《光学显微镜样品的制备》课件

光学显微镜样品的制备微观世界是一个充满奥秘的领域，而光学显微镜样品制备则是打开这扇神奇之门的钥匙正确的样品制备技术直接影响观察结果的准确性和可靠性，是显微分析的基础和前提随着科技的不断进步，2025年最新制备技术与方法不仅提高了样品的质量，还扩展了显微观察的应用范围本课程将系统介绍光学显微镜样品制备的原理、方法及实践技巧，帮助您掌握这门精细的实验技术课程概述基础制备原则与工具探讨样品制备的基本理论和必备工具装备常见样品制备流程详解各类样品从固定到封片的完整制备过程特殊材料处理方法针对植物、动物组织及硬质材料的专门处理技术专业染色技术介绍常见染色方法及其在不同样品中的应用质量控制与常见问题样品制备质量评价及问题解决方案光学显微镜简介工作原理与基本构造分辨率与放大倍数光学显微镜利用光学镜片系统受光的波长限制，光学显微镜放大样品图像，主要由目镜、的分辨率极限约为

0.2μm，物镜、调焦系统和照明系统组最高有效放大倍数通常在成透射光通过样品被物镜收1000-1500倍之间超过这集并放大，再经目镜进一步放一范围的放大将不会提供更多大后被观察者看到细节信息适用范围与局限性适合观察细胞、组织等微观结构，但无法观察病毒等更小的物体样品必须足够薄以允许光线透过，且必须经过特殊处理以提高对比度，这就是样品制备的关键所在样品制备的重要性准确性保障直接影响观察结果的真实性防止假象产生避免制备过程引入的人为误差提高仪器性能发挥使显微镜达到最佳工作状态确保实验可重复性标准化的制备是科学研究的基础样品制备质量直接决定了观察结果的可信度不良的样品制备可能导致伪影和假象，使研究者得出错误的结论掌握专业的制备技术，是显微镜观察的必备基础第一部分基础制备原则代表性原则适宜厚度原则样品必须能够代表整体特征，避免选择偏差制备过程应尽量保样品厚度应适合光线透过，通常在2-25μm之间过厚会影响光持样品的原始状态，减少人为干扰和变形线透过导致图像模糊，过薄则可能损失结构信息对比度原则完整性原则通过染色或其他处理增强样品与背景的对比度，使结构清晰可在制备过程中保持组织结构完整，避免撕裂、变形或收缩固辨不同的研究目的需要选择不同的增强方法定、脱水等步骤必须精确控制以维持原始形态制备前的考虑因素化学性质形状与大小样品的化学稳定性、溶解性和对固定剂的反应性是选择处理方案样品的原始形态影响取样位置和的重要依据某些化学物质可能方向体积过大的样品需要适当与染色剂发生反应或影响固定效切割成适合大小，以便后续处物理性质研究目标果理标准尺寸一般不超过1cm³样品的硬度、韧性和脆性将决定明确观察重点和研究目的，针对切片方法的选择硬质材料可能性选择制备方法例如，细胞形需要研磨或特殊切割设备，而软态研究与组织结构观察可能需要质样品则适合常规切片技术不同的制备技术和染色方案样品选择原则代表性确保选取的样本能充分代表整体特征完整性包含完整的组织或结构特征纯净性避免外来污染与物理损伤原始性最大程度保持样品的原始结构与状态样品选择是制备过程的第一步，也是确保研究结果可靠性的关键环节科研人员应当在取样前对研究对象有充分了解，并根据研究目的选择最具代表性的部位在某些情况下，可能需要从多个位置取样以获得全面信息基本工具与设备载玻片与盖玻片标准载玻片尺寸为25×75mm，厚度约1mm；盖玻片通常为18×18mm或22×22mm，厚度

0.13-

0.16mm质量好的玻片应无气泡、划痕，透明度高，表面平整切片工具包括解剖刀、解剖剪、镊子、切片刀等切片机是制作标准厚度切片的专业设备，根据样品类型可选用旋转切片机、滑走式切片机或冰冻切片机化学试剂包括固定剂（甲醛、戊二醛等）、脱水剂（乙醇系列）、染色剂（苏木精-伊红、甲基蓝等）以及透明剂（二甲苯）和封片剂（中性树胶）实验室安全注意事项化学试剂安全处理甲醛、二甲苯等有毒试剂时，必须在通风橱内操作，佩戴防护手套、口罩和护目镜所有试剂均应贴有清晰标签，严格按照安全说明使用和存放废弃物处理化学废液需分类收集，不得随意倾倒含有有机溶剂的废液应存放在专用容器中，交由专业机构处理染色废液、固定剂废液等均需单独收集，不可混合锐器使用使用切片刀、解剖刀等锐器时，动作应稳妥，方向远离身体废弃的刀片需放入专用锐器盒，切勿直接丢入普通垃圾桶，以防清洁人员受伤个人防护实验过程中必须穿着实验服，长发应束起接触化学品后及时洗手，避免交叉污染实验室内禁止饮食，以防意外摄入有害物质载玻片处理洗涤中性洗涤剂浸泡2-4小时，除去油脂清洗自来水冲洗后超声清洗10分钟脱水95%酒精浸泡5分钟去除水分烘干60℃烘箱干燥30分钟后无尘保存载玻片的清洁度直接影响观察效果和染色质量处理后的载玻片应无水痕、无油污、透明度高对于特殊实验，可进行表面处理，如涂布明胶、多聚赖氨酸等，增强切片附着力处理好的载玻片应存放在干燥清洁的载片盒中，避免灰尘污染第二部分常见样品制备方法切片法将样品切成厚度为2-25μm的薄片，使光线能够透过根据样品类型和研究需求，可选择手工切片、冷冻切片或石蜡切片等不同技术这是最常用的制备方法，适用于大多数组织样本整体封片法将体积较小的完整样品直接封片，无需切片处理适用于微小生物体、昆虫等小型标本或某些单细胞生物此方法保持了样品的三维结构，但观察时需注意聚焦深度涂片法将液体样品均匀涂布于载玻片上，适用于血液、微生物悬液等此方法简便快捷，可以快速获得单层细胞，便于观察细胞形态和结构细节压片法将样品直接压扁于载玻片和盖玻片之间适用于某些植物组织、昆虫翅膀等较薄的样品操作简单，但容易导致样品结构变形，需谨慎使用制片法分类切片法整体封片法涂片法将样品切成2-25μm厚的薄将小型完整样品直接封入透将液体样品均匀涂抹在载玻片，使光线能透过根据样明介质中，适用于原生动片上形成薄层，适用于血品类型和制备目的，可选择物、小型昆虫等优点是能液、细菌悬液等操作简便手工切片、冷冻切片或石蜡保持样品的完整三维结构，快捷，但仅适合液态或易悬切片等技术切片后通常需但样品必须足够透明或小浮的样品，且可能造成细胞要染色以提高对比度型变形压片法在载玻片和盖玻片之间直接压扁样品操作简单，适用于鳞片、薄叶等样品缺点是可能破坏样品原始结构，不适合精细观察切片法详解适用材料范围设备与工具要求切片法几乎适用于所有需要微观观察的组织样本，包括动物组基本设备包括切片机、切片刀、水浴箱和烘箱等根据样品特性织、植物组织和某些固体材料不同硬度的样品可能需要不同的和实验要求，可选择不同类型的切片机预处理方法，如软化或硬化处理•旋转切片机适用于石蜡包埋样品对于含水量高的样本，通常需要固定和脱水；对于硬度较大的样•滑行式切片机适用于较硬材料本，可能需要脱钙或软化处理；而特别脆弱的样本则需要包埋增•冷冻切片机适用于需要保持酶活性或脂溶性物质的样品强支持•超薄切片机用于电镜样品制备，切片厚度可达70-100nm切片质量直接影响观察效果，关键控制因素包括刀片锋利度、切片速度和厚度设置理想的切片应厚度均匀、无皱褶、无撕裂，且能完整保留组织结构手工切片技术工具准备准备锋利的刀片或刀具、载玻片、水滴、染色液和封片剂刀片必须充分锋利，可使用剃须刀片或专用切片刀同时准备吸水纸和镊子辅助操作样品固定将样品放在手掌或适当支持物上固定对于植物材料，可使用胡萝卜或泡沫塑料作为支持；对于较小样品，可夹在两片软木或石蜡块之间固定必须稳固但不能过度挤压样品切片操作保持刀片与样品表面呈30°角，用连续流畅的动作切取薄片手持刀片的手臂应保持平稳，利用手腕和前臂的力量而非手指力量进行切割切片厚度应尽量均匀，通常在10-20μm之间切片转移用毛笔或镊子将切片轻轻转移到盛有水或固定液的培养皿中，然后选取质量好的切片转移到载玻片上，进行染色和封片处理转移过程需小心操作，避免切片卷曲或破损冰冻切片技术优势与适用范围冰冻切片技术能保持样品中的酶活性和脂溶性物质，避免有机溶剂对样品的破坏特别适用于需要进行酶组织化学、免疫组织化学研究的组织样本此外，该技术制备速度快，可在短时间内获得结果，适合术中快速病理诊断设备与材料要求主要设备为冰冻切片机，包括低温箱和切片系统常用的冷冻剂包括液氮、干冰-丙酮混合物或气雾式冷冻剂样品支持物通常使用OCT包埋剂（Optimal CuttingTemperature compound），它在低温下凝固形成支持基质温度控制关键点切片温度通常设置在-15°C至-25°C之间，具体温度根据组织类型调整脂肪含量高的组织需更低温度（约-25°C），而普通组织约-20°C室温与切片室温度差异过大可能导致切片开裂，应控制实验室环境温度常见问题与解决方案切片卷曲常由温度过低引起，可适当提高温度；切片破碎可能是因为样品未完全冷冻或温度过低，调整冷冻时间和温度；气泡问题通常由OCT中的气泡引起，包埋时应注意避免石蜡切片工艺固定10%福尔马林固定24-48小时，体积比1:102脱水70%-100%乙醇梯度脱水，每级1-2小时透明二甲苯处理2-4小时，直至组织透明浸蜡58-60℃熔融石蜡浸泡4-8小时包埋将样品置于合适位置，倒入熔融石蜡切片切片厚度4-8μm，带状切片贴片水浴展片后粘附于载玻片染色HE染色或特殊染色技术石蜡切片是最常用的组织学制片方法，优点是操作相对简单，切片均匀，保存时间长关键参数控制包括固定时间、脱水充分性、透明程度和浸蜡时间等常见问题如切片起皱、破裂或石蜡未完全渗透等，通常由脱水不彻底或浸蜡时间不足引起整体封片法样品准备固定选择完整、适当大小的标本，必要时进行使用适合的固定剂（如70%乙醇或甲醛前期固定和清洁处理溶液）将样品彻底固定封片清洗将样品置于载玻片中央，滴加封片剂后用清水或缓冲液充分洗涤，去除多余固盖上盖玻片定剂脱水染色乙醇梯度（30%-100%）逐级脱水，每根据观察目的选择适当染色剂进行整体染级15-30分钟色整体封片法适用于体积小、结构完整的样品，如原生动物、小型寄生虫、昆虫幼虫或植物微小器官等这种方法的优势在于保持了样品的完整三维结构，但要求样品有足够的透明度或厚度足够小，以便光线透过涂片法技术样品准备液体样品应充分混匀；固体样品需制成悬浮液；样品量应适中，过多或过少都会影响涂片质量样品滴加取一小滴样品（约5-10μL）置于清洁载玻片一端约1cm处，滴加量应适中，过多导致涂片过厚涂片操作用另一片载玻片以30-45°角接触样品滴，待样品扩散到推片边缘后，以稳定速度向前推动干燥固定自然风干或用电吹风低温快速干燥；某些样品如血液涂片需立即甲醇固定10-15分钟染色封片根据样品类型选择适当染色方案，如血液使用瑞氏染色，细菌使用革兰氏染色涂片法是最简便的制片方法之一，特别适用于血液、体液和微生物悬液等样品理想的涂片应均匀、半透明、呈楔形（一端厚，一端逐渐变薄）涂片速度影响厚度速度过快导致涂片过厚，速度过慢则使细胞分布不均压片法应用适用材料范围压片法特别适用于结构较为简单且自身厚度较小的样品，如植物表皮、叶片、藻类、昆虫翅膀等这些样品通常不需要复杂的前期处理，可直接进行压片观察但不适用于需要保持内部结构完整性的厚样品操作步骤首先准备清洁的载玻片和盖玻片将少量水滴（或甘油、染色液）滴于载玻片中央，放入适量样品轻轻放上盖玻片，避免产生气泡用滤纸吸去多余液体，再用镊子或解剖针轻轻按压盖玻片，使样品适当变薄压力控制压力控制是压片法的关键压力过大会破坏样品结构，压力过小则样品过厚影响观察对于脆弱样品，可在盖玻片四角放置小纸片作为垫片，控制压力大小某些特殊样品可使用微量液压压片装置确保压力均匀防变形措施为减少样品变形，可采用预固定处理，如1-2%戊二醛固定10-30分钟对于易碎样品，可使用含甘油的封片剂增加缓冲效果避免压片过程中的横向移动，这会导致剪切力引起的细胞撕裂或组织结构破坏第三部分样品处理流程取样固定选择有代表性的样品部位，控制大小和厚使用适当固定剂稳定组织结构，防止自溶度脱水封片通过乙醇梯度等方法逐步去除组织中的水使用封片剂保护样品并延长保存时间分染色透明使用染料增强组织结构对比度用透明剂取代脱水剂，提高组织透明度切片包埋将包埋好的样品切成薄片将样品浸入包埋剂中形成支持基质样品处理是一个连贯的工艺流程，每个步骤都会影响最终观察结果不同类型的样品可能需要调整特定步骤的参数或省略某些步骤质量控制应贯穿整个过程，确保每个环节都达到最佳效果固定步骤固定目的固定是制备过程中的第一个关键步骤，目的是抑制自身酶的活性，防止组织自溶；保持细胞和组织的原始形态；增加组织硬度，便于后续切片；提高组织对染料的亲和力固定剂选择常用固定剂包括甲醛（4%，通用性好）；戊二醛（

2.5%，电镜样品）；卡诺氏液（酒精+冰醋酸+氯仿，细胞学样品）；布恩氏液（甲醛+冰醋酸+苦味酸，软组织）选择应基于研究目的和样品特性固定条件固定时间与样品大小成正比，一般组织块需24-48小时体积比应为固定液:组织=10:1以上温度通常为4°C，某些特殊固定可在室温进行pH值一般控制在中性或弱碱性（

7.2-

7.4）固定质量判断良好固定的组织质地适中，不过硬也不过软；颜色均匀，无明显变色；切面平整光滑；组织块沉于固定液底部而非漂浮固定不良可表现为组织中央发黑、质地过软或边缘硬化等脱水技术70%起始浓度乙醇脱水第一阶段，浸泡60分钟80%中间浓度乙醇脱水第二阶段，浸泡60分钟95%高浓度处理乙醇脱水第三阶段，浸泡60分钟100%无水乙醇最终脱水阶段，2次各60分钟脱水是将组织中的水分逐步置换出来，为后续透明和包埋做准备除经典的乙醇梯度脱水外，也可使用丙酮或异丙醇进行脱水丙酮脱水速度快，但易挥发且会使组织硬脆；异丙醇对组织收缩影响较小，但脱水速度较慢脱水完全的标志是组织呈半透明状，质地适中，不过软也不过硬脱水不完全会导致后续透明剂和包埋剂渗透不良，最终影响切片质量过度脱水则会使组织过度收缩和变硬，导致切片困难透明处理透明剂选择常用透明剂包括二甲苯（最常用，渗透力强但对组织收缩大）；甲苯（比二甲苯毒性小，但透明效果稍差）；水杨酸甲酯（对组织收缩小，适合脆弱组织）；氯仿（温和，但渗透速度慢）选择透明剂应考虑样品性质和后续处理要求操作步骤透明处理通常采用梯度法将脱水后的样品先放入乙醇和透明剂的等量混合液中（30-60分钟），再转入纯透明剂中（1-2小时）对于较大样品，可能需要更换2-3次透明剂每次转移样品应使用镊子而非滤纸，避免样品干燥透明时间控制透明时间过短会导致透明不彻底，影响后续石蜡渗透；时间过长则会使组织过度硬脆一般小型组织块（3×3×3mm）在二甲苯中透明时间约为1-2小时；大型组织可能需要3-4小时温度升高可加速透明过程，但不宜超过45℃透明效果判断理想的透明效果是组织呈半透明或透明状态，可以看到组织内部结构在强光下观察样品，若无白色不透明区域，则表明透明完全过度透明的组织会变得极度脆硬，边缘可能呈现玻璃样改变包埋技术包埋剂比较石蜡包埋步骤包埋质量评价石蜡（熔点56-58℃，最常用）优点是操作

①石蜡浸透将透明后的样品放入58-60℃熔良好的包埋石蜡块应质地均匀，无气泡，样品简便，价格低廉；缺点是硬度不够，不适合硬融石蜡中，浸泡2-4小时，视样品大小可更换位置明确且方向正确切面时石蜡呈半透明组织或超薄切片水溶性树脂适合酶组织化2-3次石蜡，确保充分渗透

②定向用预热状，与组织结合紧密无分离包埋不良的常见学研究，但渗透性差环氧树脂硬度高，适镊子将样品放入包埋盒中，调整至理想切面朝问题石蜡渗透不完全导致组织内有空隙；温合电镜超薄切片，但操作复杂、价格高聚苯下

③冷却室温下自然冷却或用冰水快速冷度过高导致组织烧焦变性；冷却过快导致石蜡乙烯透明度高，适合荧光显微镜观察却至石蜡完全凝固

④修整用刀片修整石蜡与组织分离；样品定向不当导致切片时无法获块，使其适合固定在切片机上得理想切面切片技术切片机使用方法切片质量控制旋转切片机是最常用的切片设备，操作要点切片质量直接影响观察效果，主要影响因素

1.固定石蜡块将包埋好的石蜡块牢固地固定在切片机的样品•刀片锋利度刀片必须足够锋利，钝刀会导致切片压缩、撕夹持器上裂

2.安装刀片将锋利的切片刀正确固定在刀座上，角度通常设•切片角度角度过大或过小均会影响切片质量置为5-10°•切片速度过快会导致切片不均匀，过慢可能引起切片断裂

3.调整切片厚度根据需要设置切片厚度，一般为4-10μm

4.切片操作稳定均匀地旋转手轮，保持恒定速度，每转一圈•石蜡质量石蜡硬度不当或渗透不完全会影响切片产生一张切片•环境温度温度过高会使石蜡软化，影响切片质量

5.收集切片用镊子或毛笔小心收集切下的切片，转移到水浴理想的切片应厚度均匀、无皱褶、无裂痕、无空洞，形成连续的中展平切片带贴片与展片干燥处理贴片技巧贴片后先用滤纸轻轻吸去多余水分，展片操作取预处理好的载玻片，以45°角接触避免直接接触切片将载玻片竖直放水浴准备用镊子或毛笔将切片轻轻放在水面水面下的切片，使切片均匀附着贴置片刻，让水自然流下然后将载玻将蒸馏水加入水浴箱，温度控制在上，切片会自动展开可用镊子轻轻片动作要连续流畅，避免在水中停留片水平放置于37-40℃烘箱中干燥40-45℃（比石蜡熔点低10-调整位置和方向，但避免直接接触切过久贴片时确保切片位于载玻片的12-24小时，确保切片与载玻片牢固15℃）水温过高会导致组织膨胀变片本身对于有皱褶的切片，可用毛中央位置，且组织面朝上多张切片粘合对于特殊染色，可采用室温自形，过低则无法充分展平切片水中笔轻轻展平或用70%酒精滴1-2滴于可排列在同一载玻片上，但注意保持然干燥可添加少量明胶（

0.1-

0.5%）或蛋白水面让切片在水浴上停留1-2分间距液以增强切片附着力水面保持清钟，充分展平洁，无灰尘和气泡第四部分特殊材料制备技术植物组织制备动物组织制备硬质材料制备植物组织因含有细胞壁需要特殊处理方不同动物组织具有独特的处理要求神经金属、塑料等硬质材料需采用特殊技术法木质化组织可能需要软化处理，如沸组织需长时间固定；骨骼组织需先脱钙；可使用金刚砂研磨至光学薄片，或采用微水浸泡或氢氧化钠溶液处理植物样品固脂肪组织可采用冰冻切片避免常规脱水引切割设备制作超薄切片环氧树脂包埋常定常用FAA固定液（甲醛-乙酸-酒精），起脂质流失固定液选择也各异，如用于增强支持性特殊的金相显微镜和偏针对特殊结构如叶绿体可选用戊二醛固Bouin液适合消化道，B5液适合淋巴组光显微镜常用于这类材料观察定织植物样品制备软组织与木质组织差异固定液选择植物软组织（如嫩叶、花瓣）含水量高，细胞壁薄，易于切片但植物样品常用固定液也容易萎缩处理时需快速固定并使用较温和的脱水程序固定•FAA固定液甲醛5ml+冰醋酸5ml+70%乙醇90ml，通用时间较短，通常4-12小时即可性强木质组织（如茎干、根）含有大量木质素和纤维素，组织坚硬，•Carnoy固定液乙醇60ml+氯仿30ml+冰醋酸10ml，适难以直接切片需要软化处理可使用沸水浸泡、氢氟酸处理合细胞学研究（2-5%，12-24小时）或乙二胺软化固定时间较长，通常需•铬酸-乙酸固定液适合研究染色体24-72小时•戊二醛-锇酸双固定用于电镜样品，保存超微结构固定液体积应为样品体积的15-20倍，大型样品可切成小块或抽真空辅助渗透植物样品染色常用番红-固绿双重染色法，可清晰区分木质部（红色）和韧皮部（绿色）；PAS反应用于检测多糖；苏丹染色法用于检测角质层和木栓层切片厚度通常为8-15μm，较动物组织稍厚动物组织制备神经组织神经组织极其脆弱且易自溶，应在死亡后立即固定推荐使用10%中性福尔马林或

2.5%戊二醛固定，固定时间较长（48-72小时）脱水过程应缓慢进行，每级乙醇浸泡时间延长适合特殊染色如Nissl染色（显示尼氏体）和髓鞘染色（显示髓鞘）骨骼组织骨组织含钙质，需进行脱钙处理常用脱钙液包括5-10%EDTA溶液（温和但时间长，1-4周）或5%硝酸（快速但可能损伤组织，1-3天）脱钙进行中应定期更换脱钙液并测试脱钙程度脱钙完全后，可用正常石蜡切片法处理脂肪组织脂肪组织在常规处理中脂质易流失，推荐使用冰冻切片技术保存脂滴若必须用石蜡切片，应使用锇酸固定（使脂质不溶）或短时间固定并快速脱水染色可采用苏丹系列染料或油红O专门显示脂肪内分泌组织内分泌腺固定需特别注意保存激素颗粒推荐使用卡诺氏液或布恩氏液固定甲醛-升汞混合液对垂体和甲状腺固定效果良好切片厚度宜薄（3-5μm），以便观察细胞内颗粒可采用PAS染色显示糖蛋白激素微生物样品制备悬滴法用于观察活体微生物，特别是运动性微生物在干净盖玻片中央放一小滴凡士林或石蜡油，形成环状在环中央放一小滴含微生物的液体将盖玻片翻转，使液滴悬于凹槽载玻片的凹陷上方，形成密闭空间此法可观察微生物的活动方式和形态特征涂片法细菌涂片制备取少量菌落于载玻片上，加一滴水混匀成薄层自然干燥或用小火快速干燥固定对于液体培养物，可直接取一滴于载玻片上涂开比较厚的涂片需要在95%乙醇或甲醇中固定3-5分钟常用革兰氏染色区分革兰阳性和阴性细菌真菌制备真菌菌丝和孢子观察可采用撕片法用透明胶带轻轻接触菌落表面，然后贴于载玻片上，滴加一滴乳酸酚棉蓝染液也可采用压片法观察真菌形态对于酵母菌，可采用与细菌相似的涂片方法，但染色常用亚甲蓝或美蓝染色质量控制微生物样品制备的关键是避免污染和保持微生物形态涂片应均匀不过厚，染色时间需精确控制理想的涂片上微生物分布均匀，背景清晰，无杂质干扰革兰氏染色时必须严格控制脱色时间，避免假阴性结果塑料材料制备技巧热压制膜法溶液浇铸制膜法切片法打磨技术适用于热塑性塑料，如聚乙将塑料溶于适当溶剂（如聚硬质塑料可采用微切片机直对于高硬度塑料，可采用研烯、聚丙烯、聚苯乙烯等苯乙烯溶于甲苯，聚甲基丙接切片软质塑料可先在-磨法先用粗砂纸（400取少量样品置于两张载玻片烯酸甲酯溶于丙酮），制成1-20℃冷冻后再切片，或先包目）初步研磨，再逐渐过渡之间，在加热条件下（通常5%溶液将少量溶液滴于清埋在环氧树脂中增加支持性到细砂纸（2000-3000目）为材料熔点以上10-20℃）施洁载玻片上，自然干燥或在后切片普通旋转切片机可精磨最后使用抛光粉（如加均匀压力，使样品变成透低温下干燥，形成薄膜此切出8-15μm厚的切片，而超Al₂O₃、CeO₂）在抛光布上明薄膜冷却后直接观察或法适用于对热敏感的塑料，薄切片机可切出

0.5-2μm的抛光至镜面状态理想厚度进行后续染色处理此方法但溶剂可能引起材料结构变超薄切片，适合高分辨率观应在15μm以下此法适合观简单快捷，但可能改变材料化察察塑料内部结构和缺陷的原始结构硬质材料处理样品切割1使用专业金相切割机精确取样树脂包埋环氧树脂固定样品提供支撑粗磨处理使用120-400目砂纸去除表层精细研磨800-2000目砂纸获得平滑表面抛光完善使用Al₂O₃或金刚石抛光膏最终处理硬质材料制备的关键在于获得足够光滑的表面，以便在显微镜下观察内部结构金属样品通常需要进行腐蚀处理，使用适当的腐蚀剂（如硝酸酒精溶液、氯化铁溶液等）显示晶界和相界腐蚀时间需精确控制，过度腐蚀会破坏表面细节对于极硬材料如陶瓷，可采用离子减薄技术制备超薄样品；对于金属-塑料复合材料，需选择能同时适应两种材料的研磨方案，避免出现高低不平的表面第五部分染色技术染色是显微镜样品制备的关键步骤，通过增强组织、细胞或细胞结构的对比度，使其在显微镜下清晰可见不同染色方法具有特定的染色机制和应用范围，能有针对性地显示特定结构或成分染色技术的选择取决于样品类型和研究目的常用的染色方法包括常规染色（如HE染色）、特殊染色（针对特定组织成分）、荧光染色和免疫组织化学染色等正确的染色不仅能提供清晰的形态学信息，还能反映样品的生化特性染色基本原理染色机制染色剂分类染色的基本原理是利用染料分子与组织成分之间的物理化学作用，使组织根据化学性质，染料可分为酸性染料（阴离子染料，如伊红、酸性品获得颜色主要的染色机制包括离子键结合（酸性染料与碱性组织成分红）—染色细胞质和胞外基质；碱性染料（阳离子染料，如苏木精、甲基或碱性染料与酸性组织成分）；氢键作用；共价键结合（如锇酸与不饱和蓝）—染色核酸和粘多糖；中性染料（如May-Grünwald染料）；特殊脂肪）；物理吸附（如脂溶性染料与脂质）和络合作用（如银染色）染料（如锇酸、银盐、荧光染料）不同染料具有特定的亲和性，能选择性地染色不同组织成分染色流程质量控制标准染色流程包括脱蜡（石蜡切片需用二甲苯）、水化（乙醇梯度至良好的染色应具备以下特点染色均匀无污染；细胞核和细胞质对比清水）、染色（主染色和复染色）、分化（去除过度染色）、脱水（水至乙晰；组织结构边界分明；染色强度适中不过度影响染色质量的因素包醇梯度）、透明（二甲苯）和封片每个步骤的时间和条件需严格控制，括染料质量和配制；染色时间和温度；前处理（固定、脱水等）质量；以确保染色质量和可重复性水的pH值和硬度；以及样品本身的性质染色技术HE脱蜡水化二甲苯脱蜡（3次各5分钟）→无水乙醇（2次各3分钟）→95%、85%、75%乙醇（各2分钟）→流水冲洗（5分钟）苏木精染色Harris苏木精染色5-8分钟→流水冲洗→1%盐酸酒精分化数秒→流水冲洗10分钟（返蓝）伊红染色

0.5-1%水溶性伊红染色1-3分钟→流水快速冲洗4脱水透明75%、85%、95%乙醇（各10-15秒）→无水乙醇（2次各2分钟）→二甲苯透明（3次各5分钟）封片中性树胶封片，室温干燥24小时HE（苏木精-伊红）染色是最常用的组织学染色方法，能清晰显示组织的基本形态结构苏木精（碱性染料）染细胞核呈蓝紫色；伊红（酸性染料）染细胞质和细胞外基质呈粉红至红色良好的HE染色应显示细胞核边界清晰，染色深淡适中；细胞质染色均匀；不同组织成分能明显区分特殊染色技术氏染色法染色法Gram PAS用于区分革兰阳性菌（紫色）和革兰阴性菌（红色）的基本方法碘酸希夫反应PAS用于检测多糖类物质，如糖原、粘多糖和基底膜

1.结晶紫染色1分钟→水冲洗

1.

0.5-1%过碘酸氧化5-10分钟

2.碘液处理1分钟→水冲洗

2.希夫试剂染色10-30分钟

3.95%酒精脱色10-30秒→水冲洗

3.亚硫酸水冲洗3次各2分钟

4.番红复染30秒→水冲洗→干燥

4.流水冲洗10分钟

5.苏木精复染核→常规脱水封片革兰阳性菌细胞壁致密，能保留结晶紫-碘复合物，呈紫色；革兰阴性菌则在脱色后失去紫色，被番红染成红色PAS阳性物质呈紫红色，核染为蓝色常用于检测真菌、基底膜异常和某些肿瘤细胞Masson三色染色是观察结缔组织的重要方法，能清晰区分胶原纤维（蓝色）、肌肉（红色）、细胞核（黑紫色）和红细胞（橙红色）主要用于肝纤维化、心肌纤维化评估和肿瘤间质研究银染色技术利用银盐还原为金属银的原理，显示组织中难以染色的结构，如神经纤维、网状纤维和某些微生物弹性纤维染色（如Verhoeff-VanGieson法）则专门用于显示血管和皮肤中的弹性纤维荧光染色技术荧光染色原理荧光染色利用荧光染料在特定波长激发光照射下发射不同颜色荧光的原理荧光染料与细胞特定组分结合，在荧光显微镜下可显示特定结构，具有高灵敏度和高选择性与传统染色相比，荧光染色可实现多重标记，同时观察多种结构，且能用于活细胞观察常用荧光染料核酸染料DAPI/Hoechst（蓝色荧光，DNA特异性）、PI（红色荧光，核酸染料，死细胞膜通透）、SYBR Green（绿色荧光，高灵敏度DNA染料）细胞器染料MitoTracker（线粒体）、LysoTracker（溶酶体）、ER-Tracker（内质网）膜染料DiI/DiO/DiD（细胞膜）、FM1-43（突触膜）功能染料Fluo-4/Fura-2（钙离子）、BCECF（pH值）、JC-1（膜电位）操作流程固定通常使用4%多聚甲醛或冷甲醇固定，避免甲醛自发荧光透化（可选）使用

0.1-

0.5%Triton X-100增加膜通透性封闭（可选）使用BSA或血清减少非特异性结合染色染料稀释至工作浓度，避光孵育，时间视染料而定洗涤PBS充分洗涤去除未结合染料封片使用抗淬灭封片剂，如ProLong Gold荧光淬灭防控荧光淬灭是荧光染色的主要问题，可通过以下方法减轻使用抗淬灭封片剂；避免长时间暴露在激发光下；降低激发光强度；使用光稳定性好的染料；样品避光保存；采用共聚焦显微镜减少光漂白；使用氧自由基清除剂如抗坏血酸多重染色技术原理与应用染色顺序安排多重染色技术指同时使用多种染料标记不同细染色顺序对最终结果影响显著，一般原则先胞结构或分子，可在一张切片上同时观察多种进行易褪色的染色；先进行弱染色后进行强染成分常用于组织学复杂结构观察、免疫组织色；先使用水溶性染料后使用脂溶性染料对化学多标记和荧光原位杂交技术多重染色能于免疫荧光多重标记，应考虑一抗来源动物种最大限度利用有限样品，提供丰富信息，特别属，避免交叉反应；二抗应选择不同荧光基团适合研究细胞间相互作用和复杂分子表达模1且发射光谱重叠最小式结果解读颜色搭配原则多重染色结果解读需注意区分特异性染色与明智选择颜色组合确保清晰区分不同结构对非特异性背景；理解不同荧光信号共定位的生比色（如红-绿，蓝-橙）效果最佳传统染色物学意义；考虑信号重叠可能导致的假阳性常用组合苏木精-伊红-亮绿；苏木精-刚果红使用阴性对照和单染色对照帮助确定真实信-亮蓝；苏木精-番红-甲基蓝荧光染色常用组号对于荧光染色，应使用单独的激发/发射通合DAPI（蓝）-FITC（绿）-Texas Red道采集信号，再合成伪彩色图像，而非直接观（红）；CFP-YFP-RFP避免使用发射光谱察多色荧光重叠的荧光染料，如FITC和GFP第六部分封片与保存封片技术封片是样品制备的最后步骤，目的是保护样品免受物理损伤，防止染料褪色，增强光学性能，并延长保存时间封片前样品必须完全脱水和透明，否则会出现混浊操作时应避免气泡产生，可通过倾斜滴加或使用真空脱泡装置解决封片剂选择常用封片剂包括中性树胶（通用型，长期保存）；水溶性封片剂如明胶甘油（适合无需脱水的标本）；特殊封片剂如DPX（高折射率）或抗荧光淬灭封片剂选择封片剂时应考虑样品性质、染色类型、观察需求和保存时间，并注意封片剂的折射率应与显微镜系统匹配样品保存封片后样品应水平放置24-48小时使封片剂充分干燥长期保存应避光、避尘、防潮，最好使用专用载片盒定期检查样品是否出现泡沫、脱色或霉变对于特殊染色如荧光染色，应在-20℃低温避光保存，使用前恢复至室温以防止水汽凝结封片材料选择树脂类封片剂水溶性封片剂高折射率封片剂中性树胶（巴尔蛽）最常用甘油明胶（Kaiser封片剂）DPX和Permount由聚苯乙的永久性封片剂，由天然树脂由明胶、甘油和防腐剂组成的烯树脂制成，折射率较高（约或合成树脂溶于二甲苯制成水溶性封片剂优点是操作简

1.55-

1.58）优点是光学性能优点是稳定性好，透明度高，便，样品无需脱水，可直接从优越，特别适合观察细小结构不易褪色，折射率适中（约水中封片；缺点是保存时间有和高倍镜检；缺点是价格较

1.52）缺点是干燥较慢（24-限（通常1-2年），边缘需用指高，且需样品完全脱水适用48小时），且需要样品完全脱甲油密封防止干燥适用于酶于精细结构研究和高分辨率观水适用于常规HE染色和多数组织化学、免疫组织化学和一察，如细菌鞭毛、细胞微丝特殊染色标本的长期保存些特殊染色，尤其是水溶性染等料染色的样品抗荧光淬灭封片剂ProLong Gold和Vectashield专为荧光样品设计的封片剂，含有抗氧化剂减少荧光淬灭优点是能显著延长荧光信号持续时间，有些还含有DAPI等核染料；缺点是价格较高，某些类型干燥后硬度不足使用时应严格避光操作，干燥时间视具体品牌而定，通常为24小时封片技术详解准备工作确保载玻片完全干燥，无水分残留；盖玻片必须清洁无尘，厚度适合（通常

0.13-

0.17mm）；准备适量封片剂，质地应适中（太稠容易产生气泡，太稀则流动性过大）；对于常规封片，样品必须经过完全脱水和透明处理；环境应无尘、光线充足封片剂用量控制封片剂用量直接影响封片质量用量过少会导致气泡和覆盖不全；用量过多会溢出边缘造成污染一般原则是封片剂用量应足够覆盖整个切片并略有余量，对于18×18mm盖玻片，通常需要1-2滴封片剂对于大型切片或多张切片，可适当增加用量气泡防控技术气泡是封片中最常见的问题防控方法

①封片前将封片剂预热至微温（约40℃）降低黏度；

②采用45°角倾斜放置盖玻片，从一侧缓慢放下；

③使用细针将气泡轻轻引导至边缘；

④对于顽固气泡，可使用真空脱泡装置；

⑤有经验的技术人员可轻轻按压盖玻片中央，使气泡向外扩散干燥与固化封片后的切片需要适当干燥以确保封片剂固化

①初步吸去溢出的封片剂；

②保持载玻片水平放置，防止盖玻片滑动；

③树脂类封片剂通常需在室温下干燥24-48小时；

④可使用37-40℃恒温箱加速干燥，但温度过高可能导致切片收缩变形；

⑤完全干燥后，可用二甲苯清除载玻片边缘多余的封片剂样品保存技术短期与长期保存方法特殊样品保存技术短期保存（数月至1年）荧光样品•使用标准载片盒，垂直放置，避免切片之间接触•使用抗淬灭封片剂（如ProLong Gold）•存放于室温、干燥、避光环境•-20℃低温保存延长荧光寿命•定期检查切片状态（每3-6个月）•密封切片边缘防止氧化•完全避光保存，使用专用黑盒长期保存（数年至数十年）易褪色染色•使用优质封片剂（如中性树胶）确保稳定性•切片边缘涂封边胶进一步密封•银染色和PAS染色样品应避光保存•使用专业切片储存箱，控制温湿度•脂肪染色（如油红O）样品低温保存•建立标本档案系统，记录保存条件和检查记录•免疫组织化学染色样品避光且温度保持在4-10℃对于特别珍贵的样品，可考虑数字切片扫描技术，创建虚拟切片档案长期保存图像信息第七部分质量控制最终质量评价综合评估样品整体观察价值1显微观察评估在显微镜下检查样品各项指标制备过程监控每个关键步骤的质量控制点检查材料与试剂控制4确保原始材料和试剂质量质量控制是贯穿整个样品制备过程的关键环节优质的显微样品应具备组织结构完整，无人为损伤；切片厚度均匀，无皱褶、撕裂；染色均匀，对比度适中；无气泡、异物等干扰因素通过建立标准化流程、使用阳性对照样品、技术人员培训和定期设备维护，可显著提高样品制备质量常见问题与解决气泡问题切片气泡通常由包埋不完全或脱蜡水化过程中空气进入引起解决方法确保样品完全渗透石蜡；若已出现气泡，可尝试重新封片，先用二甲苯去除原封片剂封片气泡常见于封片操作不当解决方法轻轻加热切片使封片剂流动性增强；用针尖引导气泡至边缘；必要时重新封片，注意操作技巧，45°角放置盖玻片染色不均问题染色过深或过浅可能是染色时间不当或染料浓度不适解决方法重新染色，严格控制时间；若已封片，可用二甲苯去除封片剂，用酒精脱色后重新染色染色不均匀常由组织厚度不均、固定不完全或水化不充分导致解决方法改进切片技术；确保水化彻底；使用新鲜染色液；增加染色液体积确保充分浸泡切片起皱问题切片起皱通常在水浴展片或干燥过程中产生原因包括水温过高、切片过薄、石蜡质量不佳解决方法控制水浴温度比石蜡熔点低3-5℃；适当增加切片厚度；使用优质石蜡；保持切片刀锋利；采用渐进式干燥防止温度骤变导致的收缩组织断裂问题表现为切片中组织不连续或缺失原因固定不完全导致组织自溶；脱水或浸蜡不充分；石蜡与组织硬度差异过大；切片时速度不均解决方法改进固定方案；延长脱水和浸蜡时间确保完全渗透；选择合适硬度的石蜡；保持稳定切片速度；对于特别脆硬的组织，可使用特殊软化剂处理质量评价标准第八部分典型案例分析案例分析是掌握样品制备技术的重要途径通过研究不同类型样品的制备流程、操作要点和常见问题，可以积累宝贵的经验，提高实际操作能力本部分将详细介绍植物、动物组织和特殊材料的制备案例，包括完整的操作流程、关键参数控制、问题处理方法以及成功样品的特征通过这些案例，希望学员能够掌握不同类型样品制备的共性和个性，灵活应用所学知识，制备出高质量的显微样品案例一植物茎横切片制备材料准备与前处理选取向日葵茎的中部，剪取1cm长的新鲜段先用FAA固定液（甲醛5ml+冰醋酸5ml+70%乙醇90ml）固定24小时若木质化程度高，可在固定后用10%氢氟酸软化48小时，再充分水洗2切片制作方法一徒手切片使用剃须刀片，将样品夹在聚苯乙烯泡沫中间，保持垂直，用连续平稳的动作切取多张10-15μm的薄片，选取质量最好的进行染色方法二石蜡包埋切片固定后样品经过梯度乙醇脱水，透明，浸蜡，包埋，在旋转切片机上切取8μm厚切片，贴片于处理过的载玻片上3染色与封片采用番红-固绿双重染色

0.5%番红溶液染色5分钟→水洗→

0.5%固绿溶液染色1分钟→快速水洗→梯度脱水→二甲苯透明→中性树胶封片理想染色效果木质部染成红色，韧皮部染成绿色，细胞壁轮廓清晰可见结果与分析成功的向日葵茎横切片应显示清晰的维管束环，每个维管束中木质部和韧皮部结构完整可观察到髓射线、形成层、皮层、表皮等组织木质化细胞壁染成红色，纤维素壁染成绿色，细胞核呈深绿色案例二动物组织石蜡切片12取材固定脱水透明取小鼠小肠段（约5mm长），10%中性福尔马林固定24小时70%-100%乙醇梯度脱水，每级1小时，二甲苯透明2小时34浸蜡包埋切片染色58℃石蜡浸透3次各2小时，纵向放置包埋5μm连续切片，HE染色显示组织结构小肠组织制备的关键点在于保持粘膜结构完整性固定时间过长会导致组织过度硬化，难以切片；固定液体积应为组织体积的15-20倍；腔道组织应在固定前轻轻挤压排出腔内容物切片时应注意刀片与组织的相对方向，以获得理想切面常见难点包括肠绒毛易脱落、粘膜上皮细胞自溶快解决方法是快速新鲜取材并立即固定，避免机械损伤成功的小肠切片应显示完整的粘膜、粘膜下层、肌层和浆膜结构，绒毛形态保存完好，上皮细胞排列整齐，杯状细胞清晰可辨案例三特殊材料制备多层复合材料切片案例效果对比与分析材料描述由聚合物基质中嵌入玻璃纤维和金属颗粒组成的复合材料，传统方法问题硬度不均，传统切片方法容易导致组分分离和切片破损•聚合物和纤维界面经常分离创新解决方案•金属颗粒常从切片中脱落

1.低温处理样品先在-80℃超低温冰箱中预冷4小时，使聚合物基质•切片厚度不均，难以获得理想观察效果变硬，减小不同成分间硬度差异•成功率低，通常需要多次尝试

2.真空环氧树脂包埋使用低黏度环氧树脂在真空条件下-

0.1MPa改进方法效果浸透12小时，确保树脂完全填充材料间隙•组分界面完整保留，无分离现象

3.分步切片技术先使用金刚石砂轮切割至约500μm厚度，再使用精密研磨设备逐步减薄至50μm，最后用离子束减薄至15μm•金属颗粒牢固嵌入，分布清晰可见

4.无水抛光使用特殊的无水抛光液进行最终处理，避免水分引起组•切片厚度均匀，透光性良好分分离•方法重复性好，成功率提高80%该方法已成功应用于多种复合材料研究，包括航空材料、电子封装材料和生物医用复合材料等领域总结与展望基础原则技术革新样品代表性、适宜厚度、充分固定、精确切自动化设备、数字图像分析、三维重建、活片、适当染色体成像合作平台能力提升在线论坛、实验室交流、样品库共享、技术实践训练、技术交流、文献学习、讲习班参标准统一与高质量的显微样品制备是科学研究的基础掌握适合不同材料的制备技术，需要不断学习和实践未来显微样品制备将向自动化、精准化、数字化方向发展，与人工智能、大数据分析等技术深度融合新型样品制备技术如冷冻电镜样品制备、超分辨荧光样品制备等正在改变传统显微学研究模式作为研究者，应当保持开放学习的心态，不断探索创新方法，为微观世界研究提供更可靠的技术支持。