶切分析可验证片段内部序列；Southern杂交可检测特定序列；DNA测序是最直接的验证方法，可确定产物序列与预期完全一致对于关键实验，应进行序列验证以排除扩增错误或污染的可能性

9.分子杂交与Southern/Northern Blot分子杂交基本原理Southern与Northern Blot比较分子杂交是利用核酸碱基互补配对原理，使标记的探针与目标核•Southern Blot检测DNA片段，样品经限制性酶切后电泳酸特异性结合，从而检测特定序列杂交过程包括样品制备、变分离性、杂交、洗脱和检测步骤•Northern Blot检测RNA表达，样品需在变性条件下电泳•两种技术共享相似流程样品分离→转膜→杂交→洗脱→检杂交特异性受温度、离子强度、变性剂浓度等条件影响，这些参测数共同决定杂交严格度探针可以是DNA、RNA或寡核苷酸，标记方式包括放射性同位素、荧光染料、生物素等•Southern用于基因诊断、转基因检测等；Northern用于研究基因表达水平分子杂交技术虽在某些应用中已被PCR和测序等新技术取代，但在许多领域仍具有不可替代的作用它能直接检测核酸的大小和数量，无需通过扩增步骤，避免了PCR可能引入的偏差此外，杂交技术还可用于原位杂交，直接在组织切片中定位特定基因的表达位置

9.1原理与流程样品制备Southern Blot基因组DNA经限制性内切酶消化成不同大小的片段；Northern Blot总RNA或mRNA在含甲醛或胍盐的变性条件下处理样品质量直接影响杂交效果，应确保高纯度和完整性电泳分离将处理后的核酸样品在琼脂糖凝胶上进行电泳分离Southern Blot通常使用

0.8-1%的凝胶；Northern Blot使用1-

1.5%的变性凝胶电泳完成后需进行染色和拍照，记录标记物位置转膜通过毛细作用或电转将凝胶上的核酸转移到尼龙或硝酸纤维素膜上转膜前需对DNA进行变性处理（碱变性）转膜效率直接影响检测灵敏度，通常需要进行4-16小时预杂交与杂交预杂交用含封闭剂的杂交液处理膜，减少非特异性结合；杂交加入标记的特异性探针，在适当条件下（温度、离子强度）进行杂交，通常需要12-24小时洗脱与检测洗脱去除非特异性结合的探针，通常采用逐渐增加严格度的洗脱液；根据探针标记方式进行检测，如X射线胶片曝光、荧光扫描或化学发光检测等

9.2实验步骤DNA酶切（Southern Blot）选择合适的限制性内切酶消化基因组DNA酶切反应通常在37°C进行4-16小时，确保完全消化完成后可用EDTA终止反应或直接进行电泳不同酶选择会产生不同的杂交图谱，可根据实验目的和基因特点选择RNA制备（Northern Blot）使用适当方法提取总RNA或分离mRNARNA必须保持完整，避免RNase污染电泳前需在含甲醛的变性缓冲液中处理RNA样品，通常65°C加热5-10分钟变性处理打破RNA二级结构，确保根据分子量线性分离核酸转膜电泳完成后，将凝胶在变性液中处理（Southern Blot），然后使用毛细转膜或真空转膜装置将核酸转移至膜上转膜缓冲液通常为10×SSC或20×SSC转膜后，紫外交联或80°C烘烤2小时固定核酸固定确保核酸牢固结合在膜上，防止后续步骤丢失探针制备与杂交准备标记的特异性探针，标记方法包括缺口平移法、PCR标记、末端标记等预杂交使用含封闭剂（如salmon spermDNA、牛血清白蛋白）的杂交液，42-65°C孵育1-3小时随后加入变性的标记探针进行杂交，通常需要12-24小时杂交温度和缓冲液组成决定了杂交严格度

9.3结果判读分子量分析信号强度解读根据标准DNA/RNA分子量标记物，信号强度反映目标序列的丰度，可通确定杂交条带的大小在Southern过密度扫描进行半定量分析在blot中，条带大小反映限制性酶切片Southern blot中，信号强度可指示段长度，可用于基因结构分析、多态基因拷贝数；在Northern blot中则性检测和突变鉴定Northern blot反映基因表达水平定量分析时需使中，条带大小反映转录本长度，多条用内参基因（如GAPDH、β-actin等）带可能表示存在剪接异构体准确的进行标准化，以校正样品间的加样差分子量分析需要构建标准曲线，将迁异比较不同条件下的表达变化需确移距离与分子量标记物对数值进行拟保处理、杂交和曝光条件一致合常见问题与解决方案高背景信号可能由非特异性杂交、膜封闭不充分或探针纯度不高导致，可通过提高杂交和洗脱严格度、延长封闭时间或优化探针制备解决信号缺失可能由样品降解、转膜不完全、探针特异性差或杂交条件不适当引起，需检查每个实验步骤杂交条带模糊或拖尾常见于电泳和转膜问题，可优化电泳条件或调整转膜参数

10.Western Blot实验详解蛋白质样品制备从细胞或组织中提取总蛋白，加入含SDS和β-巯基乙醇的样品缓冲液，煮沸变性蛋白质提取方法根据样品类型和目标蛋白的亚细胞定位而不同，如RIPA裂解液适用于大多数细胞蛋白，而膜蛋白可能需要特殊的提取方法SDS-PAGE电泳在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，使蛋白质按分子量大小分开凝胶浓度根据目标蛋白分子量选择，通常大分子蛋白选择8-10%凝胶，小分子蛋白选择12-15%凝胶电泳条件一般为恒压80-120V，时间1-2小时转膜将分离的蛋白质从凝胶转移到PVDF或硝酸纤维素膜上常用方法包括湿转和半干转，转膜条件根据蛋白质大小调整，通常为恒流200-400mA，1-2小时，或恒压25V过夜大分子蛋白转膜效率较低，可能需要更长时间或更高电流封闭与抗体孵育用含5%脱脂奶粉或BSA的TBST封闭非特异性结合位点，随后与特异性一抗孵育，经洗脱后再与HRP标记的二抗孵育抗体稀释比例根据抗体效价和蛋白丰度决定，一抗通常在4°C孵育过夜，二抗室温孵育1-2小时显影与分析加入ECL底物，使HRP催化产生化学发光信号，用X光胶片或CCD相机捕获信号信号强度与蛋白质含量近似成正比，可通过图像分析软件进行半定量分析内参蛋白（如β-actin、GAPDH）用于标准化不同样品间的加样量差异

10.1实验流程1样品准备（

0.5-2小时）收集样品→裂解缓冲液处理→匀浆/超声破碎→离心去除碎片→测定蛋白浓度→加入上样缓冲液→煮沸变性电泳分离（

1.5-2小时）配制不同浓度的SDS-PAGE凝胶→装配电泳设备→上样→先低压（80V）浓缩胶电泳→再高压（120V）分离胶电泳→电泳至转膜（1-2小时）指示染料达到胶底平衡PVDF膜（甲醇活化）→按海绵-滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵顺序组装转膜夹→装入转膜槽→冰浴条件下恒流转膜封闭与抗体孵育（过夜+3小时）→Ponceau S染色验证TBST中5%脱脂奶封闭1小时→一抗4°C孵育过夜→TBST洗涤3次→二抗室温孵育1-2小时→TBST彻底洗涤显影与分析（

0.5-1小时）ECL试剂混合→均匀覆盖膜→暗室X光片曝光或化学发光成像系统采集图像→图像分析软件定量

10.2蛋白分离与转膜SDS-PAGE凝胶的选择电泳条件优化转膜技术与参数聚丙烯酰胺凝胶浓度直接影响蛋白质分离效电泳电压和时间需平衡分离效果与热量产生转膜方法根据实验需求选择果，需根据目标蛋白分子量选择•湿转转膜效率高，适合大分子蛋白；•大分子蛋白100kDa6-8%凝胶•浓缩胶阶段使用低电压80V，防止样条件为300-400mA，1-2小时或25V过品扩散夜•中等分子量30-100kDa10-12%凝胶•分离胶阶段可提高至120-150V，但•半干转速度快，耗材少；条件为15-过高电压会产生过多热量导致条带模糊25V，30-60分钟•小分子蛋白30kDa15-20%凝胶•低温电泳4℃有助于提高分辨率，特别•PVDF膜疏水性强，结合能力高，适合梯度凝胶如4-20%适用于分析多种不同分是对于大分子蛋白化学发光检测；需甲醇活化子量的蛋白或未知分子量的蛋白预制凝胶•硝酸纤维素膜亲水性好，背景低，适合虽成本高但节省时间并提供一致性，适合常电泳缓冲液中加入适量SDS和还原剂维持蛋放射性检测；但机械强度低规分析白变性状态，防止蛋白重折叠影响迁移转膜缓冲液中添加10-20%甲醇有助于增强蛋白与膜的结合，但对大分子蛋白可能降低转移效率

10.3抗体孵育与显色封闭步骤膜封闭是减少非特异性背景的关键步骤通常使用5%脱脂奶粉或BSA牛血清白蛋白在TBST中配制封闭液，室温孵育1小时磷酸化蛋白检测应选择BSA而非脱脂奶粉，因奶粉中含有磷酸化蛋白可能干扰检测封闭不足会导致高背景，而过度封闭可能降低特异性信号强度抗体孵育条件一抗稀释比例通常在1:500至1:5000之间，需根据抗体效价和目标蛋白丰度调整一抗孵育时间可选择室温2-3小时或4°C过夜，后者通常获得更好的信号特异性二抗稀释比例通常为1:5000至1:10000，室温孵育1-2小时每次抗体孵育后需用TBST充分洗涤3-5次，每次5-10分钟，以去除未结合抗体检测系统选择化学发光检测是最常用的Western blot检测方法，灵敏度高且可重复检测ECL试剂分为常规灵敏度和增强灵敏度两种，后者适用于低丰度蛋白检测荧光标记二抗系统具有线性范围宽、可进行多重检测的优势，但需要专门的荧光成像设备比色检测（如DAB、NBT/BCIP）操作简便，无需特殊设备，但灵敏度较低且无法重复检测膜再生与复用Western blot膜可通过剥离液stripping buffer处理去除已结合的抗体，用于检测其他蛋白酸性甘氨酸剥离液pH

2.5适用于温和剥离；SDS/β-巯基乙醇剥离液作用强但可能损伤抗原；商业剥离液通常平衡了效率与抗原保护膜再生次数通常不超过3次，每次都会导致一定量的蛋白质丢失，影响信号强度

11.基因编辑技术（CRISPR-Cas9）CRISPR-Cas9系统组成CRISPR-Cas9工作原理CRISPR-Cas9基因编辑系统主要由两个关键组分构成CRISPR-Cas9的基因编辑过程包括以下步骤•Cas9核酸酶能够切割特定DNA序列的蛋白质

1.sgRNA与Cas9蛋白形成复合体•单导向RNAsgRNA包含靶向序列的RNA，引导Cas9到达

2.复合体识别并结合到含有互补靶序列和相邻PAM序列的DNA特定位点区域

3.Cas9在靶DNA双链上产生双链断裂DSB系统还需要PAM序列原型为NGG，这是Cas9识别并切割DNA

4.细胞通过非同源末端连接NHEJ或同源定向修复HDR修复所必需的基序，位于靶序列下游DSB

5.NHEJ通常导致小插入或缺失indels，可造成基因敲除；HDR可在提供修复模板的情况下实现精确编辑CRISPR-Cas9技术因其简便、高效、经济和多功能而迅速成为生物学研究和生物技术应用的主流基因编辑工具相比于之前的ZFN和TALEN技术，CRISPR-Cas9设计更简单，靶位点选择更灵活，且可同时编辑多个位点多重编辑该技术在基础研究、疾病模型构建、作物改良和基因治疗等领域具有广泛应用前景

11.1CRISPR原理靶序列识别DNA双链切割sgRNA引导Cas9结合特定DNA序列，要求下游有Cas9的HNH和RuvC结构域分别切割互补链和非PAM基序互补链编辑验证DNA修复通过测序、T7E1酶切或Surveyor酶确认编辑效果通过NHEJ或HDR途径修复，导致基因敲除或精确编辑CRISPR-Cas9系统源自细菌和古细菌的适应性免疫系统，自然状态下用于防御病毒入侵研究人员将其改造为基因编辑工具，将细菌中的crRNA和tracrRNA融合为单一的sgRNA，极大简化了系统设计和使用sgRNA中约20个核苷酸的引导序列决定了靶向特异性，通过改变这一序列，可以将Cas9引导至基因组中的几乎任何位置除了原始的Cas9蛋白外，研究人员已开发出多种变体，扩展了CRISPR系统的功能例如，Cas9的催化失活变体dCas9可用于基因表达调控、表观遗传修饰和荧光标记；切割活性降低的Cas9变体Cas9nickase可提高编辑特异性；而改变PAM识别特性的变体则扩大了可编辑的目标范围

11.2实验流程sgRNA设计使用在线工具选择高效低脱靶的靶序列，考虑GC含量和特异性评分载体构建将sgRNA序列克隆入Cas9表达载体，或分别制备sgRNA和Cas9细胞转染将CRISPR组分导入目标细胞，可选择质粒转染、病毒感染或核糖核蛋白体RNP递送细胞筛选通过抗生素筛选、流式分选或单克隆分离获得编辑细胞编辑验证通过测序、T7E1酶切、限制性酶切位点丢失或功能分析确认编辑效果CRISPR-Cas9实验的关键在于sgRNA设计和递送方法选择sgRNA设计需考虑靶序列特异性、GC含量40-60%为佳、潜在脱靶位点和邻近PAM位点多种在线工具如CHOPCHOP、CRISPR DesignTool和Benchling可辅助设计过程递送方法则需根据细胞类型和实验目的选择，质粒转染简便但表达持续时间长；病毒感染效率高适合难转染细胞；RNP递送起效快且脱靶效应低

12.总结与展望技术突破与整合1分子生物学技术不断创新与融合应用领域扩展2从基础研究到临床转化与产业应用方法学革新高通量、自动化与智能化方向发展现代分子生物学实验技术已从早期的基础研究工具发展为影响医学、农业、环境和工业的核心技术体系高通量测序技术成本持续下降，单细胞分析方法日益成熟，基因编辑工具更加精准高效，这些技术突破正在重塑生命科学研究范式未来分子生物学实验将进一步向自动化、微型化和集成化方向发展微流控芯片技术将使实验室操作集成到单一芯片上；人工智能辅助设计将优化实验方案和数据分析；合成生物学将创造具有新功能的生物系统这些发展不仅提高实验效率，也为解决人类健康、食品安全和环境保护等重大挑战提供工具作为生命科学研究者，掌握这些核心技术并跟进最新发展至关重要

13.参考文献与致谢经典教材学术期刊与网站•Sambrook J.,Fritsch E.F.,Maniatis T.《分子克隆实验指南》•Nature Methods•Nature Protocols•Watson J.D.等《分子生物学原理》•Journal ofVisualized Experiments•Green M.R.,Sambrook J.《分子克隆实验指南（第四版）》•Current Protocolsin MolecularBiology•Addgene资源中心•李明春《基因工程原理与技术》•NCBI资源数据库•郑晓峰《分子生物学实验技术》特别感谢课程助教团队在实验准备和课程材料整理中的辛勤工作感谢实验室技术人员提供的技术支持和设备维护感谢各位学生在课程进行中的积极参与和宝贵反馈，这些都对课程的不断完善至关重要本课程内容将根据分子生物学领域的最新发展定期更新欢迎同学们通过电子邮件或在线讨论平台提出建议和问题课后实验手册和补充材料可在课程网站下载，实验耗材和试剂清单将在实验课前发放祝各位同学在分子生物学实验中取得成功！。