《分子生物学基础：RNA生物合成过程》课件

分子生物学基础生物合RNA成过程欢迎来到分子生物学基础课程，今天我们将深入探讨生物合成的过程RNA作为生命信息传递的关键分子，其合成过程涉及复杂的分子机制和精密RNA的调控网络在这个系列课程中，我们将从基本概念入手，逐步深入到原核生物和真核生物合成的分子机制，探讨加工、修饰、剪接等关键过程，同时介绍RNA RNA相关的实验技术和最新研究进展通过本课程，希望能够帮助大家建立对生物合成过程的系统性认识，为RNA进一步学习分子生物学和遗传学奠定坚实基础内容提要合成基本流程RNA我们将详细介绍从模板转录、加工到成熟的全过程，包括各步骤RNA DNA的分子机制和能量需求关键酶与因子探讨参与合成的核心酶类和转录因子，包括聚合酶家族、启动因RNA RNA子、延长因子和终止因子等原核与真核差异分析比较原核生物和真核生物在合成机制上的显著区别，理解生物进RNA化带来的分子复杂性常见实验方法介绍研究合成的主要实验技术，包括传统方法和现代高通量技术，如RNA、等RT-PCR RNA-seq分子的基本类型RNA信使转运RNA mRNA RNA tRNA携带遗传信息从传递到蛋白质合成的翻译机器，是蛋白质一级负责将氨基酸运送到核糖体上，具有特殊的三叶草结构，含有反密DNA结构的模板在真核生物中具有帽子结构和多聚尾巴码子可与密码子配对，实现遗传密码翻译53A mRNA核糖体非编码RNA rRNA RNA构成核糖体的主要成分，与蛋白质一起形成核糖体复合体，具有催包括（）、长链非编码（）、小microRNA miRNA RNA lncRNA化肽键形成的酶活性，也称为核酶核（）等，不编码蛋白质但参与基因表达调控的重要分RNA snRNA子核酸的分子结构概述核糖与脱氧核糖的关键区别磷酸二酯键的重要性核糖和脱氧核糖是和的主要组成部分之一，它们的主磷酸二酯键连接相邻核苷酸，形成核酸的主链骨架每个磷酸基RNA DNA要区别在于位碳原子上的羟基中的核糖在位团连接两个相邻核苷的和位羟基，形成的定向结构2-OH RNA2355→3含有羟基，而中的脱氧核糖在该位置缺少羟基DNA这一微小的结构差异导致了分子更容易水解，因为位羟这种连接方式为核酸提供了稳定性，同时保持了足够的柔性，允RNA2基可以攻击相邻的磷酸二酯键这也是在细胞中通常比许形成双螺旋结构或形成多种二级结构磷酸二酯键RNA DNA RNA更不稳定的重要原因之一的能量较高，需要专门的酶才能切断，这保证了遗传信息的稳定DNA存储和传递与的主要区别DNA RNA碱基组成差异稳定性差异含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶四种中位羟基的存在使其比更容易受到碱性条件和核糖DNA AG C T RNA2DNA碱基而中，胸腺嘧啶被尿嘧啶取代与配对的核酸酶的降解同时，单链结构也比双链结构更容易RNA TU UA RNA DNA能力稍弱于与的配对，这也影响了的稳定性和功能受到环境因素的影响，导致通常寿命较短T ARNA RNA1234结构差异生物学功能差异通常以双链形式存在，形成著名的双螺旋结构；而大主要用于长期存储遗传信息，而则具有多种功能，包DNA RNA DNA RNA多以单链形式存在，能够折叠形成多种复杂的二级结构，如发夹、括信息传递、蛋白质合成和以及基因表达mRNA rRNA tRNA茎环和假结等这些结构对功能至关重要调控、等的多功能性反映了生命早期可RNA miRNAlncRNARNA能以为中心RNA的生物学功能RNA信息传递作为基因表达的中间产物，携带遗传信息mRNA结构组分构成核糖体，参与蛋白质合成rRNA tRNA催化功能具有催化活性，如核糖体中的催化肽键形成RNA rRNA基因表达调控非编码如、等调控基因表达RNA miRNAlncRNA防御功能和系统参与抵抗外源核酸入侵siRNA CRISPR在细胞中发挥着多种重要功能，从最基本的遗传信息传递到复杂的基因表达调控和在蛋白质合成中扮演着核心角色，不仅提供核糖体的结构骨架，RNA rRNA tRNA rRNA还具有催化肽键形成的酶活性；而则负责将特定氨基酸准确送到核糖体上对应的密码子位置tRNA在细胞中的分布RNA细胞核细胞质真核细胞中，的转录、初级加工和部成熟的、和核糖体在细胞质RNA mRNA tRNA分修饰在细胞核中完成中发挥功能前体合成与加工翻译成蛋白质•mRNA pre-mRNA•mRNA合成与核糖体亚基装配携带氨基酸参与翻译•rRNA•tRNA参与剪接核糖体在细胞质中完成蛋白质合成•snRNA RNA•线粒体叶绿体/细胞膜相关这些细胞器含有自己的和合成系DNA RNA某些与膜结构相关联RNA统内质网上的核糖体相关•mRNA线粒体叶绿体特有的和•/rRNAtRNA体中的降解•P P-bodies RNA编码少量蛋白质的•mRNA应激颗粒中的非翻译•mRNA独立的但简化的转录和翻译机制•合成的起始与信号RNA核心启动子增强子沉默子在基因转录起始点附近位于基因上游或下游的抑制基因表达的调DNA的序列，包含调控元件，可以增控元件，与转录抑制因DNA DNA聚合酶识别和结合强基因转录效率增强子结合，阻碍聚合RNA RNA的特定元件在真核生子可以位于距离基因很酶的结合或活性沉默物中，核心启动子通常远的位置（数千碱基子可以招募组蛋白去乙包括盒（位于起对），通过环化与酰化酶等修饰酶，导致TATA DNA始点上游约位置）、启动子区域接触，招募染色质结构变得更加紧-25起始子元件（，位转录因子促进聚合密，不利于转录因子的Inr RNA于起始点）以及下游启酶结合和转录起始接近和结合动子元件（）等DPE转录概述DNA作为模板DNA1遗传信息的存储载体，提供合成的模板RNA聚合酶催化RNA识别启动子并催化核苷酸连接形成链RNA合成RNA按照模板链顺序合成互补的分子DNA RNA转录是中心法则的第一步，即蛋白质的遗传信息流动过程在转录过程中，双链的一条链（模板链或称为反义链）作为DNA→RNA→DNA模板，聚合酶沿着这条链按照碱基互补配对原则（配对，配对，而非）合成RNA A U G CT RNA转录的意义在于实现了遗传信息从到的转移，使储存在中的信息能够被表达这种机制使细胞能够根据需要选择性地表达特定DNA RNA DNA基因，从而应对不同的发育阶段和环境条件同时，通过产生多种类型的分子，细胞能够执行多样化的功能，包括蛋白质合成和基因表达RNA调控原核生物转录的基本流程起始聚合酶与因子结合识别启动子，双链解开形成转录气泡RNAσDNA延长聚合酶沿模板链方向移动，催化核苷酸加入RNA5→3终止终止信号导致聚合酶与模板和新生链分离RNA DNA RNA同时翻译在细胞质中，合成的同时即可被核糖体翻译RNA原核生物转录的一个显著特点是一条可以包含多个基因，这种含有多个编码区的被称mRNA mRNA为多顺反子（）这些基因通常具有相关功能，共同参与某一生化途径或细胞polycistronic mRNA过程，例如乳糖操纵子中的半乳糖苷酶、乳糖透酶等基因共同参与乳糖代谢β-原核生物的集合启动子（）包括两个保守序列位于转录起始点上游约处consensus promoter-35的序列（）和位于处的盒（）因子识别并结合这些序列，帮助TTGACA-10Pribnow TATAATσ聚合酶正确定位，不同的因子可以识别不同的启动子，从而调控不同基因集的表达RNAσ真核生物转录总览真核生物转录比原核生物复杂得多，包括转录前、转录中和转录后的多层次调控真核基因结构包含非翻译区（）位于起UTRs5UTR始密码子前，含有核糖体结合位点；位于终止密码子后，含有调控稳定性和翻译效率的元件3UTR RNA真核基因的编码区被外显子和内含子交替排列的结构打断外显子（）含有编码蛋白质的信息，会被保留在成熟中；内含子exon mRNA（）是基因中的非编码区段，在转录后的加工过程中会被剪除这种单顺反子（）结构，即一个只编intron RNA monocistronic mRNA码一种蛋白质，是真核生物的典型特征前体需要经过剪接机制（）去除内含子、连接外显子，才能形成成熟的分子RNA splicingmRNA聚合酶家族RNA生物类型聚合酶类型结构组成合成类型RNA RNA原核生物单一聚合酶核心酶因子所有类型RNAα2ββω+σRNA真核生物聚合酶个亚基复合体大多数（）RNA I14rRNA28S,18S,

5.8S真核生物聚合酶个亚基复合体和部分RNA II12mRNA snRNA真核生物聚合酶个亚基复合体和部分RNA III17tRNA,5S rRNAsnRNA原核聚合酶是一个相对简单的多亚基酶，核心结构由五个亚基组成两个亚基、一个亚基、一个亚基和一个亚基，形成的核心酶转录起始还需要一个RNAαββωα2ββω额外的因子，帮助识别启动子序列不同的因子可以识别不同类型的启动子，使细菌能够根据环境条件调控基因表达σσ真核生物拥有三种不同的聚合酶（、和），各自负责合成不同类型的这种分工反映了真核生物转录调控的复杂性，也与不同类型的转录调控需求相适RNA I II III RNA RNA应聚合酶是最重要的一种，负责所有蛋白质编码基因的转录，是遗传信息表达的核心执行者RNA II启动子识别原理保守序列识别在原核生物中，因子识别区和区（盒）等保守序列不同σ-35-10Pribnow类型的因子（如大肠杆菌的、等）识别不同的启动子序列，调控不σσ70σ32同功能基因的表达例如，识别热休克基因启动子，在高温环境下激活相σ32关基因表达盒结合蛋白作用TATA在真核生物中，转录因子复合物中的结合蛋白（）识别核TFIID TATATBP心启动子中的盒（序列为或类似序列）结合TATA TATAAATBP TATA盒使发生明显弯曲，为其他转录因子和聚合酶的结合创造有利条DNA RNA件盒通常位于转录起始位点上游约个碱基处TATA25-30多元件识别真核启动子通常包含多个顺式作用元件，如盒、起始子、下TATA Inr游启动子元件和识别元件等这些元件共同工作，DPE TFIIB BRE确保转录机器准确定位于转录起始位点一些基因可能缺乏盒，TATA此时其他元件如和更为重要Inr DPE转录起始复合体组装结合TFIID复合物中的（结合蛋白）首先识别并结合盒，引起局部弯曲TFIID TBPTATA TATADNA约度80基础转录因子招募、依次结合，稳定复合物；伴随聚合酶一起结合TFIIA TFIIBTBP-DNA TFIIFRNA II其他因子结合和加入复合物，提供解旋酶活性和激酶活性TFIIE TFIIH TFIIH形成PIC完整的预启动复合物形成，准备开始转录起始PIC在真核生物中，转录起始复合物的组装是一个有序的多步骤过程，需要众多蛋白因子的参与这些转录因子系列和聚合酶共同形成预启动复合物，是转录启动的必要条件TFIIRNA IIPIC是一个特别重要的多功能复合物，具有两种关键酶活性解旋酶活性和激酶活性解旋酶负责TFIIH DNA打开双链，形成转录气泡；而激酶则磷酸化聚合酶羧基末端结构域的丝氨酸残基，这DNA RNA II CTD种磷酸化修饰是转录从起始阶段转向延长阶段的信号的突变与多种人类疾病相关，如着色性干皮TFIIH病、科凯恩综合征等XP CS转录起始过程闭合复合物形成启动子识别聚合酶与双链形成初始结合，但仍RNA DNA DNA聚合酶复合物识别并结合特定启动子序列RNA保持闭合状态初始合成开放复合物形成RNA首个核苷酸结合并形成初始磷酸二酯键局部解链形成转录气泡，模板链暴露DNA转录起始是合成的第一步，也是基因表达调控的重要靶点在原核生物中，聚合酶与因子结合形成全酶，识别并结合启动子区域的特定序列结合后，在RNA RNAσATP水解的能量驱动下，双链局部解开约个碱基对，形成转录气泡聚合酶能够识别模板链上的特定起始位点，通常从位置开始链的合成DNA14RNA+1RNA在真核生物中，开放复合物的形成需要的解旋酶活性中的亚基在水解的驱动下，在转录起始位点周围打开约个碱基对的双链聚TFIIHTFIIHXPB ATP10-15DNA RNA合酶的活性中心定位于模板链上，准备进行第一个核苷酸的添加值得注意的是，转录过程中聚合酶可能多次尝试合成短链后终止（称为流产起始），直到成功合成II RNA足够长度的链才会进入稳定的延长阶段RNA负调控与正调控机制负调控机制正调控机制负调控主要通过阻遏蛋白（）的作用实现阻遏蛋白结正调控通过激活因子（）促进转录起始激活因子结合repressor activator合操作子（）区域，阻止聚合酶结合启动子或阻碍上的增强子序列，通过蛋白质蛋白质相互作用招募和稳定operator RNA DNA-其活性，从而抑制基因转录经典例子是大肠杆菌乳糖操纵子中的聚合酶及基本转录因子，提高转录起始效率例如，大肠杆RNA阻遏蛋白，在缺乏乳糖的环境中，结合操作子阻止乳糖菌中的（阴性调控蛋白）在与环腺苷酸（）结合后，LacI LacICAP cAMP代谢基因的表达促进乳糖操纵子的转录一些负调控因子可以通过修饰染色质结构或招募组蛋白去乙酰化酶真核生物中，转录激活因子通常携带多个功能域结合域识DNA（）使染色质结构变得更加紧密，从而抑制转录例如，别特定增强子序列；转录激活域与中介体（）复合物或HDACs Mediator真核生物中的异染色质蛋白（）和蛋白复合物可基本转录机器相互作用一些激活因子还能招募组蛋白乙酰化酶和1HP1Polycomb以促进染色质压缩，形成转录抑制的环境染色质重塑复合物，使染色质结构变得松散，有利于转录机器的进入和组装经典操纵子模型是由和提出的，用于解释原核生物基因表达调控操纵子由调控基因、操作子、启动子Jacques MonodFrançois Jacob和结构基因组成，是功能相关基因的协调表达单位如乳糖操纵子（）包含调控乳糖代谢的基因，以及阿拉伯糖操纵子（lac operonara）控制阿拉伯糖利用的基因operon转录延长5→3链生长方向RNA聚合酶沿模板链移动，按方向合成RNA DNA5→3RNA2-4碱基秒/原核聚合酶的合成速率约为每秒个核苷酸RNA40-5012-30碱基秒/真核聚合酶的合成速率约为每秒个核苷酸RNA II20-30⁻10⁵错误率聚合酶的合成准确性约为每个核苷酸一个错误RNA10⁵转录延长阶段，聚合酶沿模板链移动，催化核糖核苷酸之间磷酸二酯键的形成聚合酶具有类似分子马达的功能，利用核苷三磷酸RNA DNA RNANTP水解释放的能量推动自身沿模板向前移动在延长过程中，双链在聚合酶前方打开，在其后方重新结合，维持约个碱基对的转录气泡DNADNA12-14聚合酶具有一定的校对功能，虽然不如聚合酶精确当发生错误配对时，聚合酶的合成速率会明显减慢，有时甚至会倒退几个核苷酸，切除RNADNARNA错误添加的核苷酸后重新合成这种校对机制对维持合成的准确性非常重要，尤其对于需要精确结构的功能性如和在真核生物中，RNA RNAtRNA rRNA转录因子可以刺激聚合酶的核酸内切酶活性，帮助切除错误合成的片段TFIIS RNA II反义链与模板链模板链（）编码链（）Template StrandCoding Strand在转录过程中，双链中直接作为合双链中不直接参与转录的那条链被称为编DNARNADNA成模板的那条链被称为模板链或反义链码链或正义链其序列（除了替换为）与最RNA TU聚合酶沿着这条链从方向移动，按照碱终合成的序列相同，因此也称为同义链3→5RNA基互补配对原则（）合成在基因组数据库中记录的基因序列通常是编码A-U,G-C RNA链的序列也称为反义链（）也称为非模板链（•Antisense Strand•Non-template）其序列与合成的互补Strand•RNA其序列（）与序列相同方向为（相对于合成方向）•T→U RNA•3→5RNA方向为（与合成方向相同）•5→3RNA识别方法在基因组上，不同基因可能使用双链中的任一条链作为模板确定哪条链是模板链的方法包括DNA识别启动子序列的方向、分析开放阅读框（）或直接通过实验检测序列ORF RNA启动子序列具有方向性•转录起始位点通常有特定标志•通过确定转录方向•RNA-seq转录终止机制1非依赖性终止Rho也称为内在终止，依赖于中富含的发卡结构和后续的富集区域发卡结RNA GC U构的形成破坏了杂合区，而弱的相互作用使链容易与模板分RNA-DNA A-U RNA离，导致转录终止2依赖性终止Rho需要蛋白因子，一种依赖的解旋酶蛋白识别上的Rho ATP RNA-DNA RhoRNA（利用）位点，沿分子向端移动，最终到达聚合酶处，使rut rhoRNA3RNA RNA链与模板和聚合酶分离DNARNA两种机制比较非依赖性终止通常更为精确，在特定序列处终止；而依赖性终止则提供了Rho Rho额外的调控层次，可以响应细胞内环境变化一些抗生素如比西霉素能特异性抑制蛋白，导致转录终止异常Rho转录终止是合成的最后阶段，确保链在正确位置释放，防止无谓的转录延续在原核RNA RNA生物中，终止信号通常位于编码区后方，确保完整基因序列的转录终止效率对于基因表达调控也非常重要，一些重要的调控机制如阿托努蛋白（）就是基于提前终止原理attenuation真核转录终止与信号真核生物聚合酶转录终止与端加工密切关联，通常发生在多聚腺苷酸化信号之后这一过程包括两个主要模型多聚依赖的RNA IImRNA3A切割多聚腺苷酸化模型和模型在前者中，被切割并加上多聚尾，同时聚合酶继续转录一段距离后终止；在后者中，-torpedo RNA ARNA外切核酸酶降解切割后暴露的端，追赶并最终导致聚合酶脱离模板5→3RNA5RNA典型的多聚腺苷酸化信号序列为，位于切割位点上游约个核苷酸处切割和多聚腺苷酸化特异性因子识别此信号，与AAUAAA10-30CPSF其他蛋白因子如切割刺激因子、切割因子等共同作用，在下游或富集区域之前的二核苷酸处切割聚合酶羧基CstF CFGU UCA RNA RNA II末端结构域的磷酸化状态变化是调控转录终止的重要信号，与终止相关的因子可识别特定磷酸化模式CTD初级转录本的处理初级转录本合成聚合酶直接转录产生的未经修饰的分子RNA RNA加工修饰包括加帽、多聚腺苷酸化和内含子剪接等过程53质量控制检查完整性与正确性，清除错误RNA RNA在原核生物中，初级转录本通常无需进一步加工即可作为成熟的发挥功能这是因为原核生物基因组更为紧凑，基因结构简单，没有内含子RNA-外显子结构，转录与翻译在细胞质中同时进行一些原核和可能需要简单的修饰，但与真核生物相比要简单得多tRNA rRNA真核生物则需要对初级转录本进行复杂的加工由聚合酶转录的前体（也称为异质核，）需要经过一系列加工步骤才能RNA IImRNA RNAhnRNA成为成熟的这些加工包括端加帽、内含子剪接和端多聚腺苷酸化这些修饰不仅影响的稳定性和输出，还决定其翻译效率mRNA53mRNA和也需要特定的加工和修饰才能获得正确的结构和功能这些加工过程通常在转录同时或转录后立即在细胞核内进行rRNAtRNA帽结构添加5磷酸基团去除γ-三磷酸末端的磷酸被三磷酸酶去除RNA5γ-RNA转移GMP鸟嘌呤转移酶催化的加到端，形成三磷酸键GTP GMPRNA55-5甲基化鸟嘌呤的位被甲基化，形成帽；后续可能还有甲基化N7m7G2-O-帽结构（）是真核的重要特征，由三部分酶促反应完成首先，三磷酸酶5m7GpppN mRNA RNA去除新生末端的磷酸；然后，鸟嘌呤转移酶将从转移到二磷酸末端，形RNA5γ-GMP GTPRNA5成独特的三磷酸键；最后，（鸟嘌呤）甲基转移酶在鸟嘌呤的位添加甲基基团，形5-5RNA-7N7成帽这一过程通常在转录起始后链长度达到约个核苷酸时即开始m7G RNA20-30帽结构具有多重重要功能保护端免受核酸外切酶降解，延长半衰期；参与m7G mRNA5mRNA的核质运输，被核孔复合体识别；被翻译起始因子识别，促进翻译起始复合物的组装；mRNA eIF4E区分内源性与病毒，参与先天免疫识别一些病毒如流感病毒会盗取宿主细胞mRNA RNAmRNA的帽结构（），用于自身的合成，逃避宿主免疫系统的识别cap-snatching RNA端多聚腺苷酸化3识别信号序列（切割和多聚腺苷酸化特异性因子）识别保守序列，而（切割刺激因子）识别下游的富集区域这些蛋白因子共同决定切割的精确位置，通CPSF AAUAAACstF GU/U RNA常在下游个核苷酸处的二核苷酸后AAUAAA10-30CA链切割RNA切割因子和（和）与和形成复合物，切断链切割后，上游片段保留作为的主体部分，而下游片段迅速被降解切割位点通常保守但不完全I IICFI CFIICPSF CstFRNA mRNA精确，可能在相邻的几个位置发生多聚尾添加A切割后，多聚腺苷酸聚合酶（）在端添加约个腺苷酸残基，形成多聚尾这一过程不需要模板，完全由的催化活性完成多聚结合蛋白PAP RNA3200-250A PAPA（）结合新合成的多聚尾，控制其最终长度并保护其免受降解PABP A剪接机制及重要性内含子外显子边界识别-剪接过程首先需要精确识别内含子外显子边界，这依赖于内含子两端的保守序列剪接位点-5（，）通常含有保守序列，而剪接位点（，）含有保5splice site5ss GU33splice site3ss守序列此外，内含子内部还包含支点序列（），通常含有保守的核苷酸AG branchsite A剪接体组装剪接体由多个小核核糖蛋白（，包括、、和）和辅助蛋白组成snRNP U1U2U4/U6U5首先识别剪接位点，结合支点序列，然后和加入形成催化活性的剪接体U15U2U4/U6U5这些组分按照严格的顺序组装成前剪接体、催化活性剪接体转酯反应与内含子去除剪接过程包括两步转酯反应首先，剪接位点的与支点序列形成磷酸二酯键，5G A2-5产生套索结构；然后，剪接位点前的羟基攻击外显子间的磷酸二酯键，连接两个3AG3外显子并释放内含子套索这种机制确保了精确的剪接，维持阅读框的完整性剪接是真核基因表达的关键步骤，其重要性体现在多个方面首先，剪接移除干扰蛋白质编码RNA的内含子，确保成熟包含连续的编码序列其次，通过可变剪接，单个基因可以产生多种mRNA变体，大大增加蛋白质组的多样性研究表明，人类约的多外显子基因存在可变剪接，mRNA95%这是产生人类蛋白质多样性的重要机制可变剪接实例外显子跳跃互斥外显子一些外显子在某些情况下被完全跳过，不包含在成两个或多个外显子互斥存在，中只包含其中mRNA熟中2一个mRNA内含子保留选择性剪接位点某些内含子不被剪除，保留在成熟中使用不同的或剪接位点，改变外显子长度mRNA53肌肉中的和是可变剪接的经典例子基因含有个外显子，通过不同的剪接模式，可以产生多种肌肉特异性亚型在平滑肌细胞中，外α-β-tropomyosin Tropomyosin11显子和被跳过；在骨骼肌细胞中，外显子被保留而外显子被跳过；而心肌细胞则包含外显子、和这种组织特异性的剪接模式由细胞特异性剪接因子调控，如2372239肌肉特异性剪接因子和蛋白等MBNL1PTB可变剪接高度组织特异性，受多种因素调控环境刺激（如热休克、氧化应激）、发育阶段和细胞分化状态都会影响剪接模式许多疾病与异常剪接相关，如肌营养不良、脊髓性肌萎缩和多种癌症因此，靶向剪接调控的治疗策略成为新药开发的重要方向例如，脊髓性肌萎缩症治疗药物通过调节基因的可变剪接SMA NusinersenSMN2模式，增加功能性蛋白的产生SMN剪接体组成U1snRNP含有和多种蛋白质，包括、和通过碱基配对识别并结合剪接位点，是剪接起始的关键组分U1snRNA U1-70K U1-AU1-CU1snRNP5U1snRNA的端与内含子起始处的序列及其周围区域互补配对5GUU2snRNP包含和多种蛋白因子，如和识别并结合内含子的支点序列，形成特殊的结构识别多嘧啶区，U2snRNA U2AF35U2AF65U2snRNP RNAU2AF65识别剪接位点二核苷酸，共同促进的结合U2AF353AG U2snRNP三U4/U

6.U5snRNP由、和组成的大型复合物，结合已经形成的前剪接体加入此复合物后，发生构象重排，释放，与形成催化中心，而帮助定U4U6U5snRNP U4U6U2U5位外显子这些结构变化激活剪接体催化活性，使转酯反应能够进行剪接体是由和蛋白质组成的巨大分子机器，分子量超过兆道尔顿它由五种主要的小核核糖核蛋白复合物（、、、和）和约种RNA3U1U2U4U5U6snRNP300相关蛋白组成每个都含有一种或两种特定的小核（）和多种蛋白质这些蛋白质包括蛋白（形成环，稳定结构）和特异性蛋白snRNP RNAsnRNA SmSm snRNA（与特定相关联）snRNP剪接体的组装和解离是高度动态的过程，涉及多次水解驱动的构象变化剪接体中的组分（）通过碱基配对形成催化中心，而蛋白质组分则参与识ATPRNAsnRNA别剪接信号、稳定构象和调节剪接反应研究表明，剪接体的催化机制与Ⅱ类内含子自剪接相似，支持世界假说中作为早期催化分子的观点最近的RNA RNA RNA高分辨率冷冻电镜结构进一步揭示了剪接体组装和催化的分子细节剪接信号与保守序列剪接元件保守序列位置功能剪接位点内含子端被识别5GURAGU5U1snRNP剪接位点内含子端被识别3AG3U2AF35支点序列内含子中部形成套索结构YNYURAY多嘧啶区支点序列与剪接位点被识别Yn3U2AF65之间外显子剪接增强子多样外显子内促进相邻外显子识别外显子剪接抑制子多样外显子内抑制相邻外显子识别规则是剪接位点最基本的保守特征，指内含子通常以开始，以结束（对应基因组序列）GT-AG GTAG DNA这一规则适用于超过的内含子，被称为典型或型内含子少数内含子不遵循这一规则，如型内含99%U2U12子（占哺乳动物内含子约）通常以为边界，由不同的剪接体组分（、等）识别

0.5%AT-AC U11U12除了基本的剪接位点序列外，许多顺式作用元件也参与剪接调控外显子剪接增强子（）和剪接抑制子ESE（）分别促进和抑制外显子识别；内含子剪接增强子（）和抑制子（）则影响内含子的识别和去除ESS ISEISS这些元件通过结合反式作用因子如蛋白（促进剪接）和蛋白（通常抑制剪接）发挥作用这种复杂SR hnRNP的调控网络使细胞能够精确控制可变剪接模式，产生特定的变体mRNA剪接异常与疾病脊髓性肌萎缩症（）地中海贫血SMAβ-脊髓性肌萎缩症是由基因突变导致的常见遗传性神经肌地中海贫血是一组由珠蛋白基因（）突变导致的遗传SMN1β-β-HBB肉疾病，特征是运动神经元退化和肌肉萎缩人类基因组含有两性血液疾病，表现为异常的珠蛋白合成和严重贫血多种β-β-个几乎相同的基因拷贝和提供大地中海贫血变异影响剪接，包括内含子边界突变破坏SMN SMN1SMN2SMN1mRNA部分功能性蛋白，而由于外显子中的单核苷经典的剪接位点；内含子内部突变激活隐性剪接位点；SMN SMN27C→T GT-AG酸变异导致剪接异常外显子或内含子突变影响剪接调控元件这个变异破坏了一个外显子剪接增强子（）或创造了一个外例如，第一内含子位突变显著削弱了剪接位点的ESE HBB+5G→C5显子剪接抑制子（），导致转录物约跳过外显强度，导致异常剪接和珠蛋白缺乏另一类常见的变异是内ESS SMN290%β-子，产生不稳定的截短蛋白等反义寡核苷酸药含子中的突变创造新的剪接位点，导致加入额外序列或使用隐性7Nusinersen物通过靶向前体，增强外显子的包含，增加功剪接位点，最终产生无功能蛋白基因治疗和剪接调控药物为这SMN2mRNA7能性蛋白的产生，为患者提供了有效治疗方案类疾病提供了新的治疗希望SMN SMA编辑现象RNA编辑是指转录后碱基发生化学修饰，导致序列与模板编码序列不一致的现象在哺乳动物中，最常见的编辑类型是腺苷脱氨作用，RNA RNA RNADNARNA即（腺苷变成肌苷）编辑，由（腺苷脱氨酶作用于）家族酶催化由于肌苷在翻译过程中被识别为鸟嘌呤，编辑实际上导致了A-to-I ADAR RNAA-to-I A-转换另一种编辑类型是胞嘧啶脱氨作用（编辑），由家族酶催化，如在肠道中编辑载脂蛋白to-GC-to-U APOBECB mRNA家族包括三个成员、和和在多数组织表达并具有编辑活性，而主要在脑中表达但无已知编辑活ADAR ADAR1ADAR2ADAR3ADAR1ADAR2ADAR3性酶通过双链结合域识别底物，然后催化腺苷脱氨基转变为肌苷编辑在中枢神经系统功能中尤为重要，影响神经递质受体和离子ADAR RNAdsRNA RNA通道的功能例如，谷氨酸受体的位点编辑改变了离子通透性，对脑功能至关重要编辑异常与多种疾病相关，包括癫痫、肌萎缩侧索硬化症、GluR2Q/RRNA抑郁症和某些癌症运输过程RNA细胞质中的蛋白质重塑通过核孔复合物转运一旦到达细胞质，经历蛋白质组与输出因子结合mRNP核孔复合物（）是巨大的蛋白质组分的动态变化核内加入的某些蛋白被NPC蛋白复合物形成RNA-出核依赖于特定的输出因子，主装体，横跨核膜，由约种不同的核孔移除，如被取代，mRNA30CBC eIF4E PABPN1成熟的mRNA在核内与多种RNA结合蛋要是NXF1/TAP-NXT1/p15异二聚蛋白（nucleoporins）组成mRNP通被PABPC取代；同时加入新的细胞质特白结合，形成信使核糖核蛋白颗粒体复合物剪接过程中加入到上过与中富含苯丙氨酸甘氨酸重复异性结合蛋白这种的重塑mRNA NPC-RNA mRNP（mRNP）这些蛋白包括帽结合复合的蛋白标记（如TREX复合物）招募序列（FG-repeats）的核孔蛋白相互使mRNA适应细胞质环境，准备进行翻物（CBC）、剪接连接复合物（EJC）、NXF1/TAP，后者直接与核孔复合物相作用，穿过中央通道转运到细胞质这译或被靶向到特定细胞区室多聚结合蛋白（）以及其他互作用另一条平行途径通过一过程需要水解提供能量，核仁素A PABPN1CRM1ATP结合蛋白这些蛋白不仅保护（也称为）和介等解旋酶帮助重塑以适应通RNA exportin-1RanGTP RNA mRNP免受降解，还充当核质运输的标导，主要用于特定亚群的输出道mRNA mRNA记，同时参与翻译和定位调控降解与稳定性RNA端帽去除5脱腺苷酸化降解通常始于去帽复合物（包括）mRNA DCP1/DCP2和复合物缩短多聚尾CCR4-NOT PAN2-PAN3A去除帽结构5削弱保护作用•PABP暴露单磷酸末端•5可能触发帽去除•5触发降解途径•5→3内切核酸酶切割外切核酸酶降解特定内切核酸酶在RNA内部位点切割XRN1（5→3方向）和外粒体复合物（3→5方向）降解主链引导的切割RNA•miRNA•IRE1介导的切割•XRN1需要5单磷酸末端•产生新的降解底物•外粒体是多亚基复合物稳定性是基因表达调控的重要层次，不同分子具有不同的半衰期，从几分钟到几天不等稳定性主要由其结构特征和相关结合蛋白决定RNA RNA mRNA RNA5帽结构防止外切核酸酶降解；多聚尾通过结合保护末端；编码区和中的顺式作用元件（如富集元件，）可促进或抑制降解5→3A PABP3UTR AUARE是调控稳定性的关键因子，通过与靶部分互补配对，招募复合物，导致翻译抑制和或降解哺乳动物中，主要通miRNA RNA mRNA3UTR RISC/mRNA miRNA过促进脱腺苷酸化和降解发挥作用体（）是细胞质中富含降解酶和抑制翻译因子的无膜区室，是降解和储存的重要场所RNA Pprocessing bodiesRNA mRNA在应激条件下，应激颗粒形成并暂时储存非翻译，保护其免受降解，直到应激解除mRNA质量控制机制RNA无义介导衰变非终止密码子介导衰变翻译质量控制NMD RQCNGD是监测和降解含有过早终止密码系统监控和处理异常翻译产物NMD RQC子的的机制当翻译遇当核糖体在上停滞时，例如由当核糖体停滞时，复合物（包括PTC mRNA mRNA RQC到距离最后一个外显子外显子连接处于强二级结构、稀有密码子或缺乏终泛素连接酶）识别-Ltn1/Listerin E3超过个核苷酸的时，通常止密码子，触发途径停滞的核新生多肽链，将其泛素化并导向蛋白50-55PTC NGD会触发这一过程依赖于剪接过糖体被识别，导致翻译终止和酶体降解这防止了截短或错误折叠NMD mRNA程中沉积在外显子连接处的外显子连降解过程包括停滞核糖体的蛋白的积累，保护细胞免受蛋白质毒NGD接复合物，以及关键效应蛋白检测、核糖体解离、内切酶切割和性与神经退行性疾病如肌萎缩EJC RQC、和上游的碎片降解侧索硬化症密切相关UPF1UPF2UPF3PTC mRNADom34Pelota ALS在翻译第一轮中被发现，招募和蛋白在识别停滞核糖体和促进EJC Hbs1因子，最终导致加速降其解离中发挥关键作用NMD mRNA解质量控制机制是细胞防御系统的重要组成部分，防止有缺陷的产生有害蛋白这些机制能识别并清除各种异常RNA RNA，包括含过早终止密码子的、缺乏终止密码子的、含有错误剪接位点的转录物等质量控制机制与RNA mRNA mRNA正常降解途径密切相关，但通常具有特定的识别和执行组分RNA无义介导衰变不仅清除疾病相关的突变转录物，还调节约正常基因的表达这些基因往往编码结合蛋NMD10%RNA白和剪接因子，形成复杂的调控网络功能障碍与多种疾病相关，包括遗传性疾病和癌症例如，地中海贫血NMDβ-患者中的某些突变产生含的珠蛋白，不同个体效率的差异可能解释疾病严重程度的变异因此，针PTCβ-mRNA NMD对质量控制机制的治疗策略，如抑制剂，可能成为某些遗传病的潜在治疗方法RNA NMD原核合成特点RNA简单的合成机制缺少复杂修饰RNA原核生物合成过程相对简单，只原核通常不需要复杂的加工，RNA mRNA需要一种聚合酶完成所有类型转录产物几乎可以直接作为成熟RNA的转录这种聚合酶由、、两使用原核没有帽结RNAββmRNA mRNA5个和亚基组成核心酶，配合不同的构和多聚尾，端保留三磷酸，αω3A53因子识别不同类型的启动子原核端通常有发卡结构但无特殊修饰原核σ聚合酶不需要如真核那样复杂的基因不含内含子，因此不需要剪接过程RNA辅助因子体系，转录起始只需因子结某些原核和可能需要简单σtRNA rRNA合核心酶后识别启动子即可进行修饰，但与真核相比要简单得多转录与翻译共时性原核生物最显著的特点是转录和翻译在时间和空间上的耦合由于缺乏核膜隔离，在合成过程中即可被核糖体识别并开始翻译，不需要转运环节这种共时性mRNA使基因表达更为高效，允许原核生物对环境变化做出快速响应同时，这种机制也限制了转录后调控的水平，使原核基因表达主要受转录水平调控真核合成特点RNA核内转录转录在细胞核内进行，不同类型由专门聚合酶合成DNARNA复杂加工RNA初级转录本需经过一系列修饰加帽、剪接、多聚腺苷酸化核质运输成熟通过核孔复合体转运至细胞质RNA细胞质翻译在细胞质中被核糖体翻译成蛋白质mRNA真核合成的最主要特点是空间和时间上的分隔转录过程在细胞核内完成，而翻译则在细胞质中进行，两者由核膜隔开这种分隔创造了多层次的调控机会，包括转录水平、加工水平、核质运输水平和翻译水平RNA RNA等，使真核基因表达调控更为精细核膜的分隔也防止了未成熟的翻译，避免产生有害蛋白，对细胞生存至关重要RNA真核需要一系列复杂的修饰才能成熟并发挥功能需要添加帽结构、多聚尾，并去除内含子；前体需要切割和化学修饰才能与核糖体蛋白组装成核糖体亚基；需要剪切、修饰和添加末端RNAmRNA53A rRNAtRNA CCA这些修饰由专门的酶复合物完成，每个步骤都受到严格调控，错误可能导致疾病发生真核加工的复杂性反映了真核生物调控网络的精细性，也为疾病治疗提供了多个潜在靶点RNA原核和真核转录差异表特征原核生物真核生物聚合酶单一种类三种主要类型（、、）RNA Pol IIIIII启动子识别因子识别和区域多种转录因子识别多元件启动子σ-10-35转录单位多顺反子（多基因）单顺反子（单基因）mRNAmRNA加工几乎无需加工需要加帽、多聚腺苷酸化、剪接RNA内含子几乎没有内含子大量内含子，需要剪接转录与翻译时空耦合，同时进行时空分离，转录在核内，翻译在细胞质转录终止依赖或非依赖终止与多聚腺苷酸化相关Rho抗生素靶点利福平、斯特托霉素鹅膏毒素、放线菌素α-D染色质结构简单，无核小体复杂，有核小体结构主要调控层次转录水平转录、转录后和翻译水平原核和真核生物的转录过程展现了生命演化的不同策略原核生物追求效率和快速响应，具有简单紧凑的基因组和高效直接的转录翻译系统；而真核生物则发展出更复杂精细的调控网络，通过多层次调控实现更精确的基因表达控制这些差异是细胞-结构和生命复杂性进化的直接体现值得注意的是，尽管原核和真核转录系统有显著差异，但核心催化机制高度保守，反映了所有生命形式的共同起源聚合RNA酶的催化中心结构和功能在细菌和人类细胞中惊人相似，这也是某些抗生素能特异靶向细菌聚合酶而相对不影响人类细胞RNA的基础原核聚合酶特性RNA5核心亚基数构成核心酶，加上因子形成全酶α2ββωσ450分子量kDa原核聚合酶是一个大型多亚基酶复合物RNA7因子类型σ大肠杆菌拥有多种因子，识别不同启动子σ30-50合成速率秒nt/原核聚合酶合成速度约为真核的倍RNA2原核聚合酶作为单一酶种执行所有合成功能，通过与不同因子结合来实现基因表达的调控核心酶由五个亚基组成（），负责催化核苷酸加入和RNA RNAσα2ββω链延长；而因子则赋予酶识别特定启动子的能力，是基因特异性表达的关键大肠杆菌拥有多种因子，如（主要因子，识别大多数生长相关基因）、RNAσσσ70σ32（热休克基因）、（氮代谢基因）等不同因子的存在使细菌能够根据环境条件和生长阶段快速调整基因表达谱σ54σ聚合酶与因子的相互作用是动态的转录起始时，因子与核心酶结合形成全酶，识别启动子并起始转录；当转录进入延长阶段后，因子通常会解离，可以被RNAσσσ重复利用一些转录调控因子，如抗终止因子，会在因子解离后与核心酶结合，影响转录延长和终止过程利福平（）等抗生素通过结合聚合NusAσrifampicin RNA酶亚基，阻断链起始合成，特异性抑制细菌转录，是临床重要的抗菌药物利福平与人类聚合酶结合亲和力低，展现了良好的选择性，这源于细菌和人类βRNA RNA聚合酶结构上的微妙差异RNA真核三类聚合酶比较RNA聚合酶聚合酶RNAIRNA II主要负责合成核糖体（、和负责转录所有蛋白质编码基因和多种非编码RNA28S18S），这些构成核糖体的主，如前体、等是

5.8S rRNArRNA RNAmiRNA snRNA Pol II要骨架转录活动集中在核仁，占细胞转最复杂和研究最深入的聚合酶，由个亚基Pol I12录活动的约其启动子和终止子结构高度组成其羧基末端结构域含有多个60%CTD特化，使用特定的转录因子如和七肽重复，其磷酸化状态调控转录SL1/TIF-IB YSPTSPS突变与特定的遗传综合征如小脑周期的不同阶段鹅膏毒素通过结合UBF Pol Iα-Pol II发育不全相关最大亚基，特异性抑制其活性聚合酶RNA III专门合成小型非编码，包括、和某些由个亚基组成，是三种RNAtRNA5S rRNAsnRNAPol III17聚合酶中最大的其启动子通常位于转录单位内部（内部启动子），而非上游活性在细胞周期Pol III中受到严格调控，在细胞分裂期间显著降低肿瘤抑制蛋白如和能抑制活性，而许多癌p53RB Pol III症中活性增强Pol III从进化角度看，三种聚合酶共享核心催化亚基和基本催化机制，反映出它们的共同起源它们的分化可能RNA反映了生物对不同类型合成的精细调控需求例如，核糖体需要大量合成，因此高度专一化并RNA RNAPolI具有最高的转录速率；而蛋白质编码基因需要多样化的表达调控，因此具有最复杂的调控机制Pol II在实际研究中，可通过特异性抑制剂区分三种聚合酶活性鹅膏毒素（）低浓度时特异抑制α-α-amanitin，高浓度时也抑制，但几乎不影响；放线菌素（）则通过结合阻止所PolIIPol III PolID actinomycinD DNA有聚合酶活性通过这些抑制剂，研究人员可以区分细胞中不同聚合酶的活动并研究特定合成途径RNARNA启动子结构对比原核盒真核盒PRIBNOW TATA原核生物启动子的核心元件是盒（也称区域），真核生物聚合酶启动子更为复杂，常见的核心元件包括位PRIBNOW-10RNA II位于转录起始点上游约个碱基处，具有保守序列于转录起始点上游约个碱基处的盒（序10TATAAT25-30TATA TATAAA这一区域在转录起始时首先解链，富含碱基对使双链列）盒被结合蛋白（）识别，是转录起始复A-T DNATATA TATATBP在此处易于解开另一个重要元件是区域（序合物组装的锚点其他常见元件包括位于起始点附近的起始子-35TTGACA列），与因子的特定区域结合序列（）、下游启动子元件（，位于起始点下游约σInr DPE30个碱基）、识别元件（）等TFIIBBRE原核启动子通常还包括元件（上游元件），位于至UP-40-60区域，富含碱基对，与聚合酶亚基的端结构域结合约的人类基因缺乏典型盒，这些基因往往包含A-TRNAαC30-50%TATA增强启动子活性不同基因的启动子序列与共有序列的匹配程度岛，启动子区域富含序列这类无盒启动子依赖CpG CGTATA不同，导致启动子强度差异，影响基因表达水平强启动子（如等转录因子与盒结合启动转录真核启动子的多样性与Sp1GC基因启动子）与共有序列高度匹配，而弱启动子则存在较基因表达模式密切相关含盒的基因往往表达水平高但组rRNA TATA多变异织特异性强，而无盒基因则多为持家基因，在多种组织中TATA保持低水平稳定表达原核转录调控细节阻遏状态诱导物结合无诱导物存在时，阻遏蛋白结合操作子，阻止转录诱导物（如乳糖）与阻遏蛋白结合，导致其构象改变2基因表达阻遏解除转录启动，产生多顺反子mRNA，翻译产生相关酶3阻遏蛋白从操作子解离，RNA聚合酶能够结合启动子操纵子模型是原核转录调控的经典模式，以乳糖操纵子（）为典型代表乳糖操纵子包含三个结构基因（编码半乳糖苷酶）、（编码乳糖透酶）和lac operonlacZβ-lacY lacA（编码硫代半乳糖苷转乙酰酶）这些基因共同转录为一个多顺反子，协调表达乳糖代谢所需的酶操纵子的调控区包括启动子（聚合酶结合）、操作子（阻遏蛋白mRNA RNA结合）和调控基因（编码阻遏蛋白）lacI环境信号通过多种机制影响基因表达除了负调控（阻遏蛋白阻止转录）外，还存在正调控机制，如阴性触发蛋白（）在葡萄糖缺乏时，细菌中环腺苷酸（）水平升CAP cAMP高，与结合形成复合物，再结合至乳糖操纵子的位点，增强聚合酶与启动子的亲和力，促进转录这种双重调控（葡萄糖抑制和乳糖诱导）使细菌能够优先cAMP CAPCAP RNA利用更高效的碳源，展现出精巧的代谢适应性类似的操纵子调控机制广泛存在于原核生物中，如色氨酸操纵子、阿拉伯糖操纵子等，但调控细节各不相同，反映了原核生物对不同环境信号的精细响应能力真核转录调控网络染色质水平调控组蛋白修饰和染色质重塑控制可及性DNA转录因子结合顺式元件与反式因子相互作用转录起始复合物组装转录因子招募和稳定基础转录机器转录延长调控4暂停、延长和终止的动态调控转录后调控加工、稳定性和翻译效率RNA真核转录调控网络远比原核复杂，形成多层次的精细控制系统增强子（）是远距离调控元件，可位于目标基因上游、下游或内含子中，通常含有多个转录因子结合位点增强子通过染色质环enhancer化与启动子区域接触，通过与启动子结合的蛋白质相互作用促进转录与此相反，沉默子（）则抑制基因表达，招募阻遏蛋白或引起染色质压缩silencer染色质状态是真核转录调控的首要层次组蛋白修饰如乙酰化（通常激活转录）、甲基化（可激活或抑制）和磷酸化等影响染色质结构和蛋白质结合组蛋白乙酰转移酶（）和去乙酰化酶（）HAT HDAC动态调节组蛋白乙酰化水平甲基化（主要在位点）通常与基因沉默相关，招募甲基结合蛋白和组蛋白修饰酶依赖的染色质重塑复合物（如、、和家族）DNA CpGCpG ATPSWI/SNF ISWICHD INO80改变核小体位置或结构，调控可及性这些调控机制的异常与多种疾病如癌症密切相关，成为表观遗传治疗的重要靶点DNA多基因转录与单基因转录原核多基因转录真核单基因转录原核生物的多顺反子包含多个编码区（密真核生物的通常是单顺反子的，每个mRNAmRNA码子区），每个编码区有自己的起始密码子和终只包含一个蛋白质的编码信息真核基因mRNA止密码子，编码不同的蛋白质这些基因通常功表达需要更复杂的调控，每个基因通常有自己的能相关，参与同一生化途径或细胞过程例如，启动子、增强子和其他调控元件虽然同一功能大肠杆菌乳糖操纵子编码三种负责乳糖代谢的酶；通路的基因可能有共同的调控元件，但它们一般核糖体蛋白操纵子包含多个编码核糖体蛋白的基独立转录这种设计增加了调控精度，允许细胞因根据需要调整特定蛋白的表达水平单个启动子控制多个基因每个编码一种蛋白质••mRNA节省能量和调控资源具有非翻译区和非翻译区••53确保功能相关蛋白的协调表达允许更精细的基因表达调控••例外情况原核和真核转录模式存在一些例外一些古细菌和少数细菌基因不形成操纵子，而是独立转录而在真核生物中，也存在少量二顺反子的例子，尤其在线虫、果蓝和哺乳动物中发现的上游开放阅读框mRNA调控机制这些例外反映了生物进化的复杂性和多样化适应策略uORF原核中的非操纵子基因•真核中的上游开放阅读框•uORF某些病毒使用多顺反子策略•剪接与进化意义RNA增加蛋白质多样性外显子洗牌与域重组适应性调控可变剪接是产生蛋白质多样内含子的存在使外显子洗牌成为可可变剪接为细胞提供了额外的调控RNA性的重要机制，无需增加基因组大能，即通过基因重组将不同基因的层次，可以对不同发育阶段、组织小通过不同剪接模式，单个基因外显子组合形成新基因这一机制类型或环境条件作出响应例如，可以产生多种和蛋白变体，促进了新蛋白功能域的进化，因为基因在果蓝神经系统发育mRNA Dscam每种变体可能具有不同的功能、定许多外显子恰好编码一个功能结构中通过可变剪接可理论上产生超过位或调控特性这种机制在高等真域或其一部分例如，纤连蛋白、种不同的蛋白异构体，对38,000核生物尤为重要，人类约的多肌联蛋白等大型多域蛋白就是外显神经元特异性连接至关重要这种95%外显子基因存在可变剪接，平均每子洗牌的产物，其中各功能域往往机制使生物能够用有限的基因组编个基因可产生种不同转录物由单独的外显子或外显子组编码码更复杂的表型，是复杂生物进化7-8的重要基础剪接在进化上可能起源于自剪接内含子，这些内含子具有自催化能力，无需蛋白质即可自行切除Ⅱ类RNA自剪接内含子与核前体剪接的反应机制惊人相似，都通过两步转酯反应完成，形成套索中间体这一mRNA相似性支持内含子迟出假说，即内含子是在真核生物进化早期由转座元件或其他移动遗传元件插入基因而形成的内含子的进化意义仍有争议，但越来越多的证据表明它们在基因组进化和表达调控中发挥重要作用内含子可能为基因重组提供安全区域，降低破坏编码序列的风险；它们还可以通过内含子保留或去除调节基因表达水平；内含子中的调控元件可以影响转录、剪接和出核等过程总体而言，剪接和内含子外显子mRNA RNA-结构的出现是真核生物进化的重要里程碑，为复杂多细胞生物的发展提供了基础可变剪接在人类基因组中的普遍性RNA95%多外显子基因人类多外显子基因发生可变剪接比例7-8平均变体数每个人类基因平均产生的变体数量mRNA38%外显子跳跃外显子跳跃在所有可变剪接事件中的比例15-50%组织特异性不同组织间可变剪接模式差异的比例范围高通量测序技术的发展极大地提高了我们对可变剪接普遍性的认识早期研究估计约的人类基因存在可变剪接，而现代分析表明，实际比例远高于此，RNA30-40%RNA-seq约的多外显子基因能产生多种剪接变体外显子跳跃是最常见的可变剪接类型，约占所有事件的，其次是选择性或剪接位点和内含子保留大多数剪接变体在蛋白95%38%53质水平显示功能差异，如改变蛋白质蛋白质相互作用、细胞定位或酶活性-可变剪接表现出显著的组织特异性和发育阶段特异性大脑组织显示最复杂的可变剪接模式，估计约个可变剪接事件在脑组织特异性表达中枢神经系统中特有的可变25,000剪接调控蛋白包括、和等，它们在神经元分化和突触功能中发挥关键作用可变剪接异常与多种人类疾病相关，包括神经退行性疾病、肌肉疾病和多种癌Nova nPTBnSR100症例如，前额颞叶痴呆与帕金森病综合征与基因外显子的可变剪接失调相关；肌营养不良与肌肉特异性转录物异常剪接相关；而癌症中可变剪接的改变可影响FTDP tau10细胞增殖、凋亡和转移相关基因研究可变剪接调控机制对理解人类疾病发病机制和开发新型治疗方法具有重要意义原核、真核合成实验对比RNA大肠杆菌体外转录系统原核体外转录实验通常使用纯化的大肠杆菌聚合酶和因子，与含启动子的RNAσ模板混合反应需要四种核糖核苷酸三磷酸、⁺离子和适当的缓冲DNA NTPsMg²条件这一系统相对简单，只需要聚合酶全酶即可完成从识别启动子到转录终RNA止的整个过程通过使用不同的因子，可以研究不同类型启动子的识别和调控σ细胞系体外转录系统HeLa真核体外转录要复杂得多，通常使用细胞核提取物或重组表达的组分完整HeLa的体外转录需要聚合酶及多种通用转录因子、、、RNA IITFIIA TFIIBTFIID、和此外，为实现激活子依赖的转录，还需要中介体复合物TFIIE TFIIFTFIIH和其他辅助因子转录后加工如加帽、多聚腺苷酸化和剪接可在添加相应酶复合物的情况下进行产物分析方法转录产物分析常用方法包括放射性标记的掺入测定总合成；凝胶NTP RNA电泳分析大小和完整性；引物延伸或核酸酶保护分析确定转录起始位RNA S1点；和北方印迹检测特定转录物；测序分析序列和修饰现代RT-PCR RNA技术如则提供全转录组水平的信息，能同时分析表达水平和剪接模RNA-seq式合成过程中的调控靶点RNA利福平作用机制利福平是临床重要的抗结核药物，特异性靶向细菌聚合酶亚基它结合于聚合酶活性中心附近的口袋，阻断链延伸超过个核苷酸，有效抑制转rifampicin RNAβRNA2-3录起始由于细菌和人类聚合酶在该区域的氨基酸序列差异，利福平对人类细胞的合成几乎无影响，展现出优异的选择性RNARNA鹅膏毒素作用α-鹅膏毒素是毒伞菌产生的环肽毒素，特异性抑制真核聚合酶低浓度时选择性抑制，高浓度还能抑制，但对几乎无影响α-RNAII1μg/ml PolII100μg/ml PolIIIPolI它通过结合最大亚基的桥区域，阻碍聚合酶构象变化，减慢聚合酶移动速度鹅膏毒素是研究不同聚合酶功能的重要工具，也是致命的肝毒素PolIIα-RNA剪接调节药物随着对剪接机制认识的深入，靶向剪接过程的药物开发取得重要进展是首个获批的剪接调节药物，通过结合基因前体上的内含RNA NusinersenSpinrazaSMN2mRNA子剪接抑制序列，增强外显子的包含，用于治疗脊髓性肌萎缩症其他处于临床开发阶段的剪接调节药物包括用于杜氏肌营养不良的外显子跳跃药物和靶向剪接体组分的小7分子抑制剂与技术简介RT-PCR RNA-seq基本原理高通量分析RT-PCR RNA-seq逆转录聚合酶链反应（）是研究基因表达的经典方法，测序（）是基于高通量测序技术的转录组分析方RT-PCR RNARNA-seq包括两个关键步骤首先，逆转录酶将转化为互补法典型工作流程包括提取和质量控制；文库制备（如RNADNARNA（）；然后，特异性引物用于扩增目标序列根据检富集或去除、合成和片段化）；测序（如cDNA PCRmRNA rRNAcDNA测方法不同，分为常规型、实时定量型（）、或平台）；数据分析RT-PCR qRT-PCR IlluminaPacBio OxfordNanopore和数字（）等通过荧光信号实时监测（读段比对、表达定量、差异分析）提供全基因组PCR dPCRqRT-PCR RNA-seq产物积累，实现精确定量，是基因表达研究的金标准范围的表达信息，无需预先了解序列PCR的优势在于其无偏好性和高覆盖度，能发现新转录本RNA-seq适用于特定基因的表达分析，具有灵敏度高、特异性和变体，检测可变剪接、基因融合和编辑等事件基RT-PCR RNARNA好、所需样品量少等优点然而，它只能分析已知序列，且每次于长读长测序的直接甚至可直接分析修饰RNA-seq RNA实验只能检测少数几个基因此外，引物设计、内参基因选择和已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物开发三代RNA-seq扩增效率差异等因素可能影响定量准确性尽管如此，测序技术如纳米孔测序能够直接测序单分子，RT-Nanopore RNA仍是验证其他高通量方法结果的重要工具避免逆转录和偏差，展现出广阔前景PCR PCR疾病相关合成异常实例RNA癌症相关转录异常剪接相关遗传病癌症中转录调控网络经常发生紊乱，表约的致病突变通过影响15-50%RNA现为多种形式启动子区域的甲剪接发挥作用经典案例包括脊DNA1基化改变导致基因沉默或激活；组蛋白髓性肌萎缩症，由基因缺SMA SMN1修饰模式异常影响染色质可及性；转录失和基因外显子剪接异常导致；SMN27因子如、和的功能获地中海贫血中的多种剪接位点突MYC p53NF-κB2β-得或丧失；增强子驱动的异常表达，如变；囊性纤维化跨膜调节因子3前列腺癌中的融合基因的剪接突变，约占囊性纤TMPRSS2-ERG CFTR最近研究发现，超级增强子重编程是癌维化病例的此外，肌营养不良、13%症发生的关键事件，导致细胞身份基因视网膜色素变性和神经纤维瘤病等多种表达模式改变遗传病也与剪接异常相关神经退行性疾病神经退行性疾病中常见代谢异常在肌萎缩侧索硬化症中，和RNA ALSTDP-43FUS等结合蛋白的突变导致剪接和转运障碍亨廷顿病中，含有异常重复的RNARNACAG形成异常结构，干扰结合蛋白功能阿尔茨海默病中，基因huntingtin mRNARNA tau的可变剪接改变导致有害蛋白异构体积累这些发现为开发靶向治疗策略提供了tau RNA新方向人工调控生物合成的前沿技术RNA系统是一项革命性技术，通过使用催化失活的蛋白与不同效应域融合，实现精确靶向调控转录系统将CRISPR/dCas9Cas9dCas9CRISPRa与转录激活域如、、融合，招募转录机器增强基因表达；而系统则将与抑制域如结合，抑制基因dCas9VP64p65HSF1CRISPRi dCas9KRAB转录这些系统通过精确导向特定基因位点，实现多基因同时调控，在基因网络研究和疾病治疗方面展现巨大潜力sgRNA反义核酸药物是合成的单链核酸片段，通过与靶互补配对，影响其代谢过程作用机制多样通过介导的降解；ASO mRNAASO RNaseH mRNA阻断剪接位点影响剪接模式；干扰翻译起始或延长；调控功能等已上市药物包括治疗脊髓性肌萎缩症的、的miRNA ASONusinersen DMD和家族性高胆固醇血症的等药物开发面临递送挑战，新型化学修饰如磷酸硫代、、等和递送系统如脂Eteplirsen MipomersenASOLNA MOE质纳米粒、细胞穿透肽等正在不断优化，以提高药物稳定性和靶向效率合成研究最新进展RNA单细胞转录组RNA解析单个细胞水平的基因表达异质性修饰组学RNA揭示化学修饰的分布与功能RNA空间转录组学结合空间信息的转录表达分析单细胞测序技术彻底改变了我们对细胞异质性的认识，通过分析单个细胞的转录组，揭示了传统混池分析无法察觉的细胞亚群和状态转变主要技术平台RNA包括微流控系统如、微滴法如和板基系统等单细胞测序在发育生物学、肿瘤异质性、神经科学和免疫学等领域取得重大突破，10x GenomicsDrop-seq如精确重建细胞谱系、鉴定罕见细胞类型和解析疾病中细胞状态转变等最新技术如和进一步提高了灵敏度和准确性SMART-seq3scNT-seq修饰组学研究分子上的化学修饰，如、、编辑等，揭示了这些修饰在稳定性、剪接、翻译和定位调控RNA epitranscriptomicsRNAm6Am5C A-to-IRNA中的重要作用高通量检测技术包括抗体免疫沉淀结合测序、、化学标记方法如和直接测序技术直接测序MeRIP-seq miCLIPICE-seq NanoporeRNA研究发现修饰在胚胎发育、干细胞分化和多种疾病中发挥关键调控作用例如，修饰通过影响剪接、降解和翻译，参与调控神经干细胞分化、记忆RNAm6A形成和肿瘤进展靶向修饰的小分子调节剂已成为新型药物开发的前沿方向RNA课程小结与思考加工与修饰转录调控网络RNA合成后的成熟过程多层次精细调控机制RNA帽结构与多聚腺苷酸化染色质结构与表观遗传调控•53•剪接机制与可变剪接功能转录因子网络与信号传导••转录基本过程•RNA编辑与化学修饰•非编码RNA介导的调控未来研究方向从启动子识别到转录终止的核心步骤生物学研究前沿RNA聚合酶的结构与功能单分子水平实时观察合成•RNA•RNA转录起始、延长与终止机制结构与功能的精确调控••RNA原核与真核转录系统的异同基于的疾病治疗策略••RNA通过本课程，我们系统学习了生物合成的分子机制，从转录到加工成熟的全过程我们了解到不仅是遗传信息的中间载体，还具有丰富多样的功能和复杂精细的调控网络合成过程中的RNADNARNARNARNA每一环节都受到严格调控，确保基因精确表达，这种精确性对细胞分化、器官发育和机体稳态维持至关重要研究的未来方向包括进一步解析合成和加工的分子细节，如转录气泡内的聚合酶动力学和剪接体的催化机制；深入了解合成与染色质结构、核内组织、相分离等高级核结构的关系；开发更精准RNARNARNA的靶向治疗策略，如基于编辑和调控的精准医学应用生物学正处于蓬勃发展时期，新技术和新发现不断涌现，为理解生命本质和攻克疾病难题提供新视角和新工具希望各位同学在未来的学习RNARNARNA和研究中，能够继续关注这一激动人心的领域。