《分子生物学技术在抗体工程中的应用》课件

分子生物学技术在抗体工程中的应用抗体工程是现代生物医药研究的前沿领域，结合了分子生物学、免疫学和蛋白质工程等多学科技术通过分子生物学技术的应用，科学家们能够设计和改造抗体分子，提高其特异性、亲和力和稳定性本课程将系统介绍分子生物学技术在抗体工程中的广泛应用，从抗体基本结构到前沿工程技术，帮助学生掌握抗体工程的理论基础和实践技能，为未来的研究和产业应用奠定坚实基础课程概述课程目标学习重点本课程旨在帮助学生全面理解重点学习抗体结构与功能、基分子生物学在抗体工程中的应因克隆技术、抗体库构建与筛用，掌握抗体工程的基本原理选、抗体分子改造以及功能性和关键技术，培养学生在抗体抗体设计等核心内容通过理设计与改造方面的实践能力和论学习与案例分析相结合，深创新思维入理解抗体工程的技术原理和应用前景考核方式采用平时作业（）、实验报告（）和期末考试（）相结30%30%40%合的综合评价方式期末考试以开卷形式进行，重点考察学生对抗体工程技术原理的理解和应用能力第一部分抗体工程基础抗体结构与功能详细介绍抗体分子的基本组成和功能区域，为后续工程改造奠定理论基础抗体多样性机制探讨免疫系统产生抗体多样性的分子机制，包括基因重组和体细胞高频突变抗体工程发展历史回顾抗体工程技术的发展历程和重要里程碑，理解当前技术的历史演变抗体结构与功能抗原识别由可变区介导的高特异性结合效应功能通过区域激活补体系统和免疫细胞Fc结构组成由轻链和重链组成的型分子Y抗体分子由两条重链和两条轻链通过二硫键连接形成典型的型结构每条链都包含可变区（区）和恒定区（区），其中区负责抗原Y VC V特异性识别，形成抗原结合位点重链的恒定区决定了抗体的类别（、、、和）和效应功能IgG IgMIgA IgDIgE片段包含完整的抗原结合位点，而片段则负责介导补体激活、吞噬细胞和细胞的结合，执行抗体的效应功能了解抗体的精确结Fab FcNK构对于设计和改造抗体分子至关重要抗体多样性的分子基础重组连接多样性VDJ基因片段随机组合基因片段连接处核苷酸增减2类别转换体细胞高频突变重链恒定区基因替换可变区基因点突变人类免疫系统能够产生数以亿计的不同抗体，这种惊人的多样性主要来源于基因重排过程在细胞发育过程中，抗体基因的可变区由多个基因片段B（、、片段）随机组合形成，这种重组是产生抗体初始多样性的主要机制V DJ VDJ此外，细胞在接触抗原后还会发生体细胞高频突变，进一步增加抗体可变区的多样性，提高抗体的亲和力同时，通过类别转换机制，细胞可以B B在保持相同抗原特异性的情况下，产生不同类型（、、等）的抗体，赋予抗体不同的生物学功能IgG IgMIgA抗体工程的发展历史1年1975和发明杂交瘤技术，首次实现单克隆抗体的体外生产，Köhler Milstein为此获得年诺贝尔生理学或医学奖19842年1986第一个鼠源单克隆抗体药物获批，但由于免疫原性问题，临床应用受限3年代1990噬菌体展示技术由和开发，实现了抗体库的体外筛选，Smith Winter革命性地改变了抗体发现过程4年1997-2000第一批人源化抗体和全人源抗体药物获批上市，标志着抗体工程技术的成熟第二部分分子生物学基本技术核酸操作技术蛋白质表达系统基因克隆与载体构建原核与真核表达系统••技术与引物设计瞬时表达与稳定表达•PCR•测序与基因编辑表达条件优化策略•DNA•蛋白质分析技术纯化与表征方法•结构与功能分析•质谱与生物物理技术•基因克隆技术概述酶切DNA使用限制性内切酶进行特异性切割连接反应连接酶催化连接目的基因与载体DNA转化细胞重组质粒导入宿主细胞筛选鉴定抗生素筛选和验证PCR基因克隆是抗体工程的基础技术，它允许研究人员分离、扩增和操作编码抗体的基因序列该过程通常始于从细胞中提取，通过反转录获得，然后用特异性引物扩增抗体基因选择合适的载体系B mRNAcDNA统对于后续表达至关重要，原核表达系统（如大肠杆菌）操作简便但不能进行复杂的翻译后修饰，而真核表达系统（如细胞）则能更准确地模拟抗体的天然加工过程CHO在抗体工程中，常见的克隆策略包括组装、克隆和克隆等，这些方法可以高效Gibson SLICGolden Gate地构建复杂的抗体表达载体成功的克隆体系为后续的抗体表达和功能验证奠定了坚实基础技术在抗体基因扩增中的应用PCR变性引物退火DNA℃高温断开双链℃引物特异结合9550-65指数扩增延伸DNA目标片段数量倍增3℃聚合酶合成新链72聚合酶链式反应（）是抗体基因扩增的核心技术，特别是在从免疫细胞中获取抗体可变区基因时针对抗体基因的通常需要特殊的引物设计策略，因为抗体基因PCR BPCR家族具有高度多样性研究人员开发了简并引物集（），能够靶向保守框架区域同时扩增多种抗体亚型degenerate primersets对于未知的抗体序列，（快速扩增末端）技术常被用来获取完整的可变区序列实时定量（）则可以用来监测抗体基因的表达水平为了构建抗5RACE cDNAPCR qPCR体文库，需要优化条件以保持序列多样性，同时降低错误率高保真聚合酶（如、）的使用对于减少引入的突变至关重要PCR DNAPfu Q5PCR测序技术DNA测序新一代测序三代测序Sanger NGS基于双脱氧链终止法的经典测序技术，包括、等平台，如和技术，Illumina IonTorrent PacBioOxford Nanopore适用于单个抗体克隆的序列确认精确能同时测序数百万个抗体序列在抗体提供更长读长，有助于全长抗体基因的度高，但通量低，主要用于验证单个抗库分析、细胞受体谱系研究和抗体发现测序分析长读长优势使其能够覆盖完B体克隆的序列正确性中发挥重要作用，为抗体多样性和亲和整的抗体可变区，更准确地解析复杂的力成熟提供全面视图抗体基因重排测序技术对于抗体工程至关重要，它不仅用于确认克隆的正确性，还广泛应用于抗体发现、优化和表征过程通过测序分析，研DNA究人员可以鉴定区的关键残基，追踪体细胞高频突变的过程，以及进行抗体谱系分析CDR测序数据的生物信息学分析同样重要，专门的软件工具（如、）可以帮助注释抗体序列，识别区域，并进行系统IMGT IgBLASTCDR发育分析在抗体工程中，高质量的序列数据是成功设计和优化抗体的基础基因编辑技术靶点识别设计精确定位目标序列sgRNA切割DNA蛋白切割双链Cas9DNA修复DNA通过或修复断裂NHEJ HDR克隆筛选验证编辑效果和功能基因编辑技术，特别是系统，已经成为抗体工程领域的革命性工具与传统的基因敲除技术CRISPR-Cas9（如和）相比，操作更简便、效率更高且成本更低在抗体工程中，这些技术可ZFN TALENCRISPR-Cas9用于改造抗体产生细胞的基因组，例如敲除某些糖基化酶基因以改变抗体的糖基化模式，或在细胞中引CHO入特定的人源化修饰基因编辑还可用于创建转基因动物模型，例如人源化抗体小鼠，其免疫球蛋白基因座已被人源序列替代，能够直接产生人源抗体对于研究抗体基因的功能和调控，筛选系统提供了高通量鉴定关键基因的强大平CRISPR台最新的基础编辑器（）和技术进一步提高了基因编辑的精确性，为抗体工程base editorprime editing提供了更多可能性蛋白质表达系统表达系统优势局限性主要应用大肠杆菌生长快速、成无复杂翻译后抗体片段本低修饰（、）Fab scFv酵母培养简便、分糖基化模式不抗体片段、全泌效率高同于哺乳动物长初筛IgG哺乳动物细胞正确折叠和翻培养成本高、临床级全长抗译后修饰周期长体生产昆虫细胞高表达量、中糖基化与哺乳抗体结构研究、等复杂度修饰动物不同初期筛选蛋白质纯化与表征技术初步纯化亲和层析捕获Protein A/G IgG精细纯化离子交换和分子筛层析提高纯度质量表征、质谱等技术分析纯度和完整性SDS-PAGE抗体纯化通常采用多步骤策略，首先通过或亲和层析实现高特异性捕获这些蛋白可以特异性结合抗体的区域，提Protein AProtein GIgG Fc供高纯度的初步分离随后，离子交换层析可去除带相反电荷的杂质，而分子筛层析则根据分子大小进一步提高纯度，去除聚集体或降解产物抗体表征包括多种技术，和可分析纯度和分子量；质谱分析可精确测定分子量、鉴定翻译后修饰，并检测序列变异；SDS-PAGE Westernblot圆二色谱（）和傅里叶变换红外光谱（）可评估抗体的二级结构；差示扫描量热法（）和示差扫描荧光法（）则用于测定热CD FTIRDSC DSF稳定性这些表征技术对于确保抗体产品的质量和功能至关重要第三部分抗体库构建与筛选技术抗体库构建展示技术平台筛选策略优化利用分子生物学技术构开发噬菌体、酵母、核设计高效的筛选流程和建大规模多样性抗体基糖体等多样化的抗体展策略，通过多轮亲和性因库，包括天然、合成示技术，实现抗体与其选择和功能验证，从庞和半合成库等多种类型，编码基因的物理连接，大的抗体库中富集和分是抗体筛选的物质基础为高通量筛选提供技术离出具有理想特性的候支持选抗体抗体库概述天然抗体库合成抗体库来源于人或动物的免疫细胞，包括免疫库和天然库两种免疫库通过体外基因合成和组装构建，设计者可控制区多样性CDR从接触特定抗原的个体中构建，含有高比例的特异性抗体；天然完全合成库基于抗体框架设计多样化；半合成库则将天然CDR库则从未免疫个体构建，代表自然抗体谱系的多样性天然库的框架与合成结合合成库的优点是可实现超天然的多样性CDR优势在于可获得天然发生的高亲和力抗体，但多样性受限于供体和特定结构特征的设计，但可能缺乏天然抗体的一些优良特性，的免疫历史如良好的溶解性和稳定性抗体库的规模和质量是成功筛选高亲和力抗体的关键现代抗体库通常包含个不同的克隆，需要特殊的文库构建技术10^9-10^11来保证多样性库的质量评估通常包括多样性分析（通过高通量测序）、功能性验证（检测可表达的克隆比例）以及结构完整性分析在抗体工程中，选择合适类型的抗体库取决于具体应用需求对于已知抗原的抗体筛选，免疫库可能是最优选择；而对于难以免疫的靶点或需要完全人源抗体时，合成或天然人源库则更为适合噬菌体展示技术抗体文库维护噬菌体文库制备噬菌体可在低温保存或以质粒形式长期保存噬菌体抗体融合-转化后的菌群被或等辅助噬菌体感染，对于大型抗体库，需要特别注意保持其多样M13fd抗体片段（如或）基因与噬菌体外壳产生携带不同抗体基因的重组噬菌体颗粒性，避免某些克隆的过度生长导致库的偏向scFv Fab蛋白（通常是pIII或pVIII）基因融合，构建这些噬菌体组成了初始文库，每个噬菌体表性库的扩增过程需要控制感染复数（）MOI表达载体转化大肠杆菌后，在噬菌体组装面展示一种特定的抗体，同时内部携带编码以维持多样性过程中，融合蛋白被整合到噬菌体颗粒表面，该抗体的DNA实现抗体表面展示噬菌体抗体筛选策略抗原包被噬菌体孵育靶抗原固定于固相载体抗体库与靶抗原结合特异性洗脱与扩增洗脱非特异结合富集特异性结合噬菌体去除弱结合和非特异噬菌体噬菌体抗体筛选的核心是生物淘选（）过程，通常需要轮筛选才能显著富集特异性抗体筛选策略的设计直接影响筛选效果，包括抗原呈现方式（直接吸biopanning3-5附、生物素化偶联或细胞表面展示）、洗涤条件（、离子强度和去垢剂浓度）以及洗脱方法（酸碱洗脱、竞争性洗脱或酶切洗脱）pH为提高筛选效率，常采用多种策略）交替筛选在不同轮次使用不同形式的抗原，减少对特定表位或构象的偏向；）减少背景通过预吸附去除结合固相载体的噬1-2-菌体；）梯度增加选择压力逐轮减少抗原浓度或增加洗涤强度，筛选更高亲和力的抗体筛选后的阳性克隆通过、表面等离子体共振（）或生物层干涉3-ELISA SPR（）等方法验证其结合特性，为后续抗体工程奠定基础BLI酵母展示技术技术原理与噬菌体展示比较酵母展示技术利用酵母细胞表面的蛋白质展示系统，将抗体片段相比噬菌体展示，酵母展示有几个显著优势）可直接用于流1（通常是）融合到酵母细胞壁蛋白（如）上这种式细胞术筛选，实现单细胞分析和分选；）细胞表面展示抗体scFv Aga2p2融合蛋白通过二硫键与细胞壁相连的蛋白相连，实现抗的折叠环境更接近哺乳动物系统，有利于获得功能性抗体；）Aga1p3体在酵母细胞表面的展示每个酵母细胞可展示约可同时检测抗体表达水平和抗原结合活性，筛选过程更为精准10^4-个相同的抗体分子，大大增强了信号强度其主要局限在于转化效率低，库容量通常限制在10^510^7-10^9范围内酵母展示技术在抗体亲和力成熟中特别有价值通过流式细胞术，研究人员可以定量分析抗原结合信号强度，精确筛选具有所需亲和力的变体多参数分选允许同时考量抗原结合能力、交叉反应性和抗体表达水平等多个因素，获得综合性能更优的候选抗体实际应用中，常见的策略是先用噬菌体展示从大型库中初筛获得特异性抗体，再转入酵母展示系统进行亲和力成熟和精细筛选这种组合策略结合了两种技术的互补优势，提高了抗体发现的效率和成功率核糖体展示和展示mRNA体外转录翻译1转换为蛋白质复合物DNA-mRNA复合物抗原结合-筛选特异性结合的复合物扩增RT-PCR回收编码基因并进行扩增核糖体展示和展示是完全体外的无细胞展示系统，无需细胞转化步骤，能构建超大规模抗体库（可达多样性）这两种技术的核心原理是mRNA10^14建立抗体蛋白与其编码基因之间的物理连接核糖体展示通过冻结翻译复合体（核糖体新生肽链）实现；而展示则通过嘌呤霉素共价连mRNA--mRNA接和新合成的蛋白质mRNA这些技术特别适合抗体亲和力成熟，因为完全体外进化过程不受细胞存活限制，能引入更高突变率同时，筛选条件可精确控制，如温度、、还原环pH境等，有助于获得特定条件下稳定的抗体实践中，核糖体展示已成功应用于多种治疗性抗体的开发，包括抗和抗抗体展示由于TNF-αVEGF mRNA共价连接更稳定，在更苛刻的筛选条件下表现更佳，为抗体工程提供了有力工具细胞展示技术10^610^7哺乳动物细胞表面抗体密度细胞库典型规模B每个细胞可展示的抗体分子数量从人源免疫细胞分离的细胞数量B10^3单细胞分选效率每秒可分析和分选的细胞数FACS细胞展示技术利用真核细胞（如细胞、哺乳动物细胞）表面天然或重组表达的抗体分子进行筛选细B B胞展示利用淋巴细胞天然表达的膜结合抗体（），结合单细胞测序技术，可直接从免疫个体中分离B BCR出高亲和力抗体基因这种方法特别适用于感染性疾病抗体的发现，已成功用于分离多种病毒（如、HIV流感、新冠病毒）的中和抗体哺乳动物细胞展示系统（如或细胞）则通过基因工程将抗体分子锚定在细胞膜上，模拟其HEK293CHO最终生产环境这种系统的独特优势在于抗体在哺乳动物细胞中表达，具有正确的折叠和翻译后修饰，筛选结果更能预测最终产品的性能结合高通量流式细胞仪分选和单细胞测序技术，细胞展示平台已成为抗体发现和工程优化的强大工具，特别适合功能性筛选，如中和活性或介导的细胞毒性ADCC第四部分抗体分子改造技术全人源抗体完全由人源序列组成人源化抗体保留鼠区，其余为人源序列CDR嵌合抗体鼠源可变区与人源恒定区结合基础抗体工程4抗体分子的结构与功能基础嵌合抗体工程嵌合抗体原理构建方法嵌合抗体是抗体工程的第一代产品，它将鼠源单抗的可变区嵌合抗体的构建通常从鼠源杂交瘤细胞提取开始，通过mRNA（和）与人源抗体的恒定区（和）基因重组连接，扩增和区域，然后与人源恒定区（通常是）VH VLCH CLRT-PCR VHVL IgG1形成人鼠嵌合分子这种设计保留了鼠源抗体的抗原结合特异性，基因连接连接方法包括重叠延伸、限制性酶切连接或PCR同时降低了人抗鼠抗体反应（）的风险嵌合抗体中，组装等融合基因随后克隆入哺乳动物表达载体，转染HAMA Gibson大约的序列来自鼠源，来自人源或等细胞系进行表达表达后的嵌合抗体保留原33%67%CHO HEK293鼠抗体的亲和力和特异性90-100%嵌合抗体显著降低了免疫原性，发生率从纯鼠抗体的降至约同时，由于使用人源区，嵌合抗体能更有效地HAMA70-90%40%Fc激活人体免疫系统，增强和等效应功能这对于肿瘤治疗尤为重要，如利妥昔单抗（）通过靶向诱导ADCC CDCRituximab CD20B细胞淋巴瘤细胞死亡虽然嵌合技术是重要进步，但嵌合抗体仍含有大量鼠源序列，部分患者仍会产生抗嵌合抗体反应（）这促使研究人员开发进HACA一步人源化的抗体技术，如嫁接人源化抗体目前，嵌合抗体在临床上仍有重要应用，包括利妥昔单抗（抗）、英夫利昔CDR CD20单抗（抗）等多个获批药物TNF-α人源化抗体技术识别CDR确定鼠抗体的抗原结合区人源骨架选择寻找匹配度高的人抗体骨架嫁接CDR将鼠移植至人骨架CDR回复突变恢复关键骨架区残基人源化抗体是第二代抗体工程产品，它进一步降低了抗体的免疫原性核心技术是嫁接法，即将鼠源抗体中负CDR责抗原识别的区域移植到人源抗体骨架上这种方法使最终抗体中的鼠源序列降至约，显著降低了人抗嵌CDR10%合抗体反应（）的风险但嫁接后常导致亲和力下降，这是由于骨架区（）某些残基也参与抗原结HACA CDRFR合或影响构象CDR为解决这一问题，发展了回复突变策略通过计算机模拟和实验数据，识别对抗原结合至关重要的骨架区残基，将这些位点从人源残基恢复为原鼠抗体残基现代人源化流程通常包括结构生物学分析、同源建模和分子动力学模拟，以优化嫁接和回复突变策略成功的人源化抗体如曲妥珠单抗（抗）和贝伐珠单抗（抗）已CDR HER2VEGF成为临床治疗标准，这类抗体通常具有较低的免疫原性和较长的体内半衰期全人源抗体开发转基因小鼠技术噬菌体人源抗体库小鼠内源免疫球蛋白基因敲除构建大规模（）人源抗••10^10体库大片段人源抗体基因座导入•收集健康人细胞或体外合成序保留小鼠调控元件确保正常表达•B•列免疫后产生高亲和力人源抗体•体外筛选特异性人源抗体•不依赖免疫动物，适用于自身抗•原单细胞克隆技术B从人源细胞直接分离抗体基因•B保留天然配对的重链和轻链•结合单细胞测序高效鉴定抗体•特别适用于传染病抗体发现•抗体片段工程抗体片段工程是抗体技术的重要分支，通过基因工程创造尺寸更小、穿透性更强的抗体衍生物片段（约）由一条轻链和重链Fab50kDa的片段组成，保留完整的抗原结合位点；单链抗体（，约）则通过灵活肽链连接和，形成更小的抗原结合单元；纳米Fd scFv25kDa VHVL抗体（，约）源自骆驼科动物的重链抗体，仅由单个可变区域构成，是目前最小的天然抗原结合结构域VHH15kDa这些抗体片段具有独特优势更小的尺寸使其在肿瘤等致密组织中具有更好的渗透性；缺少区降低了非特异性结合和免疫原性；生产成Fc本较低且可在大肠杆菌中表达然而，它们也面临半衰期短、缺乏效应功能等挑战为解决这些问题，研发了多种改进策略，如修饰PEG延长半衰期、与白蛋白结合域或融合恢复效应功能，以及开发双特异性或多价抗体片段增强功能多样性Fc抗体亲和力成熟多样性产生高通量筛选突变库构建亲和力选择迭代优化克隆鉴定多轮进化表征和验证抗体亲和力成熟模拟了体内细胞亲和力成熟过程，通过体外定向进化提高抗体对抗原的结合能力核心策略包括多样性产生和高通量筛选两个方面多样性产生方法包括B）随机突变使用错误倾向或突变菌株引入随机点突变；）改组将相关序列片段重新组合，如技术；）靶向突变对区进行位点1-PCR2DNA-DNA shuffling3-CDR饱和突变，聚焦于抗原接触位点高通量筛选平台包括噬菌体展示、酵母展示或核糖体展示等技术，通过增加选择压力（如降低抗原浓度、延长洗涤时间或增加竞争性洗脱）富集高亲和力变体现代亲和力成熟还结合了计算机辅助设计，如分子动力学模拟和机器学习算法预测有益突变亲和力成熟可将抗体的解离常数（）从微摩尔级提高到纳摩尔甚至皮摩尔级，显著改KD善药物的有效性和给药便利性许多临床抗体药物如帕妥珠单抗和阿达木单抗都经过亲和力成熟优化第五部分功能性抗体分子设计双特异性抗体能同时识别两种不同抗原的创新型抗体分子，可以桥接细胞与肿瘤细胞，增强免疫系统对癌症的攻击能力T抗体药物偶联物-将细胞毒性药物精确递送到目标细胞的导弹系统，最大化治疗效果同时最小化全身毒性优化抗体Fc通过改造抗体的区域，增强、等效应功能或延长血清半衰期，提高治疗效果Fc ADCC CDC双特异性抗体设计四链双特异性抗体双特异性细胞衔接物T通过旋钮入孔（）技术实现重链异二聚化，通常采用小型双特异性抗体片段设计（如），一端识别knobs-into-holes BiTE®并结合轻链匹配技术（如）确保正确配对这类抗体肿瘤抗原，另一端结合细胞这种设计能有效桥接细胞CrossMAb TCD3T保留完整结构和功能，在体内具有较长半衰期代表性药与肿瘤细胞，激活细胞并诱导肿瘤细胞凋亡代表性药物如贝IgG FcT物包括恩美曲妥珠单抗（针对和）林妥欧单抗（针对和），用于治疗急性淋巴细胞白HER2HER3CD19CD3血病除上述主要格式外，双特异性抗体还有多种创新设计双价双特异性抗体（如）在标准外围添加第二特异性；平DVD-Ig IgGDART®台通过两对域形成稳定的二聚体；则构建四价双特异性分子以增强靶向能力这些不同格式各有优缺点，选择应基VH-VL TandAb®于具体的治疗目标和药物特性双特异性抗体设计面临的主要挑战包括分子稳定性、异二聚体纯度和规模化生产先进的蛋白质工程和生产工艺正不断优化这些参数尽管挑战存在，双特异性抗体仍是当前抗体工程最活跃的领域之一，特别在肿瘤免疫治疗中展现出巨大潜力，能同时靶向免疫逃逸机制、肿瘤微环境和多靶点联合阻断抗体药物偶联物-ADC靶向识别抗体部分特异性识别肿瘤细胞内化过程抗原复合物被内吞入细胞ADC-药物释放连接子在溶酶体环境中断裂细胞毒性释放的药物导致细胞死亡抗体药物偶联物是将强效细胞毒素通过连接子偶联到单克隆抗体上的复合物，实现精准肿瘤治疗的-ADC ADC三个关键组成部分各有特定设计考量抗体部分需高度特异性靶向肿瘤，理想情况下应靶向肿瘤特异性抗原或高表达抗原，并具有良好的内化特性；连接子类型包括可裂解型（对、蛋白酶或还原环境敏感）和不可裂解型，影响pH药物释放方式和全身暴露风险；细胞毒素通常为高效细胞毒性化合物，如微管抑制剂（、）或损MMAE DM1DNA伤剂（卡里奇霉素），其效力比常规化疗药物高倍以上1000设计中的药物偶联比是关键参数，通常在之间，平衡治疗效力与药代动力学特性药物偶联位点选ADC DAR2-4择也很关键，现代技术如位点特异性偶联（通过工程半胱氨酸或非天然氨基酸）能提高的均一性和稳定性目ADC前已有多种药物获批，如曲妥珠单抗用于乳腺癌治疗，技术仍在快速发展，新一代设计ADC-DM1T-DM1ADC聚焦于提高治疗窗口、减少耐药性和扩大适应症范围区工程改造Fc增强增强ADCC CDC通过点突变（如通过靶向突变（如）或糖基化）或糖基化S239D/I332E K326W/E333S改造（无岩藻糖化）增强与修饰增强与结合，提高补C1q结合，显著提高体激活能力这类修饰对依赖FcγRIIIa活性这些改造可将机制的抗体尤为重要，ADCC CDC活性提高倍，可显著提高对表达高水平补体ADCC5-100应用于如莫加霉素单抗等抗肿调节蛋白肿瘤的杀伤力瘤抗体半衰期延长通过增强与结合（如突变）或添加白FcRn M252Y/S254T/T256E蛋白结合域延长血清半衰期这些技术可将抗体半衰期从周延长2-3至周，显著减少给药频率，提高患者依从性4-8新型抗体设计第六部分抗体分子表达与生产下游纯化工艺上游工艺优化开发多步骤纯化流程，包括捕获、中间纯表达系统构建包括细胞培养条件优化、补料策略开发和化和精制步骤，确保产品纯度、安全性和根据抗体类型选择适当的表达系统，设计放大培养工艺建立，目标是提高抗体表达活性高效的下游工艺对于降低生产成本和构建表达载体，建立稳定高效的表达平量并保持产品质量稳定上游工艺的精确和提高产品质量至关重要台作为治疗性抗体的生产基础，表达系控制是产业化生产的核心环节统的选择直接影响产品质量和产量瞬时表达系统1载体设计2转染优化优化抗体基因表达载体，包括针对或细胞系统HEK293CHO选择强启动子（如或优化转染条件，包括浓度CMV EF-DNA）、增强子和多顺反子元件（通常）、转1α

0.5-

1.5μg/mL（如），以及优化信号染试剂比例、细胞密度（WPRE1-肽和密码子，提高表达效率×）和转染时间窗210^6/mL对于双链抗体，可采用肽或口、脂质体和电转染是常2A PEI元件在单一载体中表达重用方法，其中聚乙烯亚胺（）IRES PEI链和轻链因成本效益高而广泛用于大规模转染表达增强通过添加转录和翻译增强剂如丙酸钠（）、缬氨酸（）3-5mM1-3mM或使用特殊的喂养培养基提高表达量温度降低（通常至°）和渗32C透压调节也能延长细胞存活时间并增加产量表达时间通常为天，7-14根据产量动态和细胞活力确定最佳收获时间稳定细胞株开发1载体构建设计含选择标记（如新霉素、潮霉素或）的表达载体，并加入位点特异DHFR性整合元件（如或）以提高整合效率和位点特异性Flp-In CRISPR转染与选择转染后施加选择压力（如或），逐渐筛选获得稳定整合抗体基因的G418MTX细胞选择过程通常持续周，根据抗性标记和表达系统调整选择剂量2-4单克隆分离通过限制稀释、分选或系统分离单克隆细胞，确保细胞株的遗FACS ClonePix传均一性现代平台可高通量筛选数千个克隆，显著提高开发效率克隆评估基于生长特性、表达量和产品质量综合评估克隆，选择最优细胞株进行细胞库建立深度表征包括基因拷贝数、整合位点和转录水平分析发酵工艺与放大培养批次培养补料批次培养一次性加入全部培养基和细胞定期或连续添加营养物质••随培养进行消耗营养，积累代谢、溶氧等参数实时监控••pH产物延长培养周期，提高细胞密度•操作简单，但产量受限于营养消•产量可达•5-10g/L耗产量通常为•1-2g/L灌流培养连续添加新鲜培养基并去除废液•通过膜过滤或离心保留细胞•维持高细胞密度，连续收获产品•产量可超过月•25g/L/下游纯化工艺捕获纯化亲和层析高效特异性捕获抗体Protein A中间纯化离子交换色谱去除宿主细胞蛋白和DNA精细纯化3疏水相互作用色谱和病毒过滤确保最终纯度抗体下游纯化工艺是确保产品质量和安全性的关键环节典型的纯化流程包括多个步骤，每个步骤有特定的质量目标捕获阶段主要采用亲和Protein A层析，能在一步中获得的纯度，同时去除大部分培养基组分和细胞碎片操作条件优化关注结合容量、洗脱和柱再生等参数，以平衡产量和90-95%pH纯度中间纯化阶段常采用阳离子交换和阴离子交换层析，去除残留宿主细胞蛋白、和病毒，纯度可提高至精细纯化阶段则使用疏水相互作用色谱DNA98%或分子筛层析进一步去除聚集体和降解产物此外，病毒灭活（通过低处理或病毒过滤）和除病毒步骤（如纳滤）是确保生物安全性的必要环节现pH代纯化工艺强调连续加工和单次使用系统，以提高效率、降低成本并保证批次一致性第七部分抗体功能评价技术结合活性分析效应功能评价稳定性研究通过各种生物物理和免采用细胞实验评估抗体通过物理化学和生物学疫学方法评估抗体与靶介导的免疫效应功能，方法评估抗体在各种条抗原的结合特性，包括如、和件下的稳定性，包括热ADCC CDC特异性、亲和力和结合活性，这些功能稳定性、稳定性和长ADCP pH动力学，这是抗体基本对于治疗性抗体的临床期保存稳定性，这直接功能的核心评价指标疗效具有重要影响关系到抗体药物的质量和有效期体内功能评价在动物模型中研究抗体的药代动力学、药效学和毒理学特性，为临床应用提供重要依据，是抗体从实验室到临床的关键过渡环节抗体结合活性分析技术生物层干涉表面等离子体共振ELISA BLI SPR酶联免疫吸附测定是最常用的抗体结合技术基于白光干涉原理，通过测量光是研究分子相互作用动力学的金标BLISPR检测方法，包括直接、间接波长移动来检测分子结合优势在于实准，通过测量金属表面等离子体共振角ELISA和竞争等形式该技术操时检测、无需标记、样品消耗少，并可变化检测分子结合等系统能提ELISA ELISABiacore作简便、灵敏度高（可检测级抗体），同时分析个样品典型应用包括亲供极为准确的结合动力学参数，包括亲pM8-16适用于大批量样品筛选然而，和力测定（提供、和值）和表和力、结合和解离速率以及热力学数据ELISA kakd KD提供的是半定量结果，且受制于抗原固位分析仪器如系统广对样品纯度要求高，适用于深入表FortéBio OctetSPR相化可能导致的构象变化高通量泛用于抗体工程，特别适合筛选阶段的征抗体抗原相互作用，是抗体优化和质-可同时处理数百个样品，是抗体快速亲和力排序量控制的重要工具ELISA筛选的首选方法抗体效应功能评价51Cr3-5h放射性测定典型反应时间ADCC ADCC使用标记靶细胞的经典方法细胞介导的细胞杀伤持续时间51Cr NK30%抗体浓度变异不同抗体批次间的典型变异EC50抗体依赖性细胞介导细胞毒性是许多治疗性抗体的关键作用机制传统测定使用ADCC ADCC释放法，近年来非放射性方法如释放和荧光染料释放逐渐普及为提高试验重现性，工程51Cr LDH化效应细胞如和被广泛应用，这些细胞表达特定受体并产生可测量的NK-92Jurkat-NFAT-Luc Fc报告基因信号活性与抗体的糖基化模式密切相关，糖基化分析是潜力评估的重要补ADCC FcADCC充补体依赖性细胞毒性测定评估抗体激活补体系统的能力，通常通过测量靶细胞裂解释放的酶活CDC性或染料亚细胞分子水平活性可通过或结合实验评估抗体依赖性细胞吞噬作用CDC C1q C3b则使用荧光标记靶细胞与单核细胞巨噬细胞共培养，通过流式细胞术或荧光显微镜定量吞噬ADCP/率这些效应功能测定对于预测抗体体内活性、指导优化和确保批次一致性至关重要Fc抗体稳定性研究稳定性评价聚集倾向性分析pH在不同条件下（通常）考察通过、或等技术pH pH3-8SEC-HPLC DLSAUC抗体的稳定性和功能保留这对于抗体评估抗体在不同条件下形成聚集体的倾在胃肠道环境或内涵体溶酶体内的稳定向抗体聚集是主要的不稳定形式，可/热稳定性分析性评估尤为重要稳定性研究包括能导致免疫原性增加和活性降低通过长期稳定性研究pH光谱、荧光光谱和活性保留测定等方优化配方（如添加表面活性剂、糖类或CD通过、或光散射技术测定抗体在预定储存条件（如°）和加速DSC DSF2-8C法氨基酸）可减少聚集的热转变温度（）和聚集特性条件（如°、°）下监测抗体Tm Tm25C40C值通常在°范围，高值通质量变化指标包括含量、聚集体、碎65-85C Tm常预示更好的储存稳定性对于多结构片、电荷变体和生物活性这些数据用域蛋白如抗体，可区分不同结构域于确定产品架期和储存条件，通常需要DSC的熔融过程年的实时稳定性数据1-3体内功能评价第八部分抗体工程临床应用抗体工程技术已在多领域取得突破性临床应用在肿瘤治疗中，从早期的抗抗体到现代的免疫检查点抑制剂和药物，抗体CD20ADC疗法已成为癌症治疗的重要支柱自身免疫疾病领域，抑制剂等抗体药物彻底改变了类风湿关节炎等疾病的治疗格局TNF-α感染性疾病治疗中，抗体药物展现出对抗病毒和细菌感染的潜力，特别是在大流行期间，多种单克隆抗体获得紧急使用授COVID-19权诊断和检测应用方面，抗体是免疫组化、免疫荧光和快速诊断试剂的核心组分，在疾病诊断和研究中发挥不可替代的作用肿瘤靶向治疗肿瘤抗原识别针对肿瘤特异性或高表达抗原开发靶向抗体免疫检查点阻断解除肿瘤免疫逃逸，恢复细胞抗肿瘤活性T效应功能激活通过、等机制直接杀伤肿瘤细胞ADCCCDC靶向药物递送精准递送细胞毒素至肿瘤部位ADC自身免疫疾病治疗炎症因子中和抗体细胞清除抗体B这类抗体靶向关键炎症细胞因子如、和等，阻通过靶向等细胞表面标志物，这类抗体可选择性清除细TNF-αIL-6IL-17CD20B B断其与受体结合，中断炎症级联反应代表药物包括英夫利昔单抗胞，减少自身抗体产生和抗原呈递利妥昔单抗是首Rituximab、阿达木单抗和托珠单抗个获批用于自身免疫疾病的细胞清除抗体，主要通过和Infliximab AdalimumabB CDC等，广泛应用于类风湿关节炎、银屑病和炎症性肠机制发挥作用奥法图单抗和奥比妥珠单Tocilizumab ADCCOfatumumab病等疾病研究显示，的患者对抗治疗有良好反应，抗等新一代抗抗体通过优化提高了效60-70%TNF ObinutuzumabCD20Fc但长期使用可能导致免疫抑制相关并发症应功能，在系统性红斑狼疮和多发性硬化症等疾病中展现良好疗效细胞调节抗体如阿巴西普靶向通路，阻断细胞活化所需的共刺激信号，主要用于对常规治疗反应不佳的类风湿关T AbataceptCTLA-4T节炎患者补体调节抗体如依库珠单抗阻断补体激活，防止膜攻击复合物形成，在阵发性睡眠性血红蛋白尿症和非典型Eculizumab C5溶血性尿毒症综合征中显示显著疗效自身免疫疾病抗体设计面临的主要挑战包括长期安全性、免疫原性和治疗耐药性新一代抗体设计聚焦于更精准的免疫调节、减少全身免疫抑制，以及开发双特异性抗体同时靶向多个炎症通路联合用药策略和生物标志物指导下的个体化治疗也是当前研究热点感染性疾病治疗病毒中和抗体细菌毒素靶向抗体针对病毒表面蛋白开发的抗体，能阻断病毒与宿主细胞受这类抗体靶向细菌产生的毒素而非细菌本身，中和毒素的体结合或抑制膜融合过程，防止病毒入侵细胞在致病作用贝兹洛妥单抗是首个获批用bezlotoxumab疫情中，巴尼韦单抗依替韦单抗于预防艰难梭菌感染复发的抗毒素抗体，它通过结合梭菌COVID-19/和卡西瑞韦单抗伊美珠毒素防止其损伤肠上皮这种策略不直接杀灭细菌，因bamlanivimab/etesevimab/B单抗等中和抗体通过靶向此不会导致耐药性，为抗生素时代后的感染治疗提供新思casirivimab/imdevimab刺突蛋白受体结合域，显著降低了高风险路SARS-CoV-2患者的住院率和死亡率诊断与体外检测应用免疫组化抗体体外诊断试剂成像抗体探针免疫组化使用特异性抗体检测组织切片抗体是、侧流免疫层析和化学荧光标记抗体广泛用于细胞和组织成像，而放IHC ELISALFIA中的抗原，是病理诊断的基础工具抗体发光免疫测定等体外诊断技术的核心射性核素标记抗体则用于体内分子成像如IHC CLIA需要高特异性和适当的亲和力，以在固定组织组分工程化抗体提高了诊断灵敏度和特异性，和体内成像要求抗体具有高组PET SPECT中识别目标抗原工程化抗体片段如和如通过亲和力成熟提高检测限，或通过特异性织渗透性和适当的清除速率，因此经常使用工Fab由于尺寸小，组织渗透性更好，在某些优化减少交叉反应对于即时检测，程化抗体片段如或纳米抗体这些小型scFv POCTscFv应用中优于完整抗体稳定性尤为重要，抗体工程可增强抗体在探针能快速靶向组织并从非靶组织清除，提供IgG干燥状态和室温下的稳定性更高的信噪比第九部分抗体工程前沿技术与未来方向90%106预测准确率虚拟筛选效率AI顶级模型预测构象的准确度计算方法可同时评估的抗体变体数量AI CDR个月3开发周期缩短辅助设计平均减少的抗体优化时间AI抗体工程正迎来人工智能和计算设计的革命机器学习算法能从大规模抗体序列数据中学习模式，预测结构功能关系，辅助抗体优化等系统在抗体结构预测领域取得突破，大幅提高了结构-AlphaFold AICDR预测的准确性，为基于结构的抗体设计铺平道路这些技术允许科学家在实验室测试前，在计算机中虚拟筛选和优化数百万个抗体变体与此同时，新型抗体工程平台如细胞免疫疗法整合、多特异性抗体技术和抗体核酸偶联物正在拓展抗体-治疗的边界这些前沿技术不仅扩展了抗体的功能，还提高了靶向特异性和治疗效果人工智能与实验技术的结合正加速抗体从设计到临床的全过程，预示着更加个性化、精准的抗体治疗时代即将到来人工智能与计算设计结构预测等系统能从抗体序列预测其三维结构，特别是的环AlphaFold AIchallenging CDR-H3结构这些算法整合了深度学习、进化信息和物理化学原理，预测精度已接近实验结构这种准确预测使基于结构的抗体设计成为可能，允许科学家在原子水平优化抗原抗体-相互作用超过的顶级制药公司已将结构预测整合到抗体开发流程中80%AI序列优化机器学习算法可分析抗体序列功能关系，预测特定突变对亲和力、稳定性和可生产-性的影响这些模型训练数据来自大规模抗体库筛选和高通量测序结果，能捕捉复杂的序列模式生成式可设计全新抗体序列，满足多种性能要求与传统定向进化相AI比，指导的抗体优化可减少的实验工作量，大幅缩短开发周期AI50-90%虚拟筛选分子对接和分子动力学模拟可在计算机中模拟抗体抗原相互作用，筛选潜在候-选物新一代增强的虚拟筛选可同时评估数百万个抗体变体，预测结合能量和AI动力学特性这些方法特别适用于难以表达或危险的靶点，如病毒表面蛋白在大流行期间，虚拟筛选技术加速了中和抗体的发现，为未来疫情应对COVID-19提供范例新型抗体工程平台细胞免疫疗法整合多特异性抗体新平台抗体衍生物在和等细胞免疫疗法中发挥关键作用创新的多特异性平台如、和突破了传CAR-T TCR-T DuoBodyBEATκλ-body结构中的抗原识别域通常来自，其亲和力、特异性和统设计限制，实现高产量、良好稳定性和可控效应功能三特异CAR scFv稳定性直接影响疗效新一代设计使用调节型抗体性和四特异性抗体通过同时靶向多个通路，提供更精细的免疫调CAR-T CAR域或可切换抗体适配器，实现精确控制细胞活化这种方法能控最新平台如允许单一分子整合抗肿瘤、T CrossMAb-DutaFab减轻细胞因子释放综合征等副作用，扩展细胞疗法的安全治疗窗免疫调节和穿透血脑屏障等多重功能，为复杂疾病提供一物多口用的治疗策略抗体核酸药物偶联技术将抗体与、或系统结合，实现精准基因调控这类结合物利用抗体的靶向能力将核酸-siRNA miRNACRISPR药物递送至特定细胞，克服了核酸药物递送的主要障碍早期临床数据显示，这种方法可显著提高核酸药物的组织特异性和治疗指数，开辟基因治疗新途径此外，基于抗体的基因治疗递送系统如抗体融合物正在开发中，这些分子可跨越生物屏障（如血脑屏障），将基因治疗载体精AAV-确递送至难以到达的组织这些新型平台不仅扩展了抗体的应用范围，更代表了精准医学的未来方向，为难治性疾病提供个性化治疗选择总结与展望个性化抗体治疗基因组学指导下的精准治疗多功能抗体平台2整合多种治疗模式的综合性分子辅助设计AI计算平台加速抗体发现与优化核心技术基础4抗体工程的分子生物学技术体系本课程全面介绍了分子生物学技术在抗体工程中的应用，从基础的抗体结构与功能，到核心技术如基因克隆、、测序、表达系统和抗体库构建，再到高级应用如PCR抗体改造、功能性抗体设计和临床前评价这些知识和技术构成了现代抗体工程的坚实基础，支撑着抗体药物从实验室到临床的全过程展望未来，抗体工程将朝着更加个性化、智能化和多功能化方向发展与实验技术的深度融合将大幅提升抗体设计效率；多特异性和可编程抗体将提供更精准的免AI疫调控；抗体与细胞疗法、基因治疗的结合将开辟治疗新领域随着这些前沿技术的发展，抗体工程将继续引领生物医药创新，为人类健康做出更大贡献作为未来的研究者，掌握这一领域的核心技术和前沿动态，将使你能参与这一激动人心的科学革命。