《微生物的培养技术》课件

微生物的培养技术微生物培养技术是现代生物科学研究和应用的基础工具，它使我们能够在可控条件下研究和利用这些肉眼不可见的微小生命本课程将系统介绍微生物培养的基本原理、方法和应用，从培养基的配制到无菌操作技术，从常规培养到特殊培养条件的控制，全方位帮助学习者掌握这一重要的生物学技能通过本课程的学习，您将具备独立开展微生物培养实验的能力，为后续在微生物学、生物技术、医学诊断等领域的深入学习和研究奠定坚实基础绪论微生物培养的应用领域科研与产业价值微生物培养技术作为生命科学的基础研究手段，广泛应用于医药微生物培养技术连接基础研究与工业应用，是科学发现转化为实健康、食品工业、环境保护、农业生产等多个领域在医药领域，际生产力的关键环节在科研方面，它帮助我们揭示微生物生长它为抗生素筛选、疫苗研发提供支持；在食品工业中，发酵食品繁殖规律；在产业应用中，规模化培养是生物制品商业化的必经生产离不开微生物培养；在环境领域，特殊微生物可用于污染物之路，创造了数千亿元的经济价值降解微生物简介细菌真菌原核单细胞生物，大小通常为真核生物，包括酵母菌（单细微米，具有细胞壁但胞）和霉菌（多细胞），具有

0.5-5无细胞核，代表如大肠杆菌、细胞壁和真核结构，如酿酒酵枯草芽孢杆菌等，广泛分布于母、青霉菌等，在发酵工业、自然界各处，在物质循环、疾抗生素生产中具有重要应用价病发生、工业生产中发挥重要值作用病毒非细胞结构，仅含有核酸（或）和蛋白质外壳，大小为DNA RNA纳米，必须在活细胞内复制，如流感病毒、噬菌体等，是重20-300要的致病因子，也是基因工程的研究工具微生物的生长与繁殖二分裂繁殖最常见的细菌繁殖方式出芽生殖酵母菌的典型繁殖方式孢子繁殖霉菌等常见的无性繁殖生物量增长微生物数量与体积增加微生物生长是指微生物在适宜条件下数量增加和细胞物质合成的过程，体现为群体数量的增长和单个细胞体积的增大不同类型微生物采用不同的繁殖策略，如细菌主要通过二分裂，一个母细胞分裂为两个完全相同的子细胞；酵母菌则通过出芽生殖，在母细胞表面形成芽体后脱离微生物生长速度远快于高等生物，大肠杆菌在最适条件下约分钟分裂一次，小时内理论上可产生超过个细胞，这种高效繁殖能力是微生物在工业202410^20生产中的重要优势培养技术的发展历程1早期探索1660s列文虎克通过自制显微镜首次观察到微生物，但未能培养当时科学家们普遍认为微生物来源于自然发生，无需培养即可产生2巴斯德与科赫时代1860s-1880s巴斯德通过鹅颈瓶实验否定了自然发生说；科赫发明了固体培养基和平板培养技术，奠定了现代微生物培养的基础3现代培养技术1900s-1950s培养基成分逐渐标准化；发明厌氧培养和特种培养基；青霉素的发现推动了抗生素研究和选择性培养技术4当代发展至今1950s发酵技术产业化；分子生物学革命带来基因工程菌株培养；高通量筛选和自动化培养系统的出现大大提高了培养效率常见菌种举例大肠杆菌E.coli革兰氏阴性杆菌，是分子生物学研究的模式生物广泛应用于基因工程、蛋白质表达和重组疫苗生产作为肠道正常菌群，少数致病株可引起腹泻、尿路感染等疾病酿酒酵母S.cerevisiae单细胞真核生物，是研究真核细胞的重要模型在啤酒、葡萄酒酿造及面包制作中不可或缺具有较高的遗传稳定性，是首个基因组被完全测序的真核生物枯草芽孢杆菌B.subtilis革兰氏阳性杆菌，能形成耐高温的芽孢广泛应用于酶制剂生产、农业生物制剂和微生物发酵工程在不利环境下通过形成芽孢实现长期存活培养目的与意义科学研究医学应用培养是研究微生物生理、生化特性的基础，临床检验中分离病原菌进行鉴定和药敏试验；为微生物学理论提供实验支持通过培养可疫苗和抗生素的研发生产；益生菌培养用于以研究微生物代谢途径、基因表达调控和进肠道健康调节化关系环境应用工业生产环境微生物用于污水处理、土壤修复和生物发酵工业中微生物大规模培养生产酶制剂、降解；特殊功能菌的筛选培养用于生物防治氨基酸、维生素等；生物制药中重组蛋白和和生态修复抗体的生产培养中的基本概念菌落Colony由单个微生物细胞在固体培养基表面通过不断繁殖形成的肉眼可见的微生物聚集体菌落的形态、大小、颜色、透明度等特征是微生物鉴定的重要依据不同种类的微生物产生的菌落具有不同的特征纯培养Pure Culture只含有单一菌种的培养物，是微生物研究的基础通过分离培养技术如平板划线分离法获得纯培养是确保微生物研究结果可靠性和实验重复性的前提条件混合培养Mixed Culture含有两种或多种微生物的培养物，在发酵食品制作和环境微生物研究中较常见酸奶、泡菜等发酵食品生产中通常采用混合培养以获得特殊风味和品质污染Contamination培养物中出现非目标微生物的现象，可能来自空气、器材、操作者等污染会干扰实验结果，在严重情况下可能导致实验完全失败，还可能造成生物安全隐患纯培养与分离原始样品获取从自然环境或特定来源收集含有微生物的样品稀释与涂布将样品稀释并均匀涂于平板培养基表面单菌落分离从独立生长的单个菌落中挑取微生物纯培养建立将单菌落转移至新培养基中培养获得纯菌株纯培养是微生物学研究中最基本也是最关键的技术，它确保所有实验结果来自单一已知菌种在自然界中，微生物通常以混合群落形式存在，如土壤中可能含有数千种不同微生物，只有通过适当的分离技术才能获得纯菌株混合培养在某些特定领域如发酵食品中具有特殊价值，如酸奶中乳酸菌与双歧杆菌的共培养，不同菌种间的相互作用可产生独特风味和功能近年来，合成微生物群落的研究显示，精心设计的微生物组合可以实现单一菌种无法完成的功能培养基基础定义与作用为微生物生长提供必要营养和环境基本成分碳源、氮源、无机盐、生长因子、水物理形态液体培养基、半固体培养基、固体培养基功能分类基础培养基、选择培养基、鉴别培养基、富集培养基培养基是为微生物生长特意配制的营养基质，其组成根据目标微生物的营养需求而设计碳源为微生物提供能量和细胞物质合成的原料，常用葡萄糖、蔗糖等；氮源用于蛋白质和核酸合成，可使用蛋白胨、酵母提取物等；无机盐提供必要的矿物质元素；某些微生物还需要特定生长因子如维生素、氨基酸等按功能分类，基础培养基适合大多数非专性微生物生长；选择培养基含有抑制非目标微生物的成分；鉴别培养基能通过颜色变化等指示微生物的特定生化反应；富集培养基特别有利于特定微生物的生长，常用于环境样品中稀有微生物的分离了解培养基的组成原理对于成功培养各种微生物至关重要常用培养基类型1琼脂平板培养基将液体培养基与的琼脂混合后倒入培养皿中凝固形成的平面培养基优点是便于观察单个菌落特征、分离纯培养；可直接接种划线或涂布，菌落生长分散均匀，适合

1.5-2%菌落计数和形态观察用于微生物分离纯化、菌落特性研究和活菌计数琼脂斜面培养基将含琼脂的培养基倾斜凝固在试管中形成斜面的培养基特点是表面积大，适合需氧微生物生长；便于保存和运输；节省培养基用量主要用于微生物保藏、传代培养和观察特殊生理特性（如色素产生）实验室中常见的是倾斜角度约度的试管斜面15-30琼脂深层培养基将含琼脂的培养基直立凝固在试管中的培养基特点是可形成氧气梯度，顶部氧气浓度高，底部接近厌氧环境适用于研究微生物对氧气的需求特性；分析微生物的产气情况；适合某些特殊微生物如兼性厌氧菌的培养和鉴别试验常用培养基类型2试管液体培养三角瓶培养摇瓶培养发酵罐培养小体积培养，用于保存菌种、中等规模培养，用于实验室菌在振荡培养箱中进行，提高通大规模可控培养，具备温度、生化反应测试和初步扩增培种扩大培养和生物量积累培气效率和混合效果常用于需、溶氧等参数监控与调节功pH养体积通常为，可观养体积通常为，提氧微生物大量培养，生长速度能用于工业生产和放大实验，5-10ml50-500ml察浊度、沉淀、菌膜等生长特供较大的气液界面有利于氧气比静置培养快倍，生物量培养体积可从至数千立方米2-51L征传递产量更高培养基的配制步骤称量原料按照配方精确称量各组分，如蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、葡萄糖等对于商品化培养基粉末，直接按推荐浓度称量准确的称量是确保培养基质量的第一步溶解混合将称量好的原料加入适量蒸馏水中溶解，使用加热搅拌器加速溶解过程某些成分如琼脂需要充分加热才能完全溶解，通常调节pH加热至沸腾状态使用计测量培养基的酸碱度，用或溶液调节至目pH NaOHHCl标值注意测定应在室温下进行，而且高压灭菌后可pH pH pH灭菌处理能会略有变化将培养基装入适当容器（如三角瓶），加盖铝箔或棉塞，放入高压蒸汽灭菌锅℃灭菌分钟热敏性成分如抗生12115-20分装与贮存5素需要过滤灭菌后单独添加灭菌后的培养基在无菌环境下分装到预先灭菌的容器中，如平板、试管等分装温度通常控制在℃，以防琼脂过早45-50凝固但又不至于烫伤微生物培养基灭菌技术高压蒸汽灭菌最常用的培养基灭菌方法，在℃、条件下处理分钟原理是湿热可使微生物蛋白质变性凝固适用于大多数培养基，但不适合含热敏

121103.4kPa15-20成分（如某些糖类、抗生素）的培养基干热灭菌在℃干热条件下处理小时主要用于玻璃器皿和金属工具的灭菌，不适用于液体培养基灭菌原理是高温导致微生物氧化碳化，对于芽孢也160-1802-4有良好的杀灭效果过滤灭菌使用孔径为的微孔滤膜过滤除去微生物适用于热敏性培养基组分如血清、抗生素、某些维生素和生长因子等过滤灭菌不会改变物质的化学性质，

0.22μm是热敏性物质灭菌的首选方法培养基成分的选择成分类型常用物质主要功能特殊注意事项碳源葡萄糖、蔗糖、提供能量和细胞高浓度糖可能抑麦芽糖、甘油构建材料制某些微生物生长氮源蛋白胨、酵母提提供氨基酸和核有机氮源通常更取物、硫酸铵苷酸合成原料利于快速生长无机盐磷酸盐、硫酸盐、提供必需矿物质高盐环境有选择氯化钠元素性作用生长因子维生素、氨基酸、辅助特殊微生物部分需热敏灭菌血清生长处理固化剂琼脂、明胶使培养基凝固浓度影响硬度和微生物移动性调节剂、、调整培养基酸碱灭菌过程可能引pH NaOHHCl缓冲液度起变化pH培养条件温度培养条件pH酸性环境中性环境低于，适合酵母菌和某些霉菌生长，如1，大多数细菌的最适生长条件，如pH

5.5pH

6.5-

7.5用于面包、酸奶发酵的微生物大肠杆菌等实验室常用菌种缓冲系统碱性环境pH磷酸盐、等缓冲液用于维持培养过程中高于，适合某些特殊细菌如霍乱弧菌，HEPES pH

8.53的稳定性常用于选择性分离培养pH值是培养条件中另一个重要参数，指示培养环境的酸碱度大多数微生物在接近中性的环境中生长最好，但也有许多微生物适应了特殊的环境根据最pH pH适范围，微生物可分为嗜酸菌、中性菌和嗜碱菌pH培养过程中，微生物的代谢活动可能导致培养基发生变化例如，许多细菌发酵糖类时产生有机酸，使培养基变酸；而某些微生物分解蛋白质时产生氨，使pH培养基变碱为维持稳定的环境，通常在培养基中添加缓冲物质如磷酸盐缓冲系统在工业发酵过程中，通常需要持续监测和自动调节值，以维持最佳pH pH生长条件培养条件氧气好氧微生物必须在有氧环境中生长的微生物，通过有氧呼吸获取能量代表性菌种包括铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌等实验室培养需要提供充足的氧气，通常采用振荡培养或增大培养容器的表面积与体积比工业上通常通过鼓气和搅拌提高氧气传递效率厌氧微生物在无氧环境中生长，通过发酵或厌氧呼吸获取能量代表菌种包括梭状芽孢杆菌、甲烷菌等培养需要特殊的厌氧设备，如厌氧培养箱、厌氧罐或使用化学还原剂消除氧气有些严格厌氧菌在接触氧气后会迅速死亡，需要格外小心处理兼性厌氧微生物既能在有氧环境生长，也能在无氧环境生长，但通常有氧条件下生长更好代表菌种包括大肠杆菌、酵母菌等这类微生物非常灵活，可根据环境中氧气的有无调整代谢方式在实验室培养中，静置培养通常形成部分氧气梯度，表层有氧而深层趋于无氧微好氧微生物需要低浓度氧气的微生物，高浓度氧气反而抑制其生长代表菌种包括坎氏螺旋菌、幽门螺杆菌等培养时需要控制环境中氧气含量在之间，可以通过特殊培养装置或微氧培养箱实现这类微生物常见2-10%于特定生态位，如胃肠道粘膜表面好氧培养法概述固体培养法液体培养法平板培养将微生物接种于琼脂平板表面，通过划线、涂布等方小体积静置培养适用于非严格需氧微生物，培养液与空气接触式使菌体分散平板培养便于观察菌落特征，广泛用于分离纯化面较小，氧气传递主要依靠表面扩散，氧气可能成为限制因素和菌落计数斜面培养在试管内倾斜凝固的琼脂培养基，增加表面积有利于振荡培养通过机械振荡增加培养液与空气的接触，显著提高氧需氧微生物生长，常用于菌种保藏和传代气传递效率常见的振荡频率为，大大提高生150-250rpm长速率和生物量通气培养在发酵罐中通过鼓气和机械搅拌提供充足氧气，可精确控制溶氧水平，适用于工业规模生产典型好氧培养举例平板划线培养法将接种环在火焰上灭菌，冷却后蘸取少量菌液，在琼脂平板上以字形或区域划Z线方式划线目的是通过逐步稀释使单个细胞分离，形成独立菌落划线时要轻柔，避免划破琼脂表面划线完成后将平板倒置（防止冷凝水滴落导致菌落混杂），置于℃培养箱小时3724-48液体摇瓶培养法准备含有适量培养基的三角瓶（通常装液量不超过瓶容积的以确保充分通1/5气），接种少量菌种（一般为体积比例）将瓶口用棉塞和铝箔封好，1-5%置于恒温振荡培养箱中，设定适宜的温度和转速（通常）150-220rpm培养期间可定期取样测定生长状况（如值）OD发酵罐培养法工业规模好氧培养的代表发酵罐具备温度控制、调节、溶氧监测、搅pH拌和通气系统首先进行小规模种子培养，然后按接种量转入发酵5-10%罐控制溶氧通常保持在饱和度，通过调节搅拌速度和通气量实20-30%现整个过程需要严格监控各项参数，确保微生物最佳生长状态厌氧培养法概述1%3-548h+氧气含量培养物品种类培养时间严格厌氧环境要求常用厌氧培养装置数量典型厌氧培养所需时间厌氧培养是为了培养那些在有氧环境下无法生长或生长受抑制的微生物厌氧微生物广泛存在于自然界，如土壤深层、沉积物、动物肠道和口腔等缺氧环境中许多重要的工业微生物如产丁醇梭菌、产甲烷菌等都是厌氧菌厌氧培养的核心是创造和维持无氧环境常用的厌氧培养装置包括厌氧培养箱（可容纳多个培养皿，具有气闸系统）；厌氧罐（内部放置产氢催化剂和钯催化剂，通过化学反应消除氧气）；厌氧培养袋（使用含还原剂的气体产生袋）；特殊培养管（如硫酸铵厌氧培养管，通过添加还原剂和指示剂监测）此外，一些现代技术如微流控芯片也被用于厌氧微生物的特殊培养需求典型厌氧培养举例典型的厌氧培养实例包括乳酸菌培养、丁酸菌培养和甲烷菌培养等以乳酸菌培养为例，首先需要准备含有发酵碳源（如葡萄糖）和生长因子（如酵母提取物）的培MRS养基为创造厌氧环境，培养基中添加半胱氨酸等还原剂，并使用甲基蓝作为氧化还原指示剂（蓝色表示有氧，无色表示厌氧）接种操作需在厌氧操作台或通过特殊技术快速完成，以减少氧气暴露接种后立即将培养容器置于厌氧环境中培养温度通常控制在℃，培养时间一般需要30-3748-72小时，因为厌氧微生物生长速度通常较慢观察乳酸菌生长可通过浊度增加和降低（由于产酸）来判断在工业生产中，啤酒和生物燃料生产都是利用厌氧发酵过程，pH需要精确控制发酵条件以获得最佳产量和品质培养的特殊方式微需氧培养表面培养固态发酵培养针对那些需要低浓度氧气（）环境的让微生物在固体培养基表面或液体培养基与空在无自由水或低水分含量固体基质上培养微生2-10%微生物，如幽门螺杆菌、空肠弯曲菌等常用气界面形成生物膜的培养方式特别适用于某物的方法，模拟自然界真菌在固体物质上生长的微需氧环境创建方法包括特殊气体配比些真菌和产膜细菌典型案例包括醋酸菌培养，的状态广泛应用于亚洲传统食品发酵，如酱₂₂₂培养箱；蜡其在液体表面形成厚膜（称为醋母）；青霉油、酱豆腐、味噌等制作；工业酶制剂如淀粉5%O,10%CO,85%N封层培养法，即在液体培养基表面覆盖少量石素生产中青霉菌的表面培养；以及传统豆腐乳、酶、纤维素酶的生产；以及农业废弃物的生物蜡油形成扩散屏障；以及化学法，使用特定比纳豆等发酵食品制作中的固态表面培养转化处理固态培养的优势在于模拟自然环境、例的还原剂产生适宜的微氧环境节约水资源、产物浓度高微生物分离技术概述稀释平板法将含有混合微生物的样品进行系列稀释（通常为倍梯度稀释），然后取适当稀释度10的样品涂布于平板培养基上经过培养后，在适当稀释度的平板上可获得分散的单个菌落，从中挑取进行纯化适用于大多数可培养微生物的分离平板划线法使用接种环蘸取少量菌液，在培养基表面以特定方式划线，使微生物逐渐稀释分散常用的划线方式有四区划线法和三区划线法优点是操作简便，适合日常微生物分离纯化工作缺点是分离效果受操作技术影响较大涂布平板法将适量稀释后的样品滴加到平板中央，用灭菌的涂布棒均匀涂抹整个培养基表面优点是分布均匀，便于计数和观察常用于菌落计数和需要定量分析的场合涂布时应注意由外向内划圈，确保样品均匀分布倾注平板法将样品与℃的融化培养基混合，倒入培养皿中凝固微生物菌落可在培养基内45-50部和表面生长优点是操作简便，可培养厌氧菌；缺点是不适用于热敏微生物，且内部菌落观察困难适用于需要在低氧环境下生长的微生物分离纯化技术步骤单菌落挑取初步分离使用接种环或接种针小心挑取形态典型、独立的单个菌落通过稀释、划线等方法将混合样品中的微生物分1散在平板上，获得单个菌落转接培养将单菌落接种到新的无菌培养基中进行扩大培养纯度检验反复纯化通过显微镜观察、生化特性测试等方法确认培养物的纯度将扩大培养物再次进行划线分离，重复上述步骤至少次3微生物纯化是获得纯种微生物的关键步骤，纯培养的建立是微生物学研究的基础在自然界中，微生物通常以混合群落形式存在，要研究某一特定微生物的特性，必须将其从混合物中分离纯化纯化过程的本质是将单个微生物细胞分离并让其繁殖形成纯种群体纯化过程中最关键的步骤是挑取单菌落理论上，一个菌落源自一个细胞，但实际操作中可能因为微生物细胞聚集或污染而导致混杂因此，通常需要连续多次纯化纯度检验可通过观察菌落形态的一致性、显微镜下细胞形态的一致性，以及生化反应的一致性来判断对于一些培养条件苛刻或生长缓慢的微生物，纯化过程可能需要特殊技术和耐心分离污染与鉴别空气污染人为污染器材污染空气中的微生物通过沉降污染开操作者皮肤、呼吸道等带入的微未完全灭菌的器材带入微生物放的培养基预防措施包括在生物防控措施包括戴口罩和预防措施包括严格执行灭菌程超净工作台或接种箱内操作；减手套；定期洗手消毒；避免说话、序；使用前检查灭菌指示；一次少培养基暴露时间；培养皿开口咳嗽对着培养物；使用无菌操作性器材使用后立即丢弃；接种环朝下并将操作台面酒精消毒常技术手部是最常见的污染源，每次使用前充分灼烧至红热培见空气污染菌包括芽孢杆菌和各手部皮肤的葡萄球菌等是典型污养物污染常见表现为混杂菌落、种真菌孢子染菌培养基浑浊、气味异常等纯度检测通过显微镜观察、生化试验和分子检测确认培养物纯度特别注意定期革兰染色检查；基因组扩增；测序等分PCR16S rRNA子鉴定手段计算污染率是实验室质量控制的重要指标，通常要求低于5%培养数量的测定直接计数法间接测定法显微镜计数使用计数板（如血球计数板）在显微镜下直接计数平板计数法将样品适当稀释后在平板上培养，计算菌落数量并微生物细胞数量适用于较高浓度的微生物悬液，可以区分活细乘以稀释倍数得到原始样品中的可培养微生物数量CFU/ml胞和死细胞（如用台盼蓝染色区分）优点是快速简便；缺点是优点是只计数可培养活细胞；缺点是耗时长（通常需要24-48精度受限，无法区分可培养和不可培养细胞小时）电子计数器如库尔特计数器，基于电阻变化原理计数微生物颗浊度法通过测量微生物悬液的浊度（如值）间接反映OD600粒优点是自动化程度高，适合大量样品；缺点是无法区分不同微生物数量优点是快速简便，可进行连续监测；缺点是受样品种类微生物和碎片颜色、细胞大小影响，需建立标准曲线校正代谢活性测定如含量测定、呼吸活性测定等，反映微生ATP物群体的代谢活性优点是灵敏度高；缺点是需要特殊设备和试剂微生物生长曲线同步培养与同步生长物理方法通过滤膜过滤或差速离心分离特定大小的细胞物理环境诱导利用温度周期变化或光周期诱导细胞周期同步营养限制法通过周期性营养供应控制细胞分裂同步同步度监测4观察细胞分裂指数和生化指标变化评估同步性同步培养是指使培养物中的所有细胞处于相同生长周期阶段的培养技术在常规培养中，微生物群体中各个细胞的生长周期通常不同步，这给研究特定细胞周期阶段的生理生化特性带来困难同步培养的目的是获得周期一致的细胞群体，以便研究细胞周期特异性事件，如复制、蛋白质合成和细胞分裂等DNA实现同步培养的方法主要有两类选择性方法和诱导性方法选择性方法如梯度离心分离，通过物理手段分离处于相同生长阶段的细胞；诱导性方法如温度休克或营养限制释放法，通过外部条件改变使细胞周期同步同步培养的一个重要特点是短暂性，随着世代数增加，同步性会逐渐消失同步培养广泛应用于细胞周期研究、细胞分化机-制探究和特定阶段产物表达等领域实验器材介绍培养皿用于固体培养基平板制备的容器，通常由聚苯乙烯制成，一次性使用标准培养皿直径约，高约使用前应确认无破损和污染使用后培养物需经高压灭菌处90mm15mm理后丢弃培养时应倒置放置，防止冷凝水滴回培养基表面引起污染接种环用于微生物接种和转移的工具，由金属丝（铂丝、镍铬合金）制成环状，或使用一次性塑料接种环使用前需在酒精灯火焰中灼烧至红热灭菌，冷却后再接触培养物接种完成后再次灼烧灭菌操作时应避免接种环碰触容器边缘，防止污染高压蒸汽灭菌锅用于培养基和实验器材灭菌的设备，通过高温高压蒸汽杀灭微生物标准灭菌条件为℃，分钟，压力约使用前应检查水位和密封性，灭菌后应等压12115-

20103.4kPa力降至常压才能开启不同材料可能需要不同灭菌时间，液体培养基体积越大需要的灭菌时间越长灭菌与无菌操作技术火焰灭菌操作无菌样品转移在接种操作前点燃酒精灯，火焰始终保持操作台面清洁，用75%周围范围内空气中的微生酒精擦拭将接种源靠近目标培30cm物大大减少接种环使用前在火养基，快速准确完成转移避免长焰中烧至红热，冷却后使用试时间暴露液体样品转移可使用管口在打开前需在火焰上快速通无菌吸管或移液器，切勿接触管过数次，倾斜时避免培养物接触壁固体培养基接种需轻柔操作，试管口操作完毕后再次在火焰避免划破培养基表面操作过程上通过试管口，迅速盖好盖子中保持安静，减少气流扰动超净工作台使用使用前开启紫外灯照射分钟，然后关闭紫外灯开启层流风分钟20-3010-15工作区不要摆放过多物品，保持气流通畅操作时手不应穿过样品和气流方向，避免背部气流扰动完成后清理工作台，再次开启紫外灯消毒定期检查过滤器效率和风速，确保性能正常HEPA实验室安全规范个人防护装备生物安全操作实验室工作必须穿戴适当的防护装备不同危险等级的微生物需在相应生物安实验服应当全程穿着并定期清洗消毒，全级别实验室操作一级病原体必须在离开实验室前必须脱下乳胶或丁腈手实验室处理；二级病原体在BSL-4套在处理所有微生物样品时必须佩戴，；三级在；常规非致病BSL-3BSL-2接触不同样品间应更换手套护目镜在微生物在所有气溶胶产生操BSL-1处理危险试剂或可能发生飞溅时必须佩作应在生物安全柜内进行移液操作禁戴呼吸防护装置在处理高致病性或可止用口吸，必须使用移液器所有含活能产生气溶胶的操作中使用微生物的废弃物必须经高压灭菌处理后方可丢弃意外处理与报告培养物泼溅立即用酒精或适当消毒剂覆盖至少分钟后清理，并记录事件75%20划伤或刺伤用肥皂水彻底清洗伤口，必要时就医并向实验室安全员报告吸入危险物质立即离开污染区域，到通风处休息，必要时就医任何安全事故必须在小24时内向实验室负责人报告，并填写安全事故记录表培养基补给与贮存培养基类型推荐存储条件保存期限注意事项干粉培养基室温干燥处，避光密封年开封后应密封，注意防潮2-3预制平板培养基℃冰箱，倒置密封周使用前检查污染和干燥情况42-4琼脂斜面培养基℃冰箱，拧紧盖子个月防止水分蒸发和污染41-2液体培养基℃冰箱，密封保存个月使用前观察是否混浊或沉淀42-3含抗生素培养基℃避光保存周抗生素易降解，定期更新42-4自制特殊培养基根据成分确定条件通常个月内使用标记配制日期和成分1实验室常见错误与警示在微生物培养实验中，常见错误主要包括接种操作不当导致交叉污染，如接种环灭菌不彻底或操作时接触容器边缘；培养基配制错误，如值不当、成分比例失调或灭pH菌不充分；培养条件控制不当，如温度波动过大、湿度控制不佳导致培养基干裂；保存不当，如平板冰箱存放未倒置导致冷凝水污染；标记不清，导致样品混淆为防止这些错误，建议实施以下措施建立标准操作规程并严格执行；所有培养物清晰标记，包括微生物名称、日期和操作者；定期检查设备性能，如恒温箱温度校SOP准；设置实验阴性对照和阳性对照；定期进行实验室环境微生物监测；对新人进行充分培训和考核；建立培养基质量控制体系，包括灭菌效果检验和性能测试；实验记录详实完整，便于追溯问题根源微生物培养的质量控制结果验证对照标准确认培养结果可靠性过程监控培养全流程关键参数持续监测材料控制培养基和试剂质量保证体系环境管理4实验室设施和环境条件规范控制人员培训操作人员专业技能和规范意识培养微生物培养质量控制是确保培养结果准确可靠的系统性管理体系从人员、环境、材料、过程到结果验证，形成全方位的质量保证网络首先，实验室人员需经过系统培训，掌握无菌操作技能，定期进行考核和能力验证；其次，实验室环境需符合相应生物安全级别要求，定期监测空气微生物含量和表面污染程度培养材料方面，所有培养基需进行性能测试（如生长支持能力、选择性、鉴别能力），灭菌效果需用生物指示剂验证培养过程监控包括温度、、气体组成等物理化学参数的实时记录和异常pH报警每批培养实验应设置阳性和阴性对照，定期参加室间质评，建立标准菌株的周期性验证通过完善的文件系统记录所有操作和结果，实现全程可追溯性，确保微生物培养的科学性和可靠性培养实验典型案例1酵母菌种前培养选用适合发酵工艺的酿酒酵母菌株（如），从斜面保藏Saccharomyces cerevisiae菌种接种到含麦汁的初级液体培养基°糖度，℃培养小时，使10-12P2716-20细胞充分活化显微镜检查确认细胞形态正常、活力高，无杂菌污染酵母细胞数量达到×个，此时酵母处于旺盛生长期，适合扩大培养1-210^7/ml酵母扩培培养将前培养物按比例接种到含麦芽糖浆、酵母提取物和无机盐的扩培培养基中，10%在控温摇瓶℃或带搅拌通气的发酵罐中培养小时监测28,180rpm8-12pH值保持在范围，培养后期应进行抗性训练，如逐步提高糖度或酒精浓度，

4.5-

5.5使酵母适应后续发酵条件扩培结束时酵母数量应达到×个1-310^8/ml发酵应用培养将扩培后的酵母按一定比例约接种到实际发酵体系中啤酒发酵典型5-7%条件为麦汁比重°，发酵温度根据啤酒类型选择上发酵℃，10-12P15-20下发酵℃发酵过程监测参数包括比重下降率、酒精生成、变化和8-12pH释放量发酵结束后，通过冷却促使酵母沉降，部分酵母可回收用于下CO2批次发酵，但一般不超过代以避免菌种退化3-5培养实验典型案例2土壤样品处理采集表层下深度的土壤样品，自然风干，研磨过筛获得均匀样品采用连续稀释5-15cm法，取土壤加入无菌水，震荡分钟制成悬浮液，再逐级稀释至10g90ml3010^-110^-不同稀释度样品分别用于不同类群微生物的分离62选择性培养与分离根据目标微生物选用不同培养基细菌可用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，真菌可用马铃薯葡萄糖琼脂培养基，放线菌可用高氏一号培养基将稀释后样品涂布于平板，℃培养282-7天根据菌落形态特征，挑选目标菌落进行纯化，反复划线至少次获得纯培养物3功能筛选与鉴定根据研究目的进行功能筛选，如产酶活性测定（纤维素酶、蛋白酶等），拮抗活性测试，重金属耐受性测定等初筛阳性菌株进行形态学观察和生理生化特性测定重要菌株可进行或序列分析进行分子鉴定，确定其分类地位16S rDNAITS菌种保藏与应用短期保存可用琼脂斜面℃保藏；长期保存采用甘油冻存℃或冻干保存有应用潜力4-80的菌株可进行小规模发酵实验，评估其在生物肥料、环境修复或酶制剂生产等方面的应用价值，为后续产业化奠定基础培养实验典型案例3临床菌株分离与保存药敏试验与质量控制医用菌株培养需要特别注意生物安全，通常在或更高级医用菌株分离后通常需进行药敏试验，评估其对各种抗生素的敏BSL-2别实验室进行以病原菌筛选为例，首先接收临床样本（如咽拭感性常用方法包括纸片扩散法和微量肉汤稀释法操作K-B子、痰液、血液等），在适当选择性培养基上分离可疑菌落例中需严格控制接种量、培养时间和温度等条件，并设置标ATCC如，血液样本通常接种于血琼脂和巧克力琼脂，肠道病原菌可用准菌株作为质控麦康凯琼脂或琼脂进行初筛SS整个医用菌株培养过程需建立完善的质量控制体系，包括培养基菌落纯化后，进行形态学观察（如革兰染色）和初步生化鉴定性能验证、仪器设备校准、操作流程标准化、人员能力评估和结（如氧化酶、触酶试验）对重要菌株可使用自动化微生物鉴定果解释标准化等此外，需定期参加实验室间能力验证计划，确系统或质谱分析进行精确鉴定确认后的菌株需严格按照生物安保结果的准确性和可比性所有操作和结果需详细记录，实现全全要求保存，通常采用℃低温冷冻或冻干技术进行长期保过程可追溯，这对临床诊断和治疗决策至关重要-80存新型培养技术连续培养技术流加培养技术固定化细胞培养通过连续添加新鲜培养基并移出等在批次培养过程中按一定策略持续将微生物细胞固定在载体材料上进量培养物，维持微生物在对数期生或间歇添加营养物质，不排出培养行培养的技术常用载体包括藻酸长状态的培养方式特点是能长期物的培养方式优点是可避免底物钙凝胶珠、聚丙烯酰胺凝胶、多孔保持稳定的生理状态，适合产物持抑制和产物抑制，达到高细胞密度陶瓷等优势在于可提高细胞浓度、续生产和代谢研究代表装置有趋和高产量常用于重组蛋白表达、便于细胞回收和重复使用、降低流化器和浊度稳定器高密度发酵和代谢调控研究补料失风险广泛应用于酶制剂生产、Chemostat，广泛应用于工业发策略包括恒速补料、指数补料、反废水处理和特殊发酵工艺中Turbidostat酵、生物反应动力学研究和微生物馈控制补料等进化实验自动化培养系统整合机器人技术、图像分析和数据管理的高通量培养平台可实现接种、培养、采样和分析的全自动化，大幅提高实验效率和重复性代表系统有生物反应器阵列、培养板阅读器和微流控芯片培养装置，为合成生物学、药物筛选和微生物组学研究提供技术支持培养技术的挑战与前沿可培养性难题高通量筛选技术自然环境中以上的微生物无法从单杯单菌到百万菌株并行筛选99%用传统方法培养，被称为微生物暗的飞跃，是药物发现和代谢工程的物质新型培养策略包括原位培关键技术亮点包括微流控芯片养装置如扩散室；模拟自然环境培养实现单细胞操作；生物反应器的共培养系统；基于宏基因组学引阵列同时监测数百个培养条件；荧导的定向培养设计；超长培养周期光激活细胞分选与培养筛选FACS方法捕获超慢生长菌；单细胞分离整合；基于机器学习的图像识别自与微液滴培养技术突破传统极限动菌落筛选系统；可编程微滴生物反应器用于酶和细胞工厂筛选极端环境微生物培养极端环境微生物蕴含巨大应用潜力，培养难度极高创新培养技术包括超高压培养系统模拟深海环境；超高温厌氧培养装置℃以上；冰核诱导100MPa120极低温培养℃到℃；强酸强碱耐受特殊材料培养器；多重极端条件组合-5-20/培养系统如高温高压高盐联合培养装置培养技术在生物工程中的应用酶制剂生产抗生素开发1通过微生物培养生产各类工业用酶，如淀粉酶、蛋筛选并培养产抗生素菌株，优化发酵条件提高产量白酶和纤维素酶等和纯度生物燃料生产重组蛋白表达4培养能源微生物转化生物质为乙醇、丁醇或氢气等利用工程菌培养生产治疗性蛋白、疫苗和工业酶制清洁能源剂生物工程领域的工业酶制剂生产主要依赖于微生物培养技术以产淀粉酶的枯草芽孢杆菌为例，工业生产中通常采用两段发酵工艺种子培养阶段，使用含有可溶性淀α-粉、蛋白胨和酵母提取物的培养基，控温℃，通气，培养小时；发酵阶段使用高淀粉含量培养基，控温℃，保持在，通气量

320.5vvm18-2438pH

6.8-

7.

21.0-，每小时测定酶活性

1.5vvm12抗生素生产中，青霉素发酵是典型案例首先筛选高产菌株，然后经过种子培养扩大，最后在含有特殊前体物质（如苯乙酸）的培养基中进行生产发酵发酵过程采用pH阶段控制策略，初期维持促进菌体生长，中后期降至以利于青霉素合成和稳定性温度通常控制在℃，避免高温降低产量整个过程需严格控制溶pH

6.5pH

6.025-27氧在饱和度以上，并采用流加培养策略补充营养物30%培养技术在食品工业中的应用酵母菌培养酵母是食品工业中应用最广泛的微生物之一，用于面包、啤酒和葡萄酒发酵工业化生产采用分批培养和流加培养相结合的方式，使用糖蜜或麦芽汁为基础培养基，添加氮源和矿物质培养温度通常控制在℃，值，溶氧保持在以上生产过程中严格控制糖的添加速率，避免效应导致产酒精而非生物量28-32pH

5.0-

5.530%Crabtree乳酸菌培养乳酸菌广泛应用于酸奶、奶酪、泡菜等发酵食品生产工业化培养通常采用培养基或脱脂乳为基础，以批次培养为主嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌是酸奶生产的主要MRS菌种，培养温度℃，起始值，发酵过程中降至左右控制发酵时间至关重要，过度发酵会导致产品酸度过高影响风味现代工艺中常采用定制的42-45pH

6.5-

6.8pH

4.5混合菌种配合使用食品添加剂生产微生物培养用于生产多种食品添加剂，如柠檬酸、谷氨酸钠和色素等以柠檬酸生产为例，主要使用黑曲霉进行发酵，培养基以蔗糖或淀粉为碳源，添加铵盐和低浓度铁离子发酵采用分批工艺，初期控制在促进生长，产酸阶段维持在，温度控制在℃，发酵周期通常为天产物分离包括过滤、浓缩和结晶等pH

6.0-

6.5pH

3.0-

4.030-327-10步骤培养技术在环境治理中的应用污水生物处理活性污泥法是最常用的污水生物处理技术，依靠微生物群落降解有机污染物核心微生物包括硝化细菌、反硝化细菌、聚磷菌等，形成复杂的食物链工艺参数控制包括溶解氧、污泥负荷2-4mg/L和污泥龄天新兴的膜生物反应器技术整合了生物处

0.2-

0.4kgBOD/kgMLSS·d5-15MBR理和膜分离，大大提高了处理效率和出水质量土壤生物修复利用微生物降解土壤中的石油烃、多环芳烃和农药等污染物技术路线包括原位强化生物修复和异位堆肥处理关键微生物如假单胞菌属、芽孢杆菌属等需要通过特殊培养基富集和驯化，培养过程调控比例通常为以优化降解效率先进的添加剂如生物表面活性剂可提高生物利用度，C:N:P100:10:1降低修复周期和成本3生物过滤与生物洗涤处理工业废气的生物技术，利用微生物降解气态污染物如、氨气和硫化氢生物过滤器填料通VOCs常为泥炭、堆肥或聚氨酯泡沫等，接种特定降解菌群后运行关键控制参数包括湿度、40-60%和温度℃新型生物滴滤塔和生物洗涤塔通过优化气液接触方式，显著提高pH

6.5-

7.515-35了去除效率，广泛应用于中低浓度有机废气处理微藻培养与应用微藻具有吸收二氧化碳和净化水体的双重环境功能开放式池塘和封闭式光生物反应器是两种主要培养方式光照光强与光周期、温度℃和浓度是影响生长的关键因素螺旋藻、20-30CO21-5%小球藻等常用于废水中氮磷去除，同时产出高价值生物质，实现环保与经济双重效益最新的固定化微藻技术显著提高了生物质回收效率培养技术在医学领域的应用临床检验与诊断疫苗生产微生物培养是病原体检测的金标准血传统灭活疫苗需大规模培养病原微生物液培养采用专用培养瓶，℃恒温培养如流感疫苗使用鸡胚或细胞培养36MDCK天，阳性信号后进行分离鉴定痰系统，通过精确控制温度℃和5-733-35液等标本需经过前处理减少干扰，接种优化病毒增殖减毒活疫pH

7.0-

7.4于选择性培养基如巧克力琼脂、血琼脂苗如麻疹疫苗采用特定细胞系培养，要等新型自动化血培养系统能实时监测求严格的培养条件和质量控制现代疫微生物生长，显著缩短检出时间药敏苗技术如亚单位疫苗和疫苗，依mRNA试验采用纸片扩散法或微量稀释法，为赖重组微生物表达系统，如大肠杆菌、临床用药提供依据酵母或杆状病毒昆虫细胞系统-微生物组研究人体微生物组研究依赖先进培养技术捕获不可培养菌群厌氧培养舱、气体混合培养箱和微流控芯片技术使研究者能培养肠道微生物以上的物种，远超传统方法的覆97%30%盖率培养组学结合高通量培养和质谱鉴定，已在肠道微生物研究中发现Culturomics数百个新物种个性化培养基设计和微生态系统共培养模拟人体环境，为研究肠脑轴、-肠肝轴等提供了工具-培养失误与失败案例分析交叉污染案例某研究生在培养抗生素产生菌时，所有平板均出现不明杂菌分析原因为未严格执行无菌操作规程，接种环灭菌不充分；工作台面消毒不彻底；开放环境下操作时间过长解决方案重新训练无菌操作技术；使用超净工作台；缩短操作时间；增加对照平板监测环境污染情况此类污染在微生物实验中时有发生，影响实验结果可靠性培养条件失控某乳酸菌发酵实验过程中，菌体生长异常缓慢调查发现初始值设定错误而非，远超乳酸菌生长最适范围此外，灭菌过程中缓冲成分部分失效，缓冲能力pH

8.

26.5pH下降改进措施建立检查复核制度；采用更稳定的缓冲系统；在接种前再次确认值；培养过程增加监测频率类似条件控制失误案例还包括温度设置错误、氧气pHpHpH供应不足等菌种变异与退化某实验室长期传代培养的工程菌株产酶活性持续下降原因分析过度传代超过代导致遗传不稳定；选择压力缺失使目标基因丢失；培养基组分不平衡加速突变解决20策略建立菌种库冻存系统℃；限制传代次数不超过代；定期检测关键表型和基因型；优化培养基减少选择压力；采用化学诱变或基因工程手段恢复菌株活性-805常见问题问答问题原因分析解决方案为什么我的培养基灭菌后变色？美拉德反应培养基中氨基化合分开灭菌糖和其他成分；降低灭物与还原糖在高温下反应菌温度和时间；调整值减少pH反应平板上没有菌落生长怎么办？可能原因接种量太少；培养基增加接种量；检查培养基成分；不适合；培养条件不适；微生物调整培养条件；确认菌种活力活力低为什么厌氧培养总是失败？操作问题氧气没有完全排除；检查厌氧设备密封性；更换新鲜厌氧指示剂失效；培养基中残留指示剂；培养基预先煮沸排气氧气如何区分污染和正常生长？形态特征菌落形态、颜色、生设置阳性对照；显微镜观察确认；长位置异常；典型污染如霉菌生进行纯度检查；熟悉目标菌种特长征液体培养为何经常出现假阳性？可能是物理变化如沉淀；或培养设置无菌对照；显微镜检查；亚基成分自发变化；或轻微污染培养到固体培养基确认接种环为何总是粘连大量琼脂？操作问题接种环温度过高；琼灼烧后充分冷却；调整琼脂浓度；脂浓度不适；划线技术不正确改进划线技术；使用一次性接种环未来发展趋势微流控芯片培养结合微流控技术与微生物培养的新一代平台，实现单细胞水平的精准培养和分析特点包括微升级样品消耗、高通量并行培养、梯度条件筛选和实时监测:与培养自动化AI人工智能和机器学习技术与自动化设备结合，优化培养条件和预测生长模式关键进展智能培养基配方设计、生长曲线预测、异常检测和培养参数实时调:整合成微生物培养针对人工设计微生物的特殊培养要求，开发新型培养策略和系统包括定制:化培养基设计、代谢流重编程培养和基因线路表达控制生物打印与组织培养3D将微生物整合到打印结构中，创造具有特定功能的复杂微生物群落应用3D方向人工微生物组织、共生系统模拟和组织工程载体:总结回顾广泛应用医药、食品、环境、工业多领域落地先进技术2自动化、高通量、多组学交叉融合培养方法3好氧、厌氧、特殊培养方式系统化培养基设计营养配方、物理形态、功能特化微生物特性生理生化特性与培养条件匹配本课程系统介绍了微生物培养技术的理论基础、方法体系和实际应用从微生物的基本特性出发，详细讲解了培养基设计、培养条件控制、无菌操作技术等核心内容，构建了完整的微生物培养知识框架特别强调了不同培养方法的选择原则和操作要点，如好氧培养、厌氧培养和特殊培养技术等通过典型案例分析，展示了培养技术在医药、食品、环境和工业生产中的应用价值质量控制和问题排查部分为实验室工作提供了实用指导展望未来，微流控芯片培养、辅助自动化和合成AI微生物培养等新兴技术将进一步拓展微生物培养的应用边界微生物培养技术作为生命科学的基础工具和应用技术的桥梁，将继续在科学发现和产业发展中发挥不可替代的作用推荐阅读与资源经典教材推荐《微生物学教程》周德庆主编系统介绍微生物基础知识；《微生物培养技术》张宏主编专注培养方法与实验技术；《工业微生物学》邓子新主编侧重发酵与工业应用；《》医学微生物培养经典参考书最新研究进展可关注Medical MicrobiologyMurray《》、《》等期刊Applied andEnvironmental MicrobiologyJournal ofMicrobiological Methods线上资源美国菌种保藏中心提供标准菌株信息与培养指南；欧洲生物信息研究所微生物基因组数据库；中国微生物菌种保藏管ATCC EBI理委员会网站含大量国内菌种资源；提供专业微生物培养图示模板；和平台上的微生物学在线课程实验室可使用微BioRender CourseraedX生物培养数据管理系统如进行记录和质量控制，生物安全培训资源可参考生物安全手册在线版本LabCollector WHO课后思考与作业设计一种特定微生物的培养方案选择一种特定微生物如乳酸菌、大肠杆菌或酵母菌，设计完整的培养方案，包括培养基配方、培养条件、接种方法和生长监测方式方案中需要说明选择每个条件的理论依据，并预测可能遇到的问题及解决策略要求考虑微生物的生理特性与培养目的的匹配，合理设计每一步骤，体现科学思维和实用性分析培养条件对微生物生长的影响以温度、或碳源类型为变量，设计对比实验分析其对所选微生物生长的影响pH要求制定详细的实验计划，包括对照组设置、样品采集时间点和数据分析方法在实验设计中应考虑如何保证其他条件的一致性，以及如何量化微生物生长参数如生长速率、最大生物量等分析结果时需要绘制生长曲线并计算关键参数微生物培养的创新应用构思选择一个社会或环境问题如塑料污染、食品安全或清洁能源，构思如何利用微生物培养技术提出创新解决方案要求明确目标微生物的选择依据、培养策略的技术路线、应用场景的具体描述以及可能面临的技术挑战创新点可以是新型培养方法、特殊功能微生物的筛选培养或培养系统的工程化改进等应用构思要求既有科学依据又有实践可行性。