生物化学实验课件：南方医科大学版

生物化学实验课件南方医科大学版欢迎来到南方医科大学生物化学实验课程本课程旨在培养学生扎实的生物化学实验技能，结合理论与实践，提升科研素养通过系统学习实验室技术、数据分析与科研方法，帮助学生掌握现代生物医学研究必备能力本课件涵盖实验室安全、基础技术、蛋白质与核酸研究方法、细胞实验及前沿应用等内容，采用案例教学，强调实操与思考能力培养，为学生未来的科研工作奠定坚实基础课程简介实验课程定位培养目标基础与创新并重本课程是医学生物化学的重要实践环通过本课程学习，学生将掌握生物化学课程设计既重视基础技能训练，如蛋白节，旨在巩固理论知识，培养实验技基本实验技术，培养严谨的科学态度、质与核酸分析等常规技术，也鼓励学生能生物化学实验是南方医科大学医规范的操作习惯和分析解决问题的能进行创新性思考，培养设计、优化实验学、生命科学等专业的必修课程，与理力课程注重激发学生科研兴趣，引导方案的能力，提升科研素养，为未来从论课程相辅相成，是培养未来医学人才学生了解生物化学与临床医学的紧密联事医学科研打下坚实基础的关键环节系生物化学实验课程特色理论与实践相结合每个实验项目均设有理论介绍环节，帮助学生理解实验原理，掌握实验目的，明确操作要点实验前进行案例讨论，增强学生对实验背景的理解，激发学习兴趣，培养科学思维方式强调实验设计与分析注重培养学生独立思考能力，鼓励学生参与实验设计，分析实验数据通过设置开放性问题，引导学生发现实验中的关键问题，培养解决问题的能力和创新思维小组合作与交流分享实验课程采用小组合作模式，培养团队协作精神定期组织研讨会，鼓励学生分享实验心得，交流实验技巧，共同提高通过小组竞赛激发学习积极性，提升实验效果注重科研思维培养通过案例分析、文献阅读、实验设计等环节，培养学生的科研思维和创新意识鼓励学生参与实际科研项目，体验科研全过程，为未来从事医学科研工作打下坚实基础实验课程大纲与章节安排第一阶段基础技能训练共计4周，主要包含实验室安全教育、基本操作技能培训、常用仪器使用指导通过基础培训确保学生掌握实验室规范与安全意识，能够正确使用常见生化分析仪器设备第二阶段核心实验技术共计8周，主要学习蛋白质提取与分析、核酸技术、细胞培养与功能研究等核心实验方法此阶段要求学生独立完成实验操作，并对实验结果进行分析与讨论第三阶段综合应用实践共计4周，学生将分组完成综合性实验项目，涉及分子生物学、生物化学与细胞生物学交叉领域的研究方法通过团队协作解决实际科研问题，培养综合应用能力考核评价体系实验课成绩由平时表现（30%）、实验报告（40%）和结业考核（30%）组成平时表现包括出勤率、实验操作规范性和小组讨论参与度；实验报告评分标准包括数据记录完整性、结果分析深度和实验思考创新性生物化学实验室概述实验中心结构布局南方医科大学生物化学实验中心位于学校主校区科研楼三至五层，总面积约3000平方米实验中心按功能划分为教学区和研究区两大部分，教学区主要承担本科生实验教学任务，研究区面向研究生和科研项目开放主要功能分区实验中心包含基础生化实验室、分子生物学实验室、细胞培养室、仪器分析室、冷藏储存区和数据处理中心等功能分区各区域配备专业技术人员负责日常管理与技术支持，确保实验教学和科研工作顺利进行先进设备配置实验室配备高速离心机、PCR仪、电泳系统、蛋白质纯化系统、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等先进仪器设备仪器设备总价值超过3000万元，满足从基础实验到高端科研的多层次需求信息化管理系统引入实验室信息管理系统LIMS，实现试剂耗材、仪器设备的智能化管理学生可通过系统预约实验台位和仪器，提高实验室资源利用效率，优化教学流程分子生物学实验室介绍核酸分析平台基因编辑技术平台配备多台高通量PCR仪、实时荧光定量PCR具备CRISPR/Cas9基因编辑系统，配套细系统、自动核酸提取仪和基因测序仪，支持胞转染设备和分子克隆工作站支持基因敲从样本提取到核酸检测的全流程操作可完除、敲入和定点突变等实验，为学生提供前1成常规PCR、RT-PCR、定量PCR等多种核沿分子生物学技术训练酸分析实验开放共享优势显微成像系统实验室资源向全校师生开放，并加入区域生配备荧光显微镜和细胞活体成像系统，支持物医学研究联盟，与周边医疗机构和科研院荧光标记蛋白观察、细胞定位研究和动态过所共享设备与技术通过建立预约制度和技程记录系统连接图像处理工作站，便于实术支持体系，提高仪器使用效率，促进跨学验数据的采集与分析科合作细胞生物学实验室简介样本资源库建立多种细胞株和原代细胞资源库培养技术平台提供标准化细胞培养与功能分析数据分析系统整合细胞学实验结果与数据处理观察与检测设备4配备多种细胞形态与功能分析仪器细胞生物学实验室设有三级生物安全防护措施，具备处理各类人体细胞和部分病原微生物的能力实验室内设独立培养区、污染控制区和设备操作区，全天候维持恒温、恒湿环境，确保细胞实验稳定性和可重复性核心实验项目包括原代细胞分离培养、细胞增殖与活力分析、细胞毒性评价、细胞凋亡检测、细胞周期分析等实验室特别强调无菌操作技术培训，为学生提供系统化的细胞实验技能训练安全第一实验室安全总则个人防护要求重点风险提示安全行为准则进入实验室必须穿戴洁生物化学实验室主要风遵循先安全，后实验净实验服、一次性手套险包括化学品灼伤、生原则，熟悉实验室布局和闭口鞋操作生物样物污染、仪器操作不当和安全设施位置实验本或危险化学品时，需和火灾隐患液氮、高前必须了解实验风险和佩戴防护眼镜和口罩温灭菌、强酸强碱操作应急处理流程发现安长发必须扎起，禁止佩为高风险环节，需有专全隐患应立即报告，不戴长项链和悬挂饰物人指导实验过程中禁隐瞒任何安全事故保离开实验室前，必须脱止吸烟、饮食，禁止独持实验台面整洁，定期去所有防护装备，洗手自一人进行高风险实清理废弃物，维护实验消毒验室公共安全环境常见实验室安全隐患与防护防火安全掌握消防设备位置与使用方法用电安全遵循电气设备操作规程化学品安全正确存放和处理化学试剂生物安全防范生物样本污染与交叉感染实验室是高风险工作环境，防火安全是首要考虑因素实验室内配备灭火器、消防毯和紧急喷淋装置，所有学生必须熟悉这些设备的位置和使用方法易燃化学品必须存放在专用防爆柜中，远离热源和电气设备用电安全方面，实验室采用接地保护系统，禁止使用非指定电器和私拉电线使用高压、高温设备时必须遵循操作规程，不得擅自调整或修理仪器设备生物安全方面，所有生物样本必须在生物安全柜内操作，使用后及时消毒，防止污染扩散危险化学品管理规定标识系统存储规范所有化学品必须贴有清晰标签，标明化化学品按性质分类存放，酸碱分开，有学名称、危险等级、使用日期和责任机溶剂与氧化剂隔离易燃易爆品存放人南方医科大学采用国际通用的GHS在防爆冰箱或防爆柜中，剧毒品需双锁分类标识系统，不同危险特性用不同颜双人管理实验室内化学品存量不得超色和图标表示过当天使用需求量应急处理使用登记实验室配备化学品泄漏应急套件，包含实验室实施化学品使用登记制度，每次中和剂、吸附材料和防护装备发生化取用需记录品名、数量、用途和操作学品泄漏时，应立即报告并按应急预案人特殊化学品（如强酸强碱、有机溶处理，重大泄漏需疏散人员并通知专业剂）使用后需及时归还，禁止私自带出团队处理实验室或转借他人实验室废弃物处理规范化学废液处理生物废弃物处理污染消毒流程实验室化学废液严禁直接倒入水槽废含生物活性样本的废弃物必须经高压灭工作台面每次实验后用75%酒精擦拭消液按性质分类收集，酸性、碱性、含重菌处理后方可丢弃培养皿、移液管等毒地面每日用含氯消毒液拖洗发生金属、有机溶剂等分别存入专用废液一次性塑料制品放入生物危险废物袋生物样本泄漏时，应立即用吸水纸覆桶废液桶需贴有明确标签，标明废液锐器（如针头、玻片）放入专用锐器盖，再倒入消毒液浸泡15分钟以上所类型和收集日期满罐后由专业团队统盒实验动物尸体需冷藏后交由专业机有可能接触生物样本的物品必须经消毒一处理，需填写废液转移记录表构处理才能带出实验室高压消毒与生物安全操作前检查使用高压灭菌锅前，需检查水位、电源和密封圈状态确认安全阀和排气阀功能正常，锅体无腐蚀损伤高压灭菌锅每年需进行一次专业安全检测，确保设备完好操作标准流程灭菌物品需分类包装，避免过度拥挤灭菌程序通常设置为121℃，15-30分钟，根据物品类型调整时间启动后需确认压力表和温度计正常工作，切勿中途开盖灭菌后处理灭菌结束后，须等压力降至0后再缓慢开盖，避免蒸汽喷出造成烫伤取出物品时使用隔热手套，检查灭菌指示带变色情况确认灭菌效果记录灭菌日期、时间和操作人急救器材使用实验室配备烫伤急救箱，内含冷水喷雾、烫伤膏和无菌敷料发生烫伤应立即用流动冷水冲洗伤处15分钟以上，严禁使用冰块直接接触伤口重度烫伤需立即就医治疗实验前准备工作文献查阅实验前应查阅相关文献，了解实验原理和研究背景南方医科大学图书馆提供丰富的电子资源，包括ScienceDirect、PubMed等数据库学生可利用校园网访问这些资源，掌握实验技术的最新进展和应用实验设计根据实验目的制定详细的实验方案，包括样本处理、试剂配置、操作步骤和数据收集方法设计实验时应考虑阳性/阴性对照、重复实验次数和可能的误差来源，确保实验结果的可靠性和科学性记录本规范实验记录本是科研工作的重要凭证，需按规定格式填写每页标明日期、实验题目和操作者姓名记录内容包括实验目的、材料、方法、原始数据和初步结论错误数据不得涂改，应划线标注并签名电子数据需定期备份并与纸质记录对应实验材料与试剂管理试剂溯源管理是保证实验结果可靠性的重要环节所有试剂均需记录生产厂家、批号、购买日期和有效期等信息首次开封的试剂应标注开封日期和使用人，特殊试剂需记录使用量和剩余量常用缓冲液如PBS、TBS等应由专人统一配置，标明配制日期、pH值和储存条件蛋白电泳胶、细胞培养基等需按需配制，避免长期储存导致性能下降实验室实行试剂预警系统，当库存低于警戒线时自动提醒补充，确保实验工作不受影响常用实验仪器离心机1使用前准备开机前检查电源线和离心腔是否清洁干燥，转子是否安装牢固样品管需配平放置，对角位置重量误差不超过

0.1g样品管盖必须拧紧，防止离心过程中样品泄漏造成污染或转子失衡2参数设置根据实验需求设定转速、离心力g值、时间和温度不同型号离心机的最大转速和离心力不同，设置时不得超过仪器或转子的最大限值低温离心需提前开启制冷系统，待温度达到设定值后再放入样品3操作过程启动离心机后，需观察运行是否平稳，有无异常噪音离心过程中不得开盖或移动仪器离心结束后，待转子完全停止才能开盖取样如发现异常情况，应立即按下紧急停止按钮，并报告实验室管理员4离心力换算离心力g值与转速rpm的换算公式为g=

1.118×10^-5×r×N^2其中r为离心半径cm，N为转速rpm不同实验对g值要求不同，蛋白质沉淀通常需要10,000-20,000g，细胞分离可能只需1,000g以下常用实验仪器分光光度计工作原理校准方法数据读取分光光度计是基于朗伯使用前需进行波长校准测量蛋白质浓度常用-比尔定律，通过测量和吸光度校准波长校280nm，核酸测量使样品对特定波长光的吸准可使用钬滤光片或重用260nm，酶活性测收来定量分析物质浓铬酸钾溶液进行吸光定则依据底物或产物的度光源发出的光经单度校准使用标准光密度特征吸收峰选择波长色器分离后通过样品，片或硫酸铜溶液每次数据读取时注意吸光度检测器记录透过光强使用前需测量空白对最佳范围为

0.1-

1.0，超度，转换为吸光度值照，消除试剂本底和比出此范围应稀释样品重吸光度与样品浓度在一色皿差异的影响测结果计算时考虑稀定范围内呈线性关系释倍数和样品分子特性常用实验仪器电泳仪操作要点材料配置上样前检查电极连接正确性，确保缓冲液覆盖电泳分离原理聚丙烯酰胺凝胶PAGE常用于蛋白分离，浓度电极蛋白样品需与加样缓冲液混合并加热变电泳分离利用电场力使带电分子在凝胶介质中一般为8%-15%，分子量越大选择浓度越低性，核酸样品需加入上样染料电压设置通常按照分子量、电荷和构型差异而移动分离核琼脂糖凝胶用于核酸分离，浓度

0.8%-2%之为80-120V蛋白或80-100V核酸，过高电压酸由于磷酸基团带负电，总是向正极移动；蛋间，DNA片段越小选择浓度越高电泳缓冲液会导致条带模糊或凝胶过热变形白质在SDS存在下也带负电荷，向正极移动需保持pH稳定，常用Tris-甘氨酸体系蛋白或移动速度与分子量成反比，分子量小的移动TAE/TBE体系核酸快常用实验仪器酶标仪工作原理应用领域操作流程酶标仪是利用光电比色原理检测样品在蛋白质检测中，可通过BCA法、使用前需预热20分钟，设置检测波长和特定波长下的吸光度或荧光强度，应用Bradford法等比色反应测定浓度酶活读板模式标准曲线实验需设置至少5个于ELISA、蛋白质定量、细胞增殖测定等性检测可通过底物颜色变化或荧光信号浓度梯度，每个浓度至少做3个复孔加实验其核心部件包括光源系统、波长增强来监测反应速率细胞增殖实验如样时避免气泡干扰，边缘孔易受温度影选择器、检测器和数据处理系统现代MTT、CCK-8等也依赖酶标仪测量细胞响，可只加缓冲液作为空白数据导出酶标仪通常具备多波长检测和动力学分代谢活性ELISA免疫分析是临床诊断和后通过专业软件分析，计算样品浓度或析功能科研的重要手段活性蛋白质提取实验概述样本准备根据蛋白来源（组织、细胞或体液）选择适当的起始量组织样本需快速冰冻并研磨成粉末状；贴壁细胞需胰酶消化收集或直接加裂解液；悬浮细胞需离心收集细胞沉淀所有操作应在冰上进行，防止蛋白降解裂解与匀浆选择适当的裂解缓冲液，如RIPA缓冲液用于总蛋白提取或NP-40缓冲液保留蛋白复合物裂解液中需添加蛋白酶抑制剂混合物，防止蛋白被降解使用超声破碎仪或组织匀浆器增强裂解效果，操作时避免产生气泡离心分离裂解物在4℃下高速离心12,000g，15分钟，分离可溶性蛋白和细胞碎片小心收集上清液，避免吸取沉淀如需提取膜蛋白或核蛋白，需使用差速离心和特殊缓冲液进行亚细胞分级提取纯化与储存根据实验需要可进行进一步纯化，如透析去除小分子杂质，亲和层析纯化特定蛋白最终样品分装成小份，添加10%甘油作为防冻剂，标记清楚后存放于-80℃冰箱避免反复冻融，影响蛋白活性蛋白定量法与法BCA Bradford蛋白电泳案例SDS-PAGE样品准备样品与上样缓冲液1:4混合，100℃加热5分钟凝胶制备分离胶8-15%和浓缩胶5%分步浇筑电泳分离80V浓缩胶，120V分离胶，持续约90分钟染色显影考马斯亮蓝染色或银染增强检测灵敏度SDS-PAGE是蛋白质研究的基础技术，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离变性的蛋白质SDS十二烷基硫酸钠是强阴离子表面活性剂，可使蛋白质变性并包裹，使其带负电荷，电泳迁移率主要由分子量决定β-巯基乙醇加入可打断蛋白质的二硫键，确保完全变性常见问题包括条带拖尾盐浓度过高、条带弥散蛋白过度降解、条带双重蛋白质未完全变性等解决方法为样品透析去除高浓度盐；添加足量蛋白酶抑制剂；确保充分加热变性电泳过程中若出现气泡，会导致条带不规则，应在加样前仔细检查并排除气泡蛋白质转印与免疫印迹转膜电泳后的蛋白质从凝胶转移到PVDF或硝酸纤维素膜上PVDF膜蛋白结合力强但背景高，需甲醇激活；硝酸纤维素膜背景低但易脆，适合小分子蛋白检测常用恒流转膜300mA，90分钟或半干转15V，30分钟封闭转膜后需用5%脱脂奶粉或BSA封闭非特异性结合位点封闭液的选择取决于抗体性质，若使用抗磷酸化抗体，应选择BSA而非奶粉含磷酸酶封闭时间通常为室温1小时或4℃过夜，时间过长可能降低特异性信号抗体孵育一抗识别目标蛋白，稀释比例通常在1:500-1:2000之间，根据抗体效价调整孵育时间为4℃过夜或室温2小时二抗通常是HRP标记的种属特异性抗体，稀释比例约1:5000，室温孵育1小时每步孵育后需TBST充分洗膜3-5次显影与分析采用化学发光底物ECL与HRP反应产生光信号，用化学发光成像仪捕获信号强度与蛋白质含量在一定范围内成正比，可通过图像分析软件进行半定量分析内参蛋白如β-actin、GAPDH用于校正上样量差异蛋白活性及动力学实验动力学曲线分析实验设计要点数据采集与处理米氏动力学曲线反映酶与底物浓度关系酶活性测定需控制pH值、温度、离子强度现代酶活性测定多采用微孔板格式，通过通过测定不同底物浓度下的反应速率，可等条件恒定实验设计应包括阳性与阴性酶标仪连续监测反应进程选择合适波长计算最大反应速率Vmax和米氏常数对照、不同底物浓度梯度和时间点采样检测底物消耗或产物生成，建立标准曲线KmKm值表示酶对底物的亲和力，值使用标准品校准可确保数据可靠性对于换算酶活单位数据分析使用专业软件如越小亲和力越高这些参数对于理解酶的未知样品，需进行预实验确定最佳酶量和GraphPad Prism，通过非线性回归拟合催化机制和设计酶抑制剂至关重要反应时间范围计算动力学参数核酸提取实验操作要点提取方法提取特点DNA RNA基因组DNA提取常用方法包括氯仿酚抽提法、柱纯化法和盐析法氯仿酚法回RNA提取关键是防止RNase污染，需使用DEPC处理的水和无RNase试剂收率高但有毒；柱纯化法操作简便但成本高；盐析法经济但纯度较低组织样Trizol法适用于多种样本类型，可同时提取总RNA、DNA和蛋白质磁珠法适本通常需蛋白酶K消化过夜，细胞样本可直接裂解提取后的DNA应存放于TE合自动化处理大量样本，而柱纯化法可获得高纯度RNARNA应存于-80℃，避缓冲液中，-20℃保存免反复冻融导致降解污染预防定性分析核酸提取中常见污染源包括蛋白质、有机溶剂和其他核酸使用硅胶膜柱可有核酸定性分析包括浓度测定、纯度评估和完整性检查浓度通过260nm吸光度效去除蛋白质；75%乙醇洗涤可去除残留盐和有机溶剂；DNase处理可去除测定，纯度通过260/280和260/230比值评估DNA完整性可用琼脂糖凝胶电RNA样品中的DNA污染操作中应使用无菌技术，避免交叉污染泳检查，RNA完整性通过28S/18S rRNA比例判断高质量DNA的260/280比值约

1.8，RNA约

2.0扩增与核酸分析PCR变性退火PCR第一步是DNA模板变性，通常在退火温度通常设定为引物Tm值低5℃左94-98℃进行30秒左右此温度下，双右，范围在50-65℃温度过低会导致链DNA解链为单链高GC含量模板可非特异性扩增，过高则引物无法有效结1能需要更高温度或添加DMSO等辅助试合引物设计应避免二级结构和引物二剂过长的变性时间会导致酶活性下聚体，引物长度一般为18-25个碱基，降，应避免不必要的延长GC含量40-60%产物分析延伸PCR产物常用琼脂糖凝胶电泳分析，通延伸阶段在72℃进行，适合Taq酶活过与分子量标准物比较判断大小DNA性延伸时间取决于产物长度，一般计与溴化乙锭或SYBR Green等染料结合算为1kb/分钟高保真酶如Pfu延伸后在紫外光下发出荧光对于需要进一速率较慢但错误率低，适合克隆实验步分析的产物，可进行胶回收纯化后用最终延伸通常设置72℃，5-10分钟，确于克隆或测序保所有产物完成合成实时定量基础PCR扩增曲线分析标准曲线法熔解曲线分析实时定量PCR扩增曲线分为底线期、指数使用已知浓度的梯度稀释样品建立标准曲熔解曲线用于评估PCR产物特异性，通过期、线性期和平台期Ct值阈值循环数线，通过样品Ct值确定未知样品浓度标温度梯度使双链DNA解链，监测荧光变是曲线与阈值线交点的横坐标，是定量计准曲线斜率反映扩增效率，理想斜率为-化单一尖锐峰表明产物特异性高；多峰算的基础低Ct值表示初始模板量高良

3.32100%效率R²值应大于

0.99，表明或宽峰表明有非特异扩增或引物二聚体好的扩增曲线应有明确的指数期和良好的数据点与拟合线的吻合度标准品应覆盖不同PCR产物因序列组成不同，熔解温度重复性样品可能的浓度范围Tm各异载体构建与分子克隆基本原理限制性内切酶消化选择合适的限制酶对载体和目的基因进行消化，产生互补的黏性末端酶切反应需控制酶量、反应时间和缓冲液条件双酶切时需考虑缓冲液兼容性，必要时进行序贯消化酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳验证并纯化连接反应使用T4DNA连接酶催化载体与插入片段的连接连接反应通常在16℃进行，时间为4小时或过夜载体与插入片段的摩尔比例通常为1:3至1:5，总DNA量保持在50-100ng粘性末端连接效率高于平末端连接转化与筛选连接产物转化入感受态细菌，通常使用热激法或电转化法转化后的细菌在含有抗生素的平板上筛选阳性克隆蓝白斑筛选、菌落PCR或限制性酶切分析用于确认插入片段的存在和方向重组鉴定DNA从阳性克隆中提取质粒DNA，通过限制性酶切和测序确认插入片段的正确性测序结果与目的基因序列比对，检查是否有突变或缺失确认无误后，可进行大量质粒提取，用于后续实验如表达或转染原核表达系统构建实验表达载体选择常用原核表达载体包括pET系列、pGEX系列和pMAL系列等pET系统使用T7启动子，表达水平高但可能形成包涵体；pGEX系统表达GST融合蛋白，有利于可溶性表达和亲和纯化；pMAL系统表达MBP融合蛋白，提高蛋白可溶性载体选择应考虑目标蛋白性质和实验目的宿主菌株筛选常用宿主菌株有BL21DE

3、Rosetta和Origami等BL21DE3缺乏主要蛋白酶，适合一般蛋白表达；Rosetta含稀有tRNA，适合表达含稀有密码子的蛋白；Origami提供氧化环境，有利于二硫键形成根据目标蛋白特性选择合适宿主菌株表达条件优化表达条件优化包括诱导剂浓度IPTG通常

0.1-1mM、诱导温度16-37℃、诱导时间2-20小时和培养基组成等低温表达16-25℃可减少包涵体形成但产量较低；高温表达37℃产量高但可溶性低需通过小规模实验确定最佳条件蛋白纯化策略根据表达蛋白的特性和标签选择纯化方法His标签蛋白可用镍柱亲和纯化；GST融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖柱纯化；MBP融合蛋白用淀粉柱纯化纯化后可根据需要用特异性蛋白酶切除标签最终产品纯度通过SDS-PAGE和质谱分析评估基因编辑与应用简介CRISPR设计sgRNA单向导RNAsgRNA设计是CRISPR实验成功的关键sgRNA需包含20个核苷酸的靶向序列和PAM序列NGG使用在线工具如CHOPCHOP、CRISPR Design预测脱靶效应并评分多设计几个sgRNA提高成功率，避免选择高GC含量或多重重复区域载体构建将设计的sgRNA克隆入表达载体，常用载体有px458可同时表达Cas9和GFP和lentiCRISPR用于慢病毒包装克隆验证通过测序确认sgRNA序列正确对于敲入实验，还需构建含同源臂的供体DNA作为修复模板细胞转染根据细胞类型选择合适转染方法，如脂质体转染、电转或病毒感染转染48小时后，可通过荧光标记如GFP检测转染效率对于难转染细胞，可考虑使用Cas9蛋白和体外转录的sgRNA形成核糖核蛋白复合物直接导入基因编辑验证编辑效率可通过T7E1酶切法或Surveyor法初步评估单克隆筛选后，通过PCR扩增目标区域并测序确认编辑精确性RT-qPCR和Western Blot用于检测基因表达变化表型分析根据具体基因功能设计相应实验验证编辑效果动物细胞培养基础培养基选择不同细胞系需要特定培养基DMEM适合多数贴壁细胞如HeLa、HEK293；RPMI-1640适合血液系统细胞如淋巴细胞、白血病细胞；F12常用于上皮细胞培养培养基需添加5-10%胎牛血清提供生长因子，1%青霉素-链霉素防止细菌污染特殊细胞可能需要添加额外生长因子或激素灭菌技术细胞培养要求严格的无菌操作所有器材必须经高压灭菌或购买无菌产品培养基通过

0.22μm过滤器过滤除菌操作前用75%酒精擦拭超净工作台，开紫外灯照射30分钟操作过程中保持气流方向从洁净区流向操作区，减少污染风险传代要点贴壁细胞传代使用胰蛋白酶-EDTA消化，消化时间通常为2-5分钟，观察细胞变圆并悬浮加入含血清培养基终止消化，离心收集细胞后按1:3至1:10比例接种悬浮细胞可直接稀释传代传代数记录格式为P+数字，原代细胞为P0，每次传代加1细胞冻存与复苏细胞冻存液含10%DMSO作为冷冻保护剂冻存步骤包括离心收集对数生长期细胞，重悬于冻存液，置于-80℃程序降温盒24小时后转入液氮复苏时，迅速在37℃水浴中解冻，加入预温培养基稀释DMSO，离心去除冻存液后接种培养细胞污染检测与处理污染检测方法定期显微观察是最基本的检测手段常见污染类型细菌、真菌、支原体和病毒污染预防措施严格无菌操作与定期消毒污染处理策略轻度污染可尝试抢救，严重污染应销毁细菌污染通常在24-48小时内可见，表现为培养基混浊、pH值迅速下降变黄和微小颗粒物真菌污染表现为可见菌丝或孢子结构，通常从培养皿边缘开始扩散支原体污染难以直接观察，但会导致细胞生长缓慢、形态改变，需用特异性染色如DAPI或Hoechst或PCR检测预防措施包括定期对培养室进行紫外灯照射消毒，保持超净工作台清洁，使用抗生素添加剂，避免使用过期试剂一旦发现污染，轻度污染可尝试使用高浓度抗生素处理，但通常建议销毁污染细胞，彻底清洁消毒培养环境后重新开始培养定期冻存低代次细胞是预防污染风险的有效策略细胞增殖与存活实验95%CCK-8准确率与传统MTT法相比更灵敏且重复性好小时4实验周期从开始到获得结果的典型时间450nm检测波长CCK-8产物最大吸收波长次6重复实验每种处理条件的推荐重复孔数CCK-8法是检测细胞增殖和细胞毒性的常用方法，其原理是四甲基偶氮唑盐WST-8在脱氢酶的作用下还原为橙色甲臭Formazan，颜色深浅与活细胞数量成正比与传统MTT法相比，CCK-8具有灵敏度高、操作简便、无需溶解步骤等优势实验设计应包括空白对照仅培养基、阴性对照未处理细胞和阳性对照已知效应处理进行药物筛选时，应设置浓度梯度通常5-7个浓度点，3-5倍稀释数据分析时，先减去空白对照背景值，然后计算相对于阴性对照的百分比半数抑制浓度IC50通过非线性回归计算，绘制剂量-效应曲线进行直观展示凋亡与细胞周期分析实验生物化学实验数据记录规范1原始数据记录要求2电子数据管理所有原始数据必须真实、完整记录，不得选择性记录或修改使用墨水电子数据应采用统一的文件命名规则，包含日期、实验编号和操作者信笔书写，错误数据划线注明而不删除每页记录应包含日期、实验题息建立分层文件夹结构，按项目-实验类型-日期组织原始数据文件目、操作者姓名和页码实验条件、材料来源、仪器型号等关键信息必必须保持不变，分析后的文件另存为新版本重要数据需多重备份，包须详细记载，确保实验可重复性括本地硬盘、服务器和云存储等3图片与影像资料管理4实验记录审核与归档电泳、Western blot等图片应保存原始图像文件，禁止过度调整对比实验记录需由项目负责人或导师定期审核，确认内容完整准确并签字确度或选择性展示显微镜图像应包含比例尺和采集参数所有图片必须认完成的实验记录本按规定保存，通常需保存至少5年电子数据归有清晰的标注说明样本信息、实验条件和拍摄日期图片文件采用无损档时需制作索引，方便日后查阅南方医科大学实验中心配备专业数据格式如TIFF存储，以防信息丢失管理员，协助实验数据的规范管理和长期保存数据分析与统计方法选用选择合适的统计方法是实验数据分析的关键两组正态分布数据比较使用t检验；多组数据比较使用单因素方差分析ANOVA和事后检验如Tukey或Bonferroni；非正态分布数据使用非参数检验如Mann-Whitney或Kruskal-Wallis统计显著性通常以p

0.05为标准，多重比较时应考虑校正显著性水平数据可视化应选择能最清晰传达结果的图表形式连续变量间关系用散点图和回归线；分组比较用柱状图或箱线图；时间序列数据用折线图；组成比例用饼图或堆叠柱状图图表制作应遵循学术规范，包括坐标轴标签、单位、图例和误差线南方医科大学推荐使用GraphPad Prism、SPSS或R语言进行数据分析和图表绘制常见实验误差类型与分析系统误差偶然误差系统误差是由仪器校准不准、试剂质量问题或操作方法缺陷导致偶然误差是由不可控因素如环境波动、操作细微差异或样品不均的一致性偏差表现为测量结果总是偏高或偏低例如，分光光一性导致的随机波动表现为重复测量结果的离散性例如，细度计波长校准不准确会导致所有吸光度读数系统性偏移；移液器胞计数中的随机波动；PCR扩增效率的微小差异；蛋白质提取过校准不准确会导致体积系统性偏差程中的样品差异系统误差纠正策略定期校准仪器；使用标准品进行校正；建立偶然误差控制策略增加重复实验次数；控制实验条件一致性；标准曲线修正；使用内参校正；多种方法交叉验证结果使用自动化设备减少人为差异；计算标准差和误差范围；使用统计学方法评估数据可靠性；异常值检测与处理案例分析蛋白提取及鉴定样本处理该案例使用小鼠肝脏组织进行膜蛋白提取组织在液氮中研磨成粉末状，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液匀浆常见问题是组织解冻后再研磨，导致蛋白质降解改进建议是确保组织始终处于冰冻状态，使用预冷研钵膜蛋白分离采用差速离心分离膜蛋白，先700g离心去除核碎片，上清液12,000g离心获得线粒体，100,000g超速离心沉淀为膜组分问题出现在超速离心步骤，膜蛋白回收率低改进方法是优化缓冲液组成，添加非离子表面活性剂提高膜蛋白溶解度电泳与转膜蛋白样品经SDS-PAGE分离后转印至PVDF膜学生遇到的问题是高分子量蛋白150kDa转膜效率低改进建议包括延长转膜时间；降低丙烯酰胺浓度至8%；使用梯度胶；添加

0.1%SDS到转膜缓冲液中提高大分子蛋白转移效率蛋白鉴定目标膜蛋白通过质谱分析鉴定学生面临的问题是鉴定到的膜蛋白数量少于预期改进措施包括优化样品消化条件；使用多种蛋白酶联合消化；采用亲水亲油相互作用色谱HILIC预分离；调整质谱仪参数提高膜蛋白肽段检测灵敏度案例分析核酸定量与分析

1.95RNA纯度260/280提取RNA的平均纯度值42%GC含量目标基因的GC百分比

99.6%引物特异性BLAST比对的特异性评分

1.92相对表达倍数处理组相对于对照组的表达变化本案例研究小鼠肝脏在不同药物处理条件下细胞色素P450酶基因表达变化RNA提取采用Trizol法，但学生遇到了RNA产量低且部分样本降解的问题分析发现，组织保存不当反复冻融和均质化不充分是主要原因改进措施包括使用RNA Later溶液保存组织；优化匀浆参数；缩短室温操作时间RT-qPCR分析中出现的异常数据主要源于引物设计和内参基因选择不当目标基因GC含量较高42%，常规PCR条件下扩增效率低数据分析采用2^-ΔΔCt法，但未验证扩增效率，导致结果偏差改进建议包括添加DMSO提高GC富集区域扩增效率；使用多个内参基因如GAPDH、β-actin和18S rRNA进行标准化；利用标准曲线法确定实际扩增效率并修正计算方法案例分析细胞功能实验增殖实验迁移侵袭实验周期分析/本案例研究miRNA对乳腺癌细胞MCF-7增殖的使用Transwell小室评估miRNA对细胞迁移和流式细胞术分析miRNA对细胞周期的影响学影响实验设计包括阴性对照、miRNA模拟物侵袭能力的影响结果显示数据变异大，且基生数据中G2/M期细胞比例异常高，与预期结转染和抑制剂转染三组学生在实验中遇到的底膜基质胶涂层不均匀导致结果不可靠改进果不符问题源自细胞固定不充分和PI染色条主要问题是各组间差异不显著，且重复性差方法包括使用预包被的Transwell小室确保件不优建议改进延长70%乙醇固定时间至分析发现细胞接种密度不一致和转染效率低是基质胶均匀性；严格控制细胞数量；优化孵育少4小时；加入适量RNase A消化RNA；调整关键因素建议改进措施使用细胞计数器确时间；采用整张膜成像并使用图像分析软件进PI终浓度至50μg/ml；确保细胞充分分散，避保接种密度一致；优化转染条件；延长观察时行客观计数，避免主观选择视野免聚集导致假信号间至5-7天典型实验事故及案例剖析化学品灼伤事故生物污染扩散事件案例一名学生在配制浓盐酸溶液时，未佩戴防护眼镜，溅出的酸液导致眼部案例细胞培养室发生支原体大面积污染，导致多个实验项目数据作废原因灼伤原因分析个人防护不到位；违反加酸入水原则；操作不慎且动作过分析新引入的细胞株未经检测；实验人员操作不规范；超净台使用后未充分快处理措施立即用洗眼器冲洗15分钟以上；送医院眼科治疗；事后加强安消毒改进措施建立新细胞引入检疫制度；定期对所有细胞系进行支原体检全教育，强化操作规程培训测；加强无菌操作培训；增加环境监测频率仪器设备损坏事件数据丢失事故案例离心机在高速运行中出现剧烈震动并损坏转子原因分析样品管未平案例一名研究生三个月实验数据因电脑故障全部丢失原因分析未进行数衡放置；转子固定不牢；超过最大转速限制处理方法立即切断电源；报告据备份；缺乏数据管理意识；依赖单一存储设备改进措施建立3-2-1备份策设备管理员；检查仪器损伤程度；重新培训操作人员；建立离心前检查清单制略3个备份，2种介质，1个异地存储；定期备份实验数据；使用云存储和实验度室服务器双重保障；培训数据管理最佳实践实验室团队协作与分工角色分工模式任务分配原则南方医科大学生物化学实验室采用专业分任务分配遵循专长匹配、梯度挑战原则工、协作完成的团队模式典型团队包括项根据团队成员专业背景和技能水平分配任目负责人指导实验方向、技术骨干负责关务，既发挥个人优势，又提供发展空间复键技术、研究生执行具体实验和技术员负杂实验拆分为多个模块，由不同成员负责，责仪器维护和试剂准备大型项目还会设立通过接力方式完成关键步骤采用双人操数据分析专员和质量控制员作、交叉验证机制确保准确性成果共享机制沟通机制建立公平的成果共享机制，根据贡献度确定实验室建立多层次沟通机制日常沟通通过作者顺序实验室内部建立技术方法库和数实验记录交接和工作群即时交流；定期沟通据共享平台，促进知识传承定期组织技术包括周例会回顾进展、解决问题和月度研沙龙，由掌握特定技术的成员培训其他人讨会分享技术、讨论方向；项目节点沟通员发表论文或申请专利时，明确知识产权包括里程碑评审和阶段性总结会议鼓励开归属，保障团队成员的学术权益放式交流，及时反馈实验中的问题与发现科研诚信与学术规范诚信是科研的基石真实记录、客观分析、公正发表学术不端行为的危害2损害科学信誉、浪费资源、误导后续研究数据管理规范完整保存原始数据、详细记录实验过程合作与署名规范贡献决定署名顺序、明确作者责任引文与知识产权准确引用、尊重他人成果、保护原创课程考核与成绩构成常见疑难问题解答仪器损坏处理样品污染处理实验结果异常发现仪器异常或损坏，应立即停止使细胞培养发现污染，首先隔离受污染实验结果与预期差异大时，首先检查用并报告实验室管理员填写《仪器样品，防止扩散记录污染特征、可实验操作是否规范，试剂是否有效故障报告单》，详细描述故障现象和能来源和污染范围轻度污染可尝试重复实验确认结果可重现性分析可可能原因小型故障可由技术员现场抗生素处理，严重污染应销毁并彻底能原因是否有干扰因素、对照设置维修，大型故障联系厂家专业人员处消毒工作区检查并改进操作流程，是否合理、仪器是否校准咨询指导理因操作不当导致损坏需承担相应必要时对相关人员进行再培训所有教师或有经验的同学记住，意外结责任，严重违规操作将影响课程成污染事件必须如实记录在实验室污染果有时也是重要发现的开始，保持开绩事件登记簿中放思维分析原因实验时间管理生物化学实验往往需要连续数小时甚至数天，合理安排时间至关重要制定详细实验计划，标注关键时间点对于需要过夜的步骤，可与同组成员轮流值守长时间实验应合理安排休息，避免疲劳导致操作失误如遇特殊情况无法完成实验，及时与指导教师沟通，协商调整方案课外拓展实验推荐分子诊断新方法推荐学习数字PCR和等温扩增技术数字PCR具有绝对定量能力，对微量样本和稀有突变检测灵敏度高；等温扩增如LAMP、RPA操作简便，适合现场快速检测这些技术在临床诊断、食品安全和环境监测领域应用广泛南方医科大学分子诊断中心每学期为优秀学生提供实习机会蛋白质组学技术推荐学习蛋白质组学样本前处理和质谱分析基础重点掌握蛋白质提取、酶解、肽段富集和分离技术了解常见蛋白质组学数据分析流程，如蛋白质鉴定、定量和修饰位点分析学校蛋白质科学中心定期举办蛋白质组学培训班，感兴趣的同学可关注公告报名生物信息学应用推荐学习基因组数据分析和R语言统计分析了解高通量测序数据处理流程，掌握生物信息学基本工具使用方法学习Linux基础命令和生物信息学常用软件计算生物学系每周三下午开设生物信息学沙龙，欢迎对计算分析感兴趣的同学参加实验课网站提供生物信息学入门学习资料细胞三维培养推荐学习类器官培养和细胞微流控芯片技术类器官培养模拟体内微环境，更接近生理状态；微流控技术可实现细胞精确操控和动态分析这些技术在药物筛选、疾病模型和再生医学领域具有广阔前景再生医学实验室每年暑期招收本科生参与类器官相关科研项目实验室开放与资源共享资源查询通过南方医科大学科研共享平台http://share.smu.edu.cn查询可用仪器设备、技术平台和服务项目平台提供详细的仪器信息、使用条件、收费标准和预约状态生物化学实验中心每月更新可开放使用的时段和设备清单在线预约使用校园网账号登录预约系统，选择所需资源和时间段部分高端设备需提交使用申请表，说明实验目的和样品情况预约成功后系统自动生成预约码，作为入室和使用设备的凭证特殊仪器可能需要技术员辅助操作，预约时注明入室使用首次使用前需参加实验室安全培训并通过考核使用时携带学生证和预约凭证，刷卡进入实验区严格遵守实验室规章制度和操作规程使用结束后，清理工作区，填写使用记录，由值班人员检查确认后方可离开技术交流实验中心定期举办技术论坛，邀请专业技术人员分享实验技巧和前沿方法鼓励不同课题组间的技术交流与合作，解决共性技术难题平台设有在线讨论区，可提出技术咨询或分享经验，促进校内科研资源的高效利用前沿技术发展展望高通量测序技术第三代测序技术如纳米孔测序、单分子实时测序正快速发展，实现了单分子水平的长片段测序，特别适合复杂基因组和转录组分析这些技术突破了传统二代测序的长度限制，可检测RNA修饰和复杂结构变异南方医科大学基因组中心已引进PacBio Sequel和Oxford Nanopore平台，支持前沿测序应用单细胞组学技术单细胞测序技术实现了对异质性细胞群体的精细解析，揭示了传统混池测序无法发现的细胞亚群和状态变化单细胞多组学集成分析如scRNA-seq、scATAC-seq联合分析可同时获取基因表达、染色质可及性等多维信息，绘制细胞命运图谱，为精准医疗和发育生物学研究提供新工具空间组学与活体成像空间转录组学技术保留了组织空间信息，将分子数据与形态学特征关联，揭示复杂组织微环境中的细胞相互作用先进活体成像技术如光片显微镜、超分辨率显微镜突破了传统显微成像的分辨率限制，实现了分子水平的动态观察，为生命过程研究提供了时空四维视角参考文献与推荐书目核心教材《南方医科大学生物化学实验教程》主编王明道，南方医科大学出版社，2022年；《分子克隆实验指南》作者Sambrook JRussell DW，科学出版社中文版，2019年；《细胞生物学实验方法》作者张志谦，高等教育出版社，2020年拓展阅读《生物信息学基础》主编李霞，科学出版社，2021年；《蛋白质组学技术平台与应用》主编钱小红，化学工业出版社，2020年；《实验设计与数据分析》作者刘新泳，高等教育出版社，2019年；《科研论文写作指南》作者张月红，北京大学出版社，2018年推荐期刊《自然·方法学》、《科学·信号转导》、《细胞·方法》等方法学专业期刊实验课程学习方法与建议充分预习提前理解实验原理和流程主动思考提出问题并寻求解决方案详细记录3完整准确记录实验过程和数据及时复盘分析问题并总结经验教训实验课学习与理论课有显著不同，需要更多的动手能力和实践智慧充分预习是成功的基础，建议实验前至少花30分钟阅读实验指导书，理解实验原理和步骤，预想可能遇到的问题做好预习笔记，标注关键步骤和注意事项，实验时带在身边随时参考实验过程中保持专注和观察力，对异常现象保持敏感不要机械操作，要思考每一步的目的和原理遇到问题先独立思考，尝试解决，必要时再请教老师实验后及时整理数据，反思操作中的不足，总结经验教训定期与同学交流实验心得，互相学习培养终身学习的态度，主动了解相关领域的最新进展，拓展知识视野总结与展望基础引领创新思维方法培养生物化学实验技术是现代生命科学研究的除了技术训练，本课程更注重培养科学思基石扎实的实验基本功是科研创新的前维方法通过实验设计、数据分析和问题提本课程通过系统培训基础技能，为学解决，锻炼学生的逻辑思维和创新思维能1生未来深入研究奠定坚实基础实验教学力这种能力培养使学生能适应未来科研注重培养严谨科学态度和标准操作规范，和医学实践中的复杂挑战，驾驭不断更新这些都是科学研究的必要素质的技术和方法未来职业发展团队协作精神生物化学实验技能在医学研究、药物开现代科研越来越依赖多学科合作实验课发、临床诊断和健康产业等多个领域都有程通过小组实验和项目讨论，培养学生的广泛应用课程结束不是终点，而是科学团队合作意识和沟通能力了解如何有效探索旅程的开始希望同学们保持好奇心分工协作，共同完成复杂任务，这将是未和学习热情，不断探索生命科学的奥秘，来工作中的宝贵财富为人类健康事业做出贡献。