《分子生物学实验》课件

《分子生物学实验》欢迎来到《分子生物学实验》课程本课程将系统介绍分子生物学实验的基本原理、技术方法和应用前景，涵盖从DNA、RNA到蛋白质的各种实验技术我们将带领学生掌握当代生命科学研究中最基础也最关键的实验技能通过本课程的学习，同学们将了解分子生物学实验的理论基础，熟悉各种实验方法的操作流程，培养实验设计与数据分析能力，为今后的科研工作奠定坚实基础希望大家在探索生命奥秘的旅程中收获知识与技能课程概述理论与技术基础本课程涵盖分子生物学关键实验技术的理论基础，包括核酸、蛋白质的分离纯化、鉴定与分析方法，帮助学生建立系统的分子生物学实验思维课程目标培养学生掌握分子生物学实验的基本操作技能，建立严谨的实验态度，能够独立设计并执行分子生物学相关实验，分析实验数据并解决问题实验安全规范强调实验室安全意识，包括生物安全操作规程、化学试剂安全使用、废弃物处理等内容，确保实验过程的安全与规范考核方式采用多元化评价机制，包括实验操作技能考核、实验报告撰写、小组项目展示以及期末理论与实践相结合的综合测评分子生物学发展简史（上）年双螺旋结构发现1953DNA沃森（James Watson）和克里克（Francis Crick）在《自然》杂志发表论文，揭示了DNA的双螺旋结构，为分子生物学奠定了基础年中心法则的建立1958弗朗西斯·克里克提出分子生物学中心法则，描述了遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质的传递过程，成为分子生物学的核心理论年遗传密码的破译1961-1966科学家通过一系列实验确定了核苷酸三联体与氨基酸的对应关系，解读了生命的密码本，阐明了遗传信息的翻译规则年代限制性内切酶的发现1970限制性内切酶的发现使科学家能够在特定位点切割DNA分子，为基因克隆和重组DNA技术的发展提供了关键工具分子生物学发展简史（下）年测序技术的发展1977DNA弗雷德里克·桑格尔（Frederick Sanger）开发了链终止法DNA测序技术（Sanger法），使科学家能够精确测定DNA的碱基序列，推动了基因组学的快速发展年技术的发明1983PCR卡里·穆利斯（Kary Mullis）发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，可在短时间内将特定DNA片段扩增数百万倍，彻底改变了分子生物学研究方法年人类基因组计划1990-2003这一国际科学研究项目成功测序并绘制了完整的人类基因组图谱，揭示了人类大约25,000个基因的信息，为个性化医疗奠定了基础年基因编辑技术2012CRISPR-Cas9科学家开发了基于CRISPR-Cas9系统的基因编辑技术，提供了一种简单、高效、精准的基因组编辑方法，开创了基因治疗的新时代什么是分子生物学实验分子生物学的本质研究生命分子结构与功能的科学1实验内容2DNA、RNA、蛋白质的操作与分析技术方法分离、纯化、检测与功能研究学科关联与基因组学、蛋白质组学等紧密相连分子生物学实验是研究生物大分子（主要是核酸和蛋白质）结构与功能的实验科学，通过各种技术手段在分子水平上解析生命过程这些实验方法包括核酸提取、基因克隆、蛋白质表达与纯化等，是现代生命科学研究的基础它的特点是理论与实践紧密结合，不仅需要掌握基本原理，还需熟练操作技术分子生物学实验与基因工程、蛋白质组学等学科有着密切联系，是医学、农业、环境科学等领域技术创新的重要源泉实验室安全规范生物安全化学安全按生物安全等级（BSL1-4）采取相应防护正确存储和使用化学试剂，了解危险品标措施，正确使用生物安全柜，防止生物材识，配备个人防护装备，掌握应急处理方料泄漏与交叉污染法应急预案废弃物处理熟悉实验室紧急出口位置，掌握灭火器使分类收集废弃物，生物废弃物高压灭菌处用方法，了解化学品泄漏和生物材料污染理，化学废液单独收集，锐器废弃物使用的处理流程专用容器实验室常用仪器设备

（一）离心机仪电泳设备PCR用于分离不同密度的物质，按离心力大小分为聚合酶链式反应仪，通过精确控制温度实现基于带电分子在电场中迁移速率不同进行分离台式离心机（5,000×g）、高速离心机DNA的特异性扩增常见类型有普通PCR的设备包括水平电泳系统（常用于DNA分（30,000×g）和超速离心机仪、梯度PCR仪（可同时设置不同退火温离）和垂直电泳系统（常用于蛋白质分离）（30,000×g）使用前需平衡样品，防止度）和实时荧光定量PCR仪（可实时监测产需注意安全操作，防止电击振动损坏设备物扩增过程）实验室常用仪器设备

（二）凝胶成像系统生物安全柜与超净工作台恒温设备与显微镜用于记录和分析电泳后的凝胶图像，包括紫外透射生物安全柜通过空气过滤系统保护操作者、环境和样恒温培养箱和恒温摇床用于维持恒定温度培养微生物仪、CCD相机和图像分析软件可通过荧光染料（如品，根据防护级别分为I、II、III级超净工作台只提和细胞显微镜系统包括普通光学显微镜、荧光显微溴化乙锭、SYBR Green）显示核酸条带，并进行图供洁净气流保护样品，不能用于处理有害生物材料，镜、共聚焦显微镜等，用于观察细胞形态和亚细胞结像采集与分析适合无菌操作如细胞培养构实验室常用试剂与耗材酶类试剂缓冲液与溶液包括限制性内切酶（识别并切割常用缓冲液包括PBS、TBS、特定DNA序列）、DNA连接酶TAE/TBE电泳缓冲液等溶液（连接DNA片段）、聚合酶配制需准确称量，注意pH调节（合成DNA）、反转录酶（从和无菌处理某些溶液需避光保RNA合成cDNA）等需低温存，标签应注明配制日期与有效保存，避免反复冻融，防止活性期降低培养基与耗材培养基包括LB、YPD等，需严格灭菌常用耗材有移液器吸头、PCR管、离心管、培养皿等，应选择适合实验要求的规格和材质，避免交叉污染实验记录与数据管理实验记录本规范使用专用实验记录本，内容清晰可追溯数据记录与分析完整记录原始数据，使用适当统计方法分析图像与文件管理建立系统文件命名和分级存储系统科研诚信保障确保数据真实可靠，避免选择性报告实验记录本是实验历程的详细档案，应记录实验目的、方法、材料、步骤和结果每页应标注日期，错误应划线而非涂抹，保持内容可追溯性数据记录应包括所有原始结果，而非仅保留满意数据，这是科研诚信的基础实验图像应无修改地保存原始文件，任何处理都应在复制文件上进行并说明处理方法建立有序的数据管理系统，包括文件命名规则、目录结构和定期备份机制，确保数据的长期可访问性和完整性大肠杆菌感受态细胞制备

（一）感受态细胞原理化学法制备步骤感受态细胞是指能够接收外源DNA的细胞状态大肠杆菌在特定条件处理后，细胞壁和细化学法是最常用的感受态细胞制备方法，具体步骤包括培养菌液至对数生长期、低温冰胞膜的通透性增加，允许外源DNA进入细胞内这是基因克隆和重组蛋白表达的基础步浴处理、加入氯化钙溶液、离心收集细胞、重悬于氯化钙甘油溶液、分装冻存骤制备过程需保持低温（0-4℃），避免剧烈震荡，减少细胞损伤转化效率通常可达10^6-•低温环境增加细胞膜流动性10^8cfu/μg质粒DNA，足够大多数常规克隆实验需求•二价阳离子（如钙离子）帮助DNA吸附•热激促进DNA进入细胞大肠杆菌感受态细胞制备

（二）电转化感受态细胞制备影响转化效率的因素电转化感受态细胞的制备步骤培菌株类型不同菌株转化效率差异养菌液至对数生长期→冰浴冷却→多明显，DH5α和TOP10等菌株较适次冰冷水洗→10%甘油洗涤→分装冻合转化生长阶段对数生长期中存与化学法不同，电转化法需要期的细胞转化效率最高低温处彻底去除培养基中的盐分，降低样理整个过程保持低温可提高效品电导率率处理时间氯化钙处理时间需优化，过长过短均不利常见问题与解决方案转化效率低的原因可能是细胞培养过度、温度控制不当、质粒DNA不纯、操作过程中细胞受损等解决方法包括严格控制培养时间、全程低温操作、使用高纯度质粒、减少物理损伤、优化氯化钙浓度与处理时间质粒转化DNA感受态细胞解冻冰上缓慢解冻，避免温度升高加入DNA添加少量质粒DNA，轻轻混匀热激处理42℃热激30-45秒，冰浴2分钟恢复培养加入LB培养基，37℃振荡1小时平板筛选涂布于含抗生素的选择性平板质粒DNA转化是将外源DNA导入宿主细胞的过程，是分子克隆的关键步骤热激法是最常用的化学转化方法，其原理是通过短暂的热处理增加细胞膜通透性，促使质粒DNA进入细胞电转化法则通过短时电脉冲使细胞膜形成瞬时孔隙，适用于大片段质粒或效率要求高的情况转化效率计算公式为转化效率（cfu/μg）=菌落数/（转化质粒量×稀释倍数）良好的操作可获得10^6-10^9cfu/μg的转化效率质粒提取（小量提取）DNA纯化与洗脱沉淀杂质使用硅胶膜柱吸附上清液中的质粒DNA，洗菌体收集与裂解加入中和液（含醋酸钾），轻轻颠倒混匀，涤缓冲液洗去杂质加入洗脱缓冲液（低盐离心收集培养的菌体，加入含RNase A的重生成含蛋白质、脂质和基因组DNA的白色沉或水）洗脱纯化的质粒DNA检测浓度和纯悬缓冲液充分混匀加入碱性裂解液（含淀离心收集上清液，其中含有环状质粒度，-20℃保存SDS和NaOH），温和混匀，室温放置不超DNA过5分钟，避免过度裂解导致基因组DNA释放质粒提取（中量与大量提取）DNA毫升50-100中量提取培养体积适用于获取中等量的高纯度质粒毫升500-1000大量提取培养体积适用于获取毫克级高纯度质粒

99.9%方法纯度CsCl最高纯度的纯化方法，适合特殊应用毫克1-5大量提取产量单次大量提取可获得的质粒DNA量中量与大量质粒提取适用于需要较多质粒DNA的实验，如转染、体外转录等氯化铯（CsCl）密度梯度离心法是经典的高纯度提取方法，原理是利用不同DNA分子与溴化乙锭结合后在CsCl梯度中的浮力密度差异进行分离该方法纯度最高，但操作复杂，需要超速离心柱层析纯化法是现代常用的中量和大量提取方法，基于吸附-洗脱原理，使用专用的离子交换柱或硅胶膜柱纯化后的质粒应避光保存在TE缓冲液或纯水中，-20℃长期保存高纯度质粒DNA应满足OD260/280比值在

1.8-

2.0之间，适合用于酶切、测序、转染等对纯度要求较高的实验核酸的定量分析琼脂糖凝胶电泳

（一）凝胶浓度选择电泳原理根据目标DNA大小选择适当浓度大片段核酸分子带负电荷，在电场作用下向正极移（10kb）选

0.5%，中等片段（

0.5-10kb）动分子量越小，迁移速度越快，从而实现分选

1.0-

1.5%，小片段（500bp）选

2.0-离

3.0%样品处理缓冲液配制加入含甘油和染料的上样缓冲液，甘油增加密常用TAE或TBE缓冲液TAE适合大片段分度便于沉入凝胶孔中，染料指示电泳进度离，TBE适合小片段且分辨率更高琼脂糖凝胶电泳

（二）分子量标准品凝胶染色与观察结果分析与解释DNADNA分子量标准品（又称Marker或核酸染色常用溴化乙锭（EB）或SYBR通过比较样品条带与分子量标准品的迁移距离Ladder）包含已知大小的DNA片段，用于Green等荧光染料，它们能插入DNA双链结确定DNA大小条带亮度反映DNA含量，可确定样品DNA的分子量常见有100bp构并在紫外光下发出荧光EB具有致突变进行半定量分析弥散条带可能表明DNA降ladder和1kb ladder两种类型，选择应覆盖性，操作需戴手套现代实验室多使用凝胶成解；拖尾现象则可能是样品中含盐量过高或目标DNA大小范围上样时应确保标准品条像系统记录电泳结果，可通过软件进行半定量DNA过量上样导致多条带可能表明有非特带清晰可见，便于准确判断样品大小分析异性扩增或样品污染技术原理与应用PCR退火（）Annealing50-65℃使引物与模板DNA互补配对结合，温度取决于引物特性变性（）Denaturation194-98℃高温使DNA双链解链成单链，为引物结合提供模板延伸（）Extension72℃条件下DNA聚合酶从引物延伸合成新链，3每个循环使目标DNA翻倍聚合酶链式反应（PCR）是体外扩增特定DNA片段的技术，基于DNA聚合酶的体外复制原理一个完整的PCR反应包含模板DNA、两条特异性引物、耐热DNA聚合酶（如Taq酶）、dNTPs、反应缓冲液和二价镁离子等成分通过温度循环控制，可在数小时内将目标DNA扩增数十亿倍引物设计是PCR成功的关键，需考虑长度（通常18-30bp）、GC含量（40-60%）、Tm值（两引物相近，通常55-65℃）和特异性（避免自身互补和非特异结合）PCR技术广泛应用于基因克隆、遗传检测、分子诊断、基因表达分析等领域，是现代分子生物学不可或缺的技术实验操作要点PCR反应体系配制热循环条件优化按照试剂盒推荐浓度配制反应体系，通常包括10×缓冲液、模板初始变性通常94-98℃，5分钟；变性94-98℃，30秒；退火温度DNA、上下游引物、dNTPs、DNA聚合酶和无核酸酶水先加入根据引物Tm值设定，通常比Tm值低5℃，30秒；延伸72℃，每公共组分制备主混合液，最后加入模板，避免交叉污染kb序列约1分钟；最终延伸72℃，5-10分钟；循环数一般为25-35次防污染措施4常见问题对策建立PCR前、中、后独立工作区；使用过滤吸头和紫外灯消毒；设无扩增产物检查模板质量、引物设计、反应体系组分；非特异扩置阴性对照；避免扩增产物气溶胶污染所有试剂、器材使用前应增优化退火温度、降低引物浓度、使用热启动酶；扩增效率低确保无DNA酶和RNA酶污染调整镁离子浓度、添加增强剂如DMSO或甘油产物纯化方法PCR琼脂糖凝胶切胶回收柱层析纯化适用于混合产物的分离纯化，可特异性回收目的条带步骤包括电泳分离目标条带、在紫外灯下快速切割目标条带、溶解凝胶、吸附DNA至硅胶膜、适用于单一PCR产物的快速纯化，原理是基于核酸在高盐条件下选择性吸附至硅胶膜，而蛋白质、引物、核苷酸等杂质通过洗涤去除操作简便，回收洗涤、洗脱纯化产物率高（80-95%），是最常用的纯化方法注意事项切胶时减少紫外照射时间，防止DNA损伤；控制溶胶温度和时间，避免DNA变性；选择合适pH值的洗脱缓冲液（通常pH

7.5-

8.5）此方具体步骤加入高盐结合缓冲液至PCR产物、转移至硅胶膜柱、离心、洗涤去除杂质、洗脱纯化产物洗脱可使用水或低盐缓冲液，洗脱体积对浓度和法回收率通常为60-80%回收率有显著影响限制性内切酶消化DNA限制酶分类反应体系反应条件根据识别序列、切割位点标准反应包括DNA样大多数限制酶在37℃下活和辅因子需求分为I型、II品（通常

0.1-1μg）、10×性最佳，反应时间通常为型和III型分子克隆中主限制酶缓冲液、限制酶1-4小时Star activity要使用II型限制酶，它们（通常1-10U）、BSA（非特异性切割）可能发能在特定识别序列内部或（部分酶需要）和无核酸生在高酶浓度、长时间反附近切割双链DNA常酶水不同酶有特定的最应或不适当的缓冲条件见酶如EcoRI佳缓冲条件，双酶切时需下，应避免过度消化反（G↓AATTC）、选择兼容缓冲液或依次进应可通过热灭活（通常BamHI行65-80℃，15-20分钟）（G↓GATCC）、或酚-氯仿抽提终止HindIII（A↓AGCTT）等连接反应DNA连接酶原理T4DNAT4DNA连接酶催化DNA片段之间磷酸二酯键的形成，需要ATP作为辅助因子可催化黏性末端连接（互补单链末端）和平末端连接（无互补单链），黏性末端连接效率远高于平末端连接反应体系配制标准连接反应包含载体与插入片段DNA（通常摩尔比为1:3至1:5）、10×连接缓冲液（含ATP）、T4DNA连接酶（通常1-5U）和无核酸酶水总体积通常为10-20μL反应前进行载体与插入片段的定量，确保适当比例影响连接效率的因素DNA浓度总浓度通常保持在50-200ng/μL；载体与片段比例黏性末端1:3，平末端1:5；连接温度黏性末端16-22℃，平末端14-16℃；反应时间黏性末端1-4小时，平末端过夜；PEG等增强剂可提高平末端连接效率连接产物的处理连接反应后可直接用于转化或-20℃短期保存转化前可进行热灭活（65℃，10分钟）或稀释以减少缓冲液对转化的抑制连接产物转化时应设置空载体自连对照，评估背景水平基因克隆载体系统克隆载体表达载体穿梭载体克隆载体用于外源DNA片段的扩增和保存，表达载体用于外源基因在宿主中的高效表达，穿梭载体能在不同宿主中复制，如pYES2如pUC系列、pBluescript系列等主要特如pET系列（大肠杆菌）、pcDNA系列（哺（大肠杆菌和酵母）、pFastBac（大肠杆菌点包括复制起点（ori）确保在宿主中高效乳动物细胞）等关键元件包括强启动子控和杆状病毒）等这类载体包含两种宿主的复复制；多克隆位点（MCS）含多种限制酶切制基因表达；有效的核糖体结合位点增强翻译制起点和筛选标记，便于在初级宿主（通常是位；筛选标记（通常为抗生素抗性基因）便于效率；终止子防止读穿；以及可能的融合标签大肠杆菌）中构建和验证，然后转入目标宿主阳性克隆筛选；以及通常较小的分子量有利于（如His标签、GST标签）便于纯化和检测表达适用于真核基因的克隆与表达高效转化重组分子的筛选DNA抗生素抗性筛选基于载体携带的抗性标记基因进行初筛蓝白斑筛选利用lacZ基因的α互补原理鉴别重组克隆法快速验证PCR3直接从菌落扩增特定片段确认插入限制性酶切分析提取质粒后通过酶切图谱确认插入和方向抗生素抗性筛选是初步筛选转化菌的基本方法，但无法区分含有目的片段的重组质粒和自连接的空载体蓝白斑筛选是常用的重组体鉴定方法，基于lacZ基因中的多克隆位点插入外源DNA会破坏β-半乳糖苷酶活性，导致菌落在含X-gal和IPTG的培养基上呈白色（重组）而非蓝色（非重组）菌落PCR是快速验证的有效方法，直接以单菌落为模板进行PCR扩增，通过引物设计可同时确认插入片段的存在和方向限制性酶切分析是最终确认的金标准，通过提取质粒并进行特定酶切，分析DNA片段大小来确认插入和方向，并可估计片段大小必要时可通过DNA测序获取最终确认外源基因表达系统（原核）大肠杆菌表达系统优势经济高效、生长快速、遗传背景清晰常用表达载体系统pET、pGEX、pMAL系列启动子调控系统T

7、tac、ara等可诱导启动子表达菌株选择BL

21、Rosetta、Origami等特化菌株大肠杆菌表达系统是最常用的原核表达系统，具有表达水平高、培养成本低、操作简便等优点pET系统（由T7噬菌体启动子控制）是目前应用最广泛的表达系统，结合BL21DE3菌株可实现高效表达其他常用系统还包括GST融合表达的pGEX系统和MBP融合表达的pMAL系统影响表达的因素包括密码子使用偏好（可通过密码子优化或选用Rosetta等菌株解决）；蛋白质毒性（可通过降低温度、减少诱导剂浓度或使用严格调控的启动子控制）；蛋白质溶解性（可融合可溶性标签如MBP、降低表达温度或改变培养条件）；以及宿主菌特性（如是否缺失特定蛋白酶、是否提供稀有tRNA等）外源基因在大肠杆菌中的诱导表达培养条件优化在LB或TB培养基中培养至对数中期（OD600约

0.6-

0.8）进行诱导温度是关键因素标准条件为37℃，但降低至16-30℃可提高蛋白可溶性；富含营养的培养基（如TB）有助于提高产量；培养密度影响氧气供应，高密度可能需要额外通气诱导条件选择IPTG是最常用的诱导剂，典型浓度为

0.1-

1.0mM高浓度可能导致包涵体形成增加；低浓度和低温（16-25℃）组合可提高可溶性表达；诱导时间通常为3-6小时，过夜诱导适合低温条件；自诱导培养基含乳糖可实现自动诱导，无需监测菌体密度3表达产物检测SDS-PAGE是最基本的检测方法，可通过Coomassie蓝或银染可视化；Western blot利用抗体可特异性检测目标蛋白，适用于低表达水平；酶活性测定可确认蛋白功能；Native-PAGE可分析蛋白质寡聚状态；质谱分析可精确鉴定蛋白质组成4问题解决策略无表达检查序列、启动子和阅读框；低表达优化密码子、使用适合菌株；不溶性表达降低温度、减少诱导剂、融合可溶性标签如MBP；蛋白质降解添加蛋白酶抑制剂、使用缺陷蛋白酶的菌株、降低培养温度蛋白质的电泳分析SDS-PAGE原理样品处理与电泳条件SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳结合十二烷基硫酸钠SDS是分离蛋白质的强大工具SDS是强阴离子表面活性剂，能破坏蛋白质非共价键并均匀结合，样品与上样缓冲液（含SDS、巯基乙醇、甘油和溴酚蓝）混合后在95-100℃加热5-10分钟使蛋白质完全变性巯基乙醇可还原二硫键，使蛋白使蛋白质带负电荷蛋白质变性后分子量与迁移距离成反比关系，可用于确定分子量质完全舒展加热后应立即冰浴冷却，短暂离心去除沉淀再上样凝胶由分离胶（通常

7.5-15%）和浓缩胶（通常4%）组成分离胶浓度选择取决于目标蛋白大小大蛋白（100kDa）选

7.5-10%，中等蛋白电泳条件通常为恒压80-120V（浓缩胶）和120-200V（分离胶）电流过大会导致凝胶过热，可能引起条带弥散电泳完成后，可使用考马斯（30-100kDa）选10-12%，小蛋白（30kDa）选15%或更高亮蓝、银染或荧光染料染色染色后，用脱色液去除背景，显示蛋白质条带技术Western Blot电泳分离SDS-PAGE首先通过SDS-PAGE分离蛋白质混合物，使不同分子量的蛋白质在凝胶中形成分离的条带转膜将凝胶中的蛋白质转移到固相膜（PVDF或硝酸纤维素膜）上，通常采用半干转或湿转方法封闭用牛奶或BSA溶液封闭膜上的非特异性结合位点，减少背景信号抗体孵育先与特异性一抗孵育，再与标记的二抗（通常偶联HRP或碱性磷酸酶）孵育信号检测加入底物产生化学发光或显色反应，通过X光片暴光或成像仪检测信号免疫印迹技术的应用哺乳动物基因组提取DNA沉淀与溶解DNA去蛋白与纯化DNA加入1/10体积3M醋酸钠（pH

5.2）和细胞裂解与蛋白质消化采用经典的酚-氯仿抽提法等体积酚:2-

2.5倍体积冰冷无水乙醇，混匀，-样品预处理使用裂解缓冲液（含SDS、EDTA氯仿:异戊醇（25:24:1）混合液抽提，20℃或-80℃沉淀DNA离心收集根据样品类型选择适当方法组织样等）溶解细胞膜和核膜，释放DNA水相中的DNA与有机相中的蛋白质和DNA沉淀，70%乙醇洗涤去除盐分，品需机械研磨或匀浆，形成细胞悬加入蛋白酶K（通常50-200μg/mL）脂质分离通常需重复抽提2-3次，确风干后溶解于TE缓冲液或无核酸酶水液；血液样品需溶解红细胞，收集白在50-56℃孵育数小时至过夜，彻底消保DNA纯度也可使用高盐法或硅胶中温和混匀，避免剧烈震荡导致细胞；培养细胞可直接裂解所有样化蛋白质蛋白酶K处理可分解组蛋白膜柱法去除蛋白质DNA剪切品在处理前应保持低温，减少内源性和其他与DNA结合的蛋白质，减少核酸酶的活性DNA损失哺乳动物基因组的质量分析DNA基因组DNA的质量评估包括浓度、纯度和完整性三个方面浓度测定常用紫外分光光度计在260nm波长处测量吸光度，根据公式DNA浓度μg/mL=OD260×稀释倍数×50纯度评价主要通过OD260/OD280和OD260/OD230比值，前者理想范围为

1.8-

2.0，低于

1.8表明蛋白质污染；后者应大于

2.0，低值表明有酚、碳水化合物或其他有机化合物污染完整性评价标准方法是琼脂糖凝胶电泳，高分子量基因组DNA应在凝胶起点附近形成清晰明亮的单一条带，没有弥散现象或低分子量拖尾现代方法如Bioanalyzer可提供DNA完整性数值（DIN值）高质量基因组DNA应溶解在TE缓冲液（pH

8.0）中，-20℃长期保存，避免反复冻融，必要时可分装保存的提取原理与注意事项RNA防护措施样品保存与预处理提取方法选择RNaseRNA易被广泛存在的动物组织样品应立即置于总RNA提取通常采用酸RNase降解，必须采取液氮中速冻或RNA保存性硫氰酸胍-酚-氯仿法严格防护戴无粉手套；液中保存；细胞样品应快（TRIzol法）或硅胶膜柱使用DEPC处理的水和溶速裂解；植物样品需考虑法；mRNA提取则利用液；专用器材和试剂避免多酚、多糖等干扰物质其3polyA尾与寡聚交叉污染；加入RNA酶预处理时应迅速操作，减dT的特异性结合进行纯抑制剂；保持样品低温处少内源性RNA酶活性，化不同样品类型和应用理所有接触样品的表面保持样品完整性目的应选择适当的提取方应预先用RNase清除剂法，如高通量测序对处理RNA完整性要求极高植物总提取RNA植物组织特性与挑战法提取植物TRIzol RNA植物组织RNA提取面临独特挑战细胞壁坚硬需要有效破碎；含有大量多酚、多糖和次生代谢产物会与核酸共沉淀；内源性RNA酶活性可能很TRIzol法是植物RNA提取的常用方法，原理是利用酸性硫氰酸胍-酚-氯仿一步法分离RNA对于富含多酚、多糖的植物样品，需进行以下改高不同植物组织（叶、茎、根、种子、果实）成分差异大，可能需要针对性方法进•样品采集应选择健康、新鲜组织•提取缓冲液中加入PVPP吸附多酚•立即液氮速冻或RNA保存液保存•增加β-巯基乙醇浓度抑制多酚氧化•研磨需在液氮中进行，保持低温•使用高盐浓度（如2-3M NaCl）促进多糖与RNA分离•延长氯仿抽提次数去除残留酚和杂质商业试剂盒如RNeasy PlantMini Kit采用改良的硅胶膜吸附技术，可有效去除植物特有的干扰物质，适合多种植物组织RNA提取，操作简便且重复性好的定性定量分析RNA浓度测定纯度评价RNA RNA紫外分光光度法测定OD260，RNA浓度OD260/OD280比值应为

1.9-

2.1，低于

1.8表μg/mL=OD260×稀释倍数×40；微量分光明蛋白质污染；OD260/OD230比值应大于光度计（如NanoDrop）可测定1-2μL样品；

2.0，低值表明有酚、碳水化合物或盐类污荧光染料法（如RiboGreen）灵敏度高，适1染；不均一悬浮物会导致光散射，使OD260合低浓度样品异常高估保存条件完整性检测RNA RNA纯化RNA溶解于DEPC处理水或无RNA酶水变性琼脂糖凝胶电泳可显示28S和18S rRNA3中，-80℃长期保存；添加RNA酶抑制剂可增条带，28S:18S比值约为2:1表明完整性良好；加稳定性；避免反复冻融导致降解；对于特别毛细管电泳系统（如Bioanalyzer）提供重要的样品，可加入沉淀剂（如乙醇和醋酸RNA完整性数值（RIN值，1-10），RIN7通钠）-80℃沉淀保存常适合大多数应用技术RT-PCR反转录原理与酶种类反转录PCR（RT-PCR）是从RNA模板合成cDNA并进行扩增的技术反转录酶（逆转录酶）能以RNA为模板合成互补DNA链常用酶包括病毒来源的M-MLV（对mRNA效果好）和AMV（耐热性较好）；基因工程改造的酶如SuperScript系列（高热稳定性、高效率、低RNaseH活性）引物选择与合成cDNA反转录引物有三种

①随机六聚体引物，可从RNA多处启动合成，覆盖范围广；

②寡聚dT引物，特异性结合mRNA的polyA尾，只反转录mRNA；

③基因特异性引物，只反转录目标RNA反应温度通常为37-50℃，时间为30-60分钟，之后95℃加热5分钟灭活酶活性扩增与检测PCR使用基因特异性引物扩增cDNA中的目标片段可采用一步法（在同一反应体系中完成RT和PCR）或两步法（分别进行RT和PCR）一步法减少污染风险，适合高通量检测；两步法灵活性高，允许从同一批cDNA扩增多个基因，并可优化各自条件数据分析与注意事项半定量RT-PCR通过控制PCR循环数在线性扩增阶段比较相对表达量，需设置内参基因（如β-actin、GAPDH）标准化关键注意事项防止RNA酶污染；设置无逆转录酶对照检测基因组DNA污染；阴性对照确认无污染；剂量依赖性实验验证条件合适性实时荧光定量PCR原理与检测系统qPCR实时荧光定量PCR（qPCR）通过荧光信号实时监测PCR产物的积累过程，实现核酸的精确定量检测方式主要有

①SYBR Green等非特异性双链DNA结合染料，成本低但可能检测非特异扩增产物；

②TaqMan等特异性探针，利用5→3外切酶活性和FRET原理，特异性高但成本较高数据分析与质量控制定量分析主要有相对定量和绝对定量两种相对定量使用ΔΔCt方法计算目标基因相对于内参基因的表达变化绝对定量需建立标准曲线，通过已知浓度系列梯度稀释标准品计算未知样品的拷贝数质量控制包括扩增效率检测（90-110%最佳）、熔解曲线分析（验证产物特异性）和多重内参基因标准化引物设计与实验优化成功的qPCR依赖于优良的引物设计长度通常18-25bp；GC含量40-60%；Tm值55-65℃，两引物差异5℃；扩增产物长度80-150bp；跨越外显子-内含子连接区防止基因组DNA干扰；使用引物设计软件如Primer

3、Beacon Designer进行辅助设计和特异性检查优化包括引物浓度、模板量、退火温度等参数调整差异显示技术mRNA差异显示的原理实验设计与分析验证mRNA差异显示技术（DD-PCR）是一种识别不同条件下差异表达基因的方法原理是通过随机或针对性引物进行反转录和PCR扩增，将不同样本的扩差异显示实验设计关键点包括样本至少需要生物学重复（独立平行样本）；同一条件下的技术重复可减少误差；合理分组和对照设置；严格控制RNA增产物在高分辨率聚丙烯酰胺凝胶上并排电泳分析，找出存在差异的条带质量和反转录效率一致性；PCR循环数控制在25-30次避免饱和扩增基本流程包括从不同条件下的细胞或组织提取总RNA；使用锚定寡聚dT引物（如T12MN，M=A、G或C；N=A、G、C或T）进行反转录；随机十聚鉴定的差异条带需要进一步验证以排除假阳性北方印迹验证表达差异；RT-PCR或实时荧光定量PCR验证；原位杂交确认表达部位；功能验证如过表体引物和锚定引物组合进行PCR扩增；变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物；银染或放射性标记显示；切取差异条带回收并再扩增；克隆测序鉴定差达或RNA干扰差异显示技术虽然灵敏度和特异性不如现代的转录组测序技术，但其优势在于不需要预先了解基因序列信息，适合非模式生物的研究异基因印迹杂交Southern样品制备与酶切提取高质量基因组DNA，使用合适的限制性内切酶完全酶切酶切条件应严格优化以确保完全酶切，通常过夜反应酶切后变性处理使DNA转变为单链，便于与探针杂交样品需要适量（通常5-10μg基因组DNA）以确保目标序列的检测灵敏度凝胶电泳与转膜琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，电泳后在紫外灯下拍照记录（加标尺），然后用碱性溶液（NaOH）处理使DNA变性成单链毛细管转移法将DNA从凝胶转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，通常使用20×SSC作为转移缓冲液，转移6-24小时转移后，UV交联或80℃烘烤固定DNA到膜上探针制备与杂交探针可通过PCR扩增、限制性酶切或合成寡核苷酸获得，长度一般200-1000bp标记方法包括放射性标记（32P）或非放射性标记（地高辛、生物素）杂交前需预杂交（2-6小时）以封闭非特异性结合位点杂交通常在42-68℃进行，持续12-24小时杂交缓冲液含有甲酰胺、SDS等，可降低杂交温度并增加特异性洗膜与信号检测杂交后进行高低严谨度洗膜去除非特异性结合的探针洗膜条件（温度和盐浓度）决定杂交特异性，通常从低严谨度（低温、高盐）逐渐过渡到高严谨度（高温、低盐）信号检测方式取决于探针标记类型放射性标记可通过放射自显影或磷屏成像检测；非放射性标记则使用相应的显色或化学发光系统显示信号测序技术DNA测序法（第一代）Sanger基于链终止法的经典测序技术1高通量测序（第二代）大规模并行测序，提高通量和降低成本单分子测序（第三代）3长读长测序，无需PCR扩增测序数据分析生物信息学处理和序列拼接Sanger测序法是最早发展的DNA测序技术，基于链终止法原理它利用2,3-双脱氧核苷酸（ddNTPs）在DNA合成过程中终止延伸，产生不同长度的DNA片段现代自动化Sanger测序仪使用不同荧光标记的ddNTPs，通过毛细管电泳分离DNA片段并实时检测荧光信号Sanger测序读长可达700-1000bp，准确率高达

99.99%，但通量低，成本较高高通量测序技术（又称下一代测序，NGS）通过大规模并行测序显著提高通量并降低成本代表技术包括Illumina测序（基于可逆终止合成测序）、Ion Torrent测序（基于半导体检测pH变化）等第三代测序技术如PacBio和Oxford Nanopore实现了单分子实时测序，提供更长读长（数千至数十万碱基），但准确率略低测序数据分析涉及质量控制、序列拼接、变异检测等生物信息学处理基因敲除技术同源重组基因敲除系统CRISPR-Cas9同源重组是最早发展的基因敲除技术，利用细胞内源性DNA修复机制构建含有靶基因同源臂和选择标记的敲除载体，转入细胞后通过同源重CRISPR-Cas9是革命性的基因编辑工具，基于细菌获得性免疫系统系统包含两个关键组分Cas9核酸酶和单导向RNA（sgRNA）组替换或破坏目标基因这种方法特异性高但效率低，主要用于小鼠、酵母等模型生物的基因敲除sgRNA引导Cas9特异性识别并切割靶DNA序列，产生双链断裂，通过非同源末端连接（NHEJ）修复时常引入插入/缺失突变，导致基因敲除•需设计含5和3同源臂的载体•含正/负选择标记基因进行筛选•设计靶向PAM序列附近的sgRNA•同源重组效率通常较低（10^-6至10^-4）•Cas9切割产生精确的双链断裂•通过NHEJ或HDR修复断裂•筛选鉴定成功编辑的克隆CRISPR-Cas9的优势在于简单高效，只需设计特定sgRNA即可靶向几乎任何基因位点系统可通过质粒、病毒或核糖核蛋白复合物形式递送，在各种细胞和生物体中实现基因编辑修饰版Cas9如dCas9（失活）可用于基因表达调控而非基因敲除基因敲入技术敲入策略设计载体构建确定敲入位点和外源序列，设计含同源臂的靶向载克隆目标序列和两侧同源臂，添加选择标记和报告体或供体模板基因筛选与验证递送与整合药物筛选、PCR验证、测序确认、蛋白表达与功能通过转染或病毒感染将构建物导入细胞，利用HDR分析实现定点整合基因敲入是将外源DNA序列定点整合到基因组特定位置的技术，目的包括标签融合、报告基因表达、基因替换等传统敲入依赖同源重组，构建含有长同源臂（通常1-5kb）的靶向载体，在ES细胞或体细胞中进行筛选现代方法结合CRISPR-Cas9系统，大幅提高了敲入效率，简化了操作流程基因敲入常用于

①点突变引入，研究特定氨基酸的功能；

②融合标签表达，如GFP、FLAG标签用于蛋白定位和相互作用研究；

③报告基因敲入，监测内源启动子活性；

④条件性基因敲入，如Cre-loxP系统实现组织特异性或诱导性基因表达成功敲入的验证包括PCR鉴定整合位点、测序确认序列准确性、以及表达和功能分析细胞转染技术化学转染利用阳离子脂质或聚合物包裹DNA物理转染电穿孔或微注射直接导入核酸病毒转导利用病毒载体高效递送基因细胞接收外源基因进入细胞核并表达化学转染是最常用的方法，包括磷酸钙共沉淀法、阳离子脂质体（如Lipofectamine）和聚合物（如PEI）介导的转染其原理是形成正电荷复合物与带负电荷的细胞膜结合，通过胞吞作用进入细胞化学转染优点是操作简便，成本相对较低，适用于多种细胞类型，但对原代细胞和难转染细胞效率有限电转染通过短暂高压电脉冲在细胞膜形成瞬时孔隙，使核酸分子直接进入细胞质它适用于多种细胞类型，尤其是原代细胞和干细胞，但可能导致较高细胞死亡率病毒转导系统包括慢病毒、腺病毒和腺相关病毒等，能实现高效转导和稳定整合，特别适合难转染细胞和体内基因递送，但构建复杂且存在生物安全风险转染效率评价通常使用荧光蛋白表达、报告基因检测或抗生素筛选等方法荧光原位杂交技术荧光原位杂交（FISH）是一种将荧光标记的核酸探针与细胞或组织中的靶核酸序列杂交，通过荧光显微镜观察的技术FISH探针分类包括基因特异性探针（针对特定基因或DNA序列）、中心体探针（针对染色体中心区域）、全染色体涂染探针（标记整条染色体）和端粒探针探针标记方法有直接法（直接偶联荧光团）和间接法（偶联生物素或地高辛，通过荧光标记的蛋白或抗体检测）FISH技术的应用广泛在细胞遗传学中检测染色体数目和结构异常；在肿瘤学中检测特定癌症相关基因的扩增、缺失或融合；在微生物学中鉴定难以培养的微生物；在RNA-FISH中研究基因表达和RNA亚细胞定位高灵敏度变体如纤维FISH可实现100kb分辨率的基因组分析，而单分子RNA-FISH可检测单个RNA分子成像技术进步如共聚焦显微镜和超分辨率显微镜进一步提高了FISH的分辨率和信息量分子生物学实验的设计原则明确科学问题良好的实验从明确的科学问题开始研究问题应具体、可测量、可实现，并且基于已有知识提出合理假设避免过于宽泛或模糊的问题，将复杂问题分解为可通过单个实验回答的子问题确保所设计的实验能够直接验证或反驳提出的假设严格的对照设置对照是实验设计中最关键的元素之一阳性对照验证实验系统正常工作；阴性对照确定背景信号水平；空白对照检测潜在污染；操作对照评估实验步骤影响；平行对照确保结果可靠性；载体对照评估载体本身效应；野生型对照作为突变体比较基准每个变量应有相应对照充分的重复和样本量实验重复分为技术重复（同一样本多次测量）和生物学重复（独立样本多次测量）技术重复评估方法精确度，生物学重复评估结果通用性样本量取决于预期效应大小、变异程度和所需统计功效，通常至少需3-5个生物学重复对于变异性大的实验，可能需要更多重复适当的统计分析实验设计阶段应预先确定统计分析方法根据数据特性选择参数检验或非参数检验；多组比较时考虑ANOVA及事后检验；考虑多重比较校正如Bonferroni或FDR；确定显著性水平（通常p

0.05）；报告效应大小而非仅显著性；必要时咨询统计学专家确保分析方法的正确性和适用性生物信息学分析工具序列比对与分析工具BLAST（Basic LocalAlignment SearchTool）是最常用的序列相似性搜索工具，可在数据库中快速查找与查询序列相似的序列变体包括nucleotide BLAST（用于核酸序列）和protein BLAST（用于蛋白质序列）多序列比对工具如CLUSTAL、MUSCLE和MAFFT可分析多个序列间的进化关系序列操作工具如SnapGene、ApE和SerialCloner便于质粒图谱绘制和限制性酶切分析引物设计与核酸分析专业引物设计软件如Primer

3、Beacon Designer和IDT OligoAnalyzer可优化PCR引物参数，检查自二聚体、发卡结构和非特异扩增风险NCBI Primer-BLAST可验证引物特异性对于RT-qPCR实验，软件可设计跨越外显子-内含子连接区的引物，避免基因组DNA扩增基因组浏览器如UCSC GenomeBrowser和Ensembl提供基因结构和变异信息，辅助实验设计蛋白质结构与功能分析蛋白质结构预测工具如AlphaFold和I-TASSER可从氨基酸序列预测三维结构PyMOL和Chimera等可视化软件可展示和分析蛋白质结构功能域预测工具如PFAM和InterProScan可识别保守功能域翻译后修饰预测工具可预测潜在的磷酸化、糖基化位点蛋白质相互作用数据库如STRING和BioGRID提供已知互作关系，辅助功能研究分子生物学实验的应用前景实验报告的撰写报告结构框架标题、摘要、引言、材料方法、结果、讨论、参考文献数据整理与图表清晰的图表展示和统计分析，突出关键结果结果分析与讨论解释数据含义，与已有研究比较，指出局限性科学写作规范准确、简洁、逻辑清晰，避免主观臆断实验报告是科学研究成果的书面记录，规范的实验报告应包含完整的实验信息摘要应简明扼要地概述整个实验的目的、主要方法、关键结果和结论，通常控制在250-300字以内引言部分阐述实验背景、理论基础和研究目的，建立与已有知识的联系材料与方法应详细描述实验过程，使读者能够重复实验，包括试剂、仪器、参数设置等结果部分是报告的核心，应客观呈现实验数据，通过表格、图形直观展示，避免重复描述图表内容数据必须包含统计分析结果，标明显著性水平讨论部分解释结果意义，分析与已有研究的一致性或差异，讨论可能的机制和局限性，提出改进建议和未来研究方向参考文献应使用统一格式（如APA、MLA等），确保来源可靠且相关实验设计与实施综合实验设计实验方案制定条件优化从简单到复杂，从已知到未详细列出实验步骤、所需材影响实验结果的关键参数包括知良好的实验设计应包括明料、时间安排和预期结果考温度、时间、pH值、浓度确的研究问题、合理的技术路虑技术可行性和资源可获得等，应通过系统优化确定最佳线、严格的对照设置和科学的性，设计备选方案应对潜在问条件采用单因素或正交实验统计分析方法避免过度复杂题方案应足够详细，使团队设计方法，有效筛选最优参数或资源浪费的设计，保持研究成员能够理解并执行重要实组合关键步骤应进行重复验焦点集中在核心科学问题上验前进行小规模预实验验证方证，确保结果可靠性和稳定法可行性性进度管理建立甘特图或时间表明确各阶段任务和截止日期考虑关键路径和依赖关系，合理安排平行实验预留缓冲时间应对意外情况，定期回顾进度并调整计划多人协作项目需明确分工和沟通机制，确保信息共享和协调一致课程总结与展望4核心技术模块基因操作、蛋白质分析、细胞工程与组学技术30+实验技术掌握从DNA提取到基因编辑的全面技能训练100%就业领域覆盖医药、农业、环保等多领域应用能力∞探索潜能持续学习与创新的科研精神培养本课程系统介绍了分子生物学实验的基本理论和核心技术，从经典方法到前沿技术，建立了完整的知识体系通过这些实验技能的学习，同学们不仅掌握了操作技巧，更培养了科学思维和实验设计能力科研素养的培育包括实验记录的规范性、数据分析的客观性、结果解释的严谨性以及科研伦理的遵守，这些都是成为合格科研人员的基本要求分子生物学正快速发展，新技术不断涌现单细胞测序技术正在揭示细胞异质性；空间转录组学为组织中基因表达提供空间信息；基因编辑技术日益精确，应用领域不断扩大；多组学整合分析带来系统性理解希望同学们在课程结束后能够保持对新知识的渴求，积极关注前沿进展，在未来的学习和工作中灵活运用所学知识，为生命科学研究和应用作出贡献。