《微生物分离与鉴定》课件

微生物分离与鉴定鉴术杂微生物分离与定是微生物学研究的核心技，是从复的天然微生物群落中获纯净课将绍得菌株并确定其分类地位的重要手段本程系统介微生物分离的验术鉴环标基本原理、实技和定方法，帮助学生掌握从境样品中分离目微生物的技能学习目标1掌握微生物分离技术练释线术环熟运用稀涂布法、划法、倒平板法等经典分离技，能够从不同境标样品中成功分离目微生物2理解鉴定方法原理态观测鉴深入理解形学察、生理生化定和分子生物学定的基本原理，掌握各鉴术围种定技的适用范和局限性3培养实验操作能力过验训练养严锐观通系统的实，培格的无菌操作技能和敏的察分析能力，能独鉴验够立完成微生物分离定实建立科学思维方法课件结构基础理论微生物定义、分类与分布特点分离纯化术各种分离方法的原理与操作技培养与观察养态观培基配制与菌落形察鉴定方法态鉴术形学、生化和分子定技典型案例分析鉴实际分离定案例的深入解析微生物的定义与分类微生物主要类型分类依据结简单细细结态谢微生物是指那些个体微小、构的生物类群，主要包括微生物的分类主要基于胞构特征、形特性、生理代特点这虽遗传维传态菌、古菌、真菌、酵母、病毒和原生动物等些微生物然个和特征等多个度统分类方法主要依据形学和生理生数庞对态质现则术别体微小，但在自然界中分布广泛，量大，生系统的物化特性，而代分类学更多地依靠分子生物学技，特是环关为循和能量流动起着至重要的作用16S rRNA基因序列分析，微生物的准确分类提供了更可靠的依据微生物在自然界的分布土壤环境水体环境土壤是微生物最丰富的栖息地，每克土壤中淡水和海水中都存在大量微生物，海洋微生数细对环产含有十亿个微生物，包括菌、真菌、放物全球碳循和氧气生具有重要意义线菌等多种类型宿主相关环境大气环境内杂状态人体和动植物体外都有复的微生物群空气中的微生物主要以孢子和休眠存这关过传区落，些微生物与宿主形成共生系在，通风力播到各个地微生物分离的意义科研基础工业应用许产过赖微生物分离是深入研究微生物生理多工业生程都依于特定的谢遗传产特性、代机制和特征的前提微生物菌株，如抗生素生、酶制获纯净剂过条件只有得的菌株，才能制备、发酵食品加工等通分现筛选准确研究其生物学特性，发新的离和具有特殊功能的微生物，质为术产生物活性物，揭示微生物的生命可以生物技业提供优良的生规纯养术为产律培技的建立微生物菌株，推动生物制造业的发展础学的发展奠定了重要基医学诊断临鉴诊断疗床微生物学中，病原微生物的分离定是疾病和治的重要依据准鉴仅时诊断还为确快速地分离和定致病菌，不有助于疾病的及，能合理用药对提供科学依据，保障人类健康具有重要意义分离与纯化的重要性获得纯净菌株对单确保研究象的一性和可重复性深入研究基础为续后的生理生化和分子生物学研究提供材料实际应用需求产诊断工业生和医学的必要前提条件环须将杂来在自然境中，微生物通常以混合群落的形式存在，要深入研究某一特定微生物的特性，必其从复的微生物群落中分离出，获纯净单纯过仅术严质标没得的一菌株化程不要求技的精确性，更需要格的量控制，确保分离得到的菌株确实是目微生物，有其他杂菌的污染培养基基础知识合成培养基组标成分明确，成已知，适用于特定研究需求，便于准化和重复验实天然培养基杂营养数含有复的天然成分，丰富，适合大多微生物的生长繁殖选择性培养基进标选择添加特殊成分抑制某些微生物生长，促目微生物的性分离鉴别培养基过颜应区通色变化或其他指示反，帮助分不同类型的微生物培养基的灭菌处理高压蒸汽灭菌养灭过压杀最常用的培基菌方法，通121°C、15分钟的高温高处理，能够有效这灭简死所有微生物包括芽孢种方法具有菌彻底、操作便、成本低廉的优验标灭时压点，是实室准的菌程序操作需要注意力和温度的准确控制，确保灭菌效果化学消毒处理对热养过滤灭剂于敏感的培基成分，可以采用菌或化学消毒处理常用的剂这试剂杀灭细化学消毒包括75%乙醇、

0.1%升汞溶液等，些能够有效菌对杀灭时严浓时和真菌，但芽孢的效果有限使用需要格控制度和作用间质量控制检验灭养进检验过对验验证灭菌后的培基需要行无菌，通无菌照实菌效果检验养养观测试过检方法包括培基直接培察、指示菌株等只有通无菌验养验验结的培基才能用于微生物分离实，确保实果的可靠性和准确性培养基对微生物的选择作用营养选择环境条件选择抑制剂选择对营养渗压浓养不同微生物成分的需pH值、透、氧气度等在培基中添加特定的抑制过调养环对剂求差异很大，通整培境因子微生物生长有重，如抗生素、染料或化学过调节这试剂选择基中碳源、氮源和微量元素要影响，通些条件，可以性地抑制敏浓选择现对的种类和度，可以性可以实特定微生物类群感菌群的生长，从而分离出进选择养标地促某些微生物的生长，的性培具有特殊抗性的目微生物时同抑制其他微生物的繁殖功能性选择计养设含有特殊底物的培基，应只有具备相酶活性的微生这物才能利用些底物生长，现实基于功能特性的微生物筛选和分离微生物分离的常用方法总览稀释涂布法过释单细通系列稀降低微生物密度，然后涂布到琼脂平板表面，使个胞分散生长独这别形成立菌落是最常用的分离方法，特适用于液体样品的微生物分离划线法环进连续线过释应渐使用接种在琼脂平板表面行划，通稀效使微生物逐分散，最终获单简验础术得个菌落操作便快速，是实室最基的分离技倒平板法将释热养养内稀后的样品与温的琼脂培基混合后倒入平板，微生物在培基部和表时计数厌面同生长适合和分离氧或微好氧微生物富集培养技术选择养养标使用性培基在特定条件下培，使目微生物大量增殖，提高其在混合群续纯落中的比例，便于后分离化操作平板稀释涂布法样品稀释涂布操作将进释释原始样品行10倍系列稀，通常稀取适量稀液滴加到琼脂平板表面，用释释匀细到10^-4到10^-8倍，确保在某个稀涂布棒均涂布，使微生物胞在平板获单匀度下能够得适量的个菌落表面均分布培养观察验证纯化养时观对进显镜检在适宜温度下培24-48小，察菌挑取的菌落行微查和重新划态态单线养认获纯养落形特征，挑取形不同的个菌落培，确得的是培物进纯行化平板划线法接种环准备灭环使用火焰菌的接种蘸取少量样品第一次划线约区进线在平板1/4域行密集划接种连续稀释划线灭环区开线区重新菌接种，从前一域末端始划到新域获得单菌落过释线获单经3-4次稀划后可得分离的个菌落线关键线线须灭环线术区渐释划法操作的在于掌握划的密度和角度，每次划前必重新菌接种，避免交叉污染正确的划技能够使微生物从高密度域逐稀到区终区获单这简单验术低密度域，最在平板的最后域得分离良好的个菌落种方法快速，是微生物实室日常工作中最常用的分离技倒平板法操作原理适用范围与优势将释养别厌为养内倒平板法是稀后的样品与45-50°C的液体琼脂培基混合，倒平板法特适用于氧菌和微好氧菌的分离，因培基部细养内浓较时这计数然后倒入无菌平板中凝固微生物胞被包埋在琼脂培基的氧气度低同，种方法也常用于微生物的定量，养养内这为细部，培后形成的菌落有些在表面，有些在培基部种方因所有的微生物胞都能形成可见的菌落与表面涂布法相维别对显杂法能够提供微生物生长的三空间，特适合氧气敏感的微生比，倒平板法能够分离更多种类的微生物，但操作稍复，需养物分离要注意培基温度的控制振荡培养与静置培养150rpm标准振荡速度数细荡养转大多好氧菌的最适振培速37°C培养温度数人体病原菌和大多中温菌的最适生长温度24-48h培养时间数细对数时围大多菌达到生长期的间范pH

7.0最适pH值数环大多中性微生物的最适生长pH境荡养过搅养进别养养静养则厌振培通机械拌增加培液中的溶氧量，促好氧微生物的快速增殖，特适合用于富集培和液体培置培适合氧菌、对选择养时标验来时结微好氧菌和一些机械震动敏感的微生物培方式需要根据目微生物的生理特性和实目的决定，有需要两种方式合使用获以得最佳的分离效果微生物的富集培养选择性环境创标环造有利于目菌生长的特殊境条件优势增殖标为势目微生物大量繁殖成优菌群竞争排斥标缓非目微生物受到抑制或生长慢分离成功标纯提高目菌的分离成功率和度养过标创富集培是微生物分离中的重要策略，通模拟目微生物的天然生境条件，或造有利选择环标势这别于其生长的性境，使目微生物在混合群落中占据优地位种方法特适用于环数较缓细细分离那些在境中量少或生长慢的微生物，如固氮菌、硫化菌等功能性微生养关键标态物富集培的成功在于准确了解目微生物的生理生特征微生物的纯培养技术菌落观察选择细观态选择态缘仔察平板上的菌落形，形典型、边清晰、大小适中的单为对个菌落作挑取象无菌挑取操作灭针选单围使用火焰菌的接种小心挑取定的个菌落，避免触及周的其养他菌落或培基重新划线培养将养进线养获单挑取的菌落接种到新的培基上行划培，得更多的个菌落重复纯化验证过过显镜检验证获态重复上述程2-3次，并通微查得的菌株形一致纯养性，确保培的建立典型分离实验肠道致病菌样品前处理鉴别培养基应用生化鉴定验证肠检测对进鉴道样品通常含有大量正常菌群，需使用血琼脂平板溶血性，EMB琼可疑致病菌行系统的生化定，选择养凯鉴别肠泽试验试验要使用性培基如麦康琼脂、脂大杆菌的金属光，沙门氏包括氧化酶、糖发酵、吲哚赖盐这贺区试验别试验组对肠木糖氨酸脱氧胆酸琼脂等，些菌-志氏菌琼脂分病原菌和非病原等特是IMViC于杆养盐这养过颜细鉴培基含有胆和染料，能够抑制革菌些培基通色变化和特殊菌科菌的定具有重要意义，能够兰选择肠应鉴别区肠贺氏阳性菌的生长，性分离杆反帮助初步不同类型的致病准确分大杆菌、沙门氏菌、志细肠菌科菌菌氏菌等主要道致病菌典型分离实验土壤分解菌土壤采样富集培养选择养进富含有机物的土壤样品，避免污使用含有特定底物的培基行富集，术层养细维染，采用无菌技收集表5-10cm深如尿素培基分离解尿素菌，纤素养维度的土壤培基分离纤素分解菌功能验证稀释分离过测验验证将养进释通酶活性定和底物降解实分富集培物行系列稀，涂布到固养获单离菌株的分解能力体培基上，分离得个菌落态这时计应养养细土壤中的分解菌种类繁多，具有重要的生功能分离类微生物需要根据其功能特性设相的培基和培条件解尿素菌红剂养产养红剂为红的分离通常使用含有尿素和酚指示的培基，阳性菌株能够分解尿素生氨，使培基pH升高，酚指示变色空气和水体微生物分离空气采样技术水体采样方法样品处理技术击选择过滤过滤浓缩使用沉降法或撞式采样器收根据水体类型采样策略，水样通膜微生简层层将滤养集空气中的微生物沉降法表水直接采样，深水需要物，然后膜放置在培基单将专养对颗易行，平板暴露在空气中用采样器海水样品需要考上培于含有粒物的水时击虑盐进当一定间；撞式采样器能够度影响，污水样品需要适样，需要先行适的分散处过将当释应匀定量采集，通气流微生物稀采样后立即处理或理，确保微生物能够均分布击养撞到培基表面在4°C条件下保存常见分离难点为空气中微生物密度低且多孢状态养时子，需要延长培间杂竞水体中的微生物种类复，选择养争激烈，需要使用性培基海洋微生物通常需要特殊盐浓养的度和培条件微生物分离中的无菌操作火焰灭菌标灭接种工具的准菌方法工作台消毒验环实前后彻底清洁工作境个人防护佩戴手套、口罩等防护用品无菌环境净内在超工作台或生物安全柜操作操作规范严执骤格按照无菌操作程序行每个步关键环节导验结员须过训练练术养无菌操作是微生物分离成功的保障任何一个的疏忽都可能致污染，影响实果的准确性操作人必经系统，熟掌握各种无菌技，成良好的验习惯验过时觉为实实程中要刻保持警，避免任何可能引起污染的行菌种的初步观察肉眼观察记录状颜质观菌落的大小、形、色、地等宏特征测量记录标测径缘纹使用尺量菌落直，描述边特征和表面理拍照记录摄态档拍清晰的菌落照片，建立形学案显微镜初检4湿简单进显镜观制备片或染色片行微察态观鉴观鉴养产态这菌落形学察是微生物定的第一步，也是最直的定方法不同微生物在相同培基上生的菌落具有特征性的形特征，些特征包括大状颜质缘状详细记录这对续鉴小、形、色、透明度、地、边形等些特征于后的定工作具有重要参考价值培养过程中菌落特征颜色特征形态与质地透明度与光泽颜鉴别绿脓缘为状锯菌落色是重要的特征，如杆菌落的边可分整齐、波、齿菌落的透明度包括透明、半透明、不透产绿状丝状为泽泽菌生色色素，金黄色葡萄球菌呈金、等类型；表面可分光滑、粗明等类型；光特征包括有光、无光肠为皱圆质为湿泽泽肠养黄色，大杆菌通常灰白色色素的糙、褶、同心等；地可分、金属光等大杆菌在EMB培产细谢关润这现泽这鉴别生与菌的代特性密切相，某些、干燥、黏稠、脆嫩等些特征反基上呈特征性的金属光，是细产观细习细结肠观时菌只在特定条件下生色素，因此映了菌的生长性和胞壁构特大杆菌的重要特征之一察需要时养态鉴当进察需要注意培条件的影响点，是形学定的重要依据在适的光照条件下行染色与镜检样品制备细为制备菌涂片，风干后用火焰固定，染色做准备革兰氏染色结剂严时依次使用晶紫、碘液、脱色、沙黄，格控制每步间镜检观察显镜观细态应在1000倍微下察菌形和染色反结果判读记录细兰应态菌的革氏反、形、大小和排列方式兰细础细结将细为兰革氏染色是菌分类的基方法，根据胞壁构差异菌分革氏阳性菌（紫兰阴红这简单结稳临诊断色）和革氏性菌（色）种染色方法操作，果定，是床微生物学质观结严时试剂浓的重要工具染色量直接影响察果，需要格控制染色间和度细胞形态学鉴定指标杆菌螺旋菌细状细状胞呈杆，长短比例不同，胞呈螺旋或弧形，具有特弯肠结乱可直立或曲，如大杆菌、征性的螺旋构，如霍弧球菌分枝菌枯草芽孢杆菌菌、螺旋体细椭圆单结细细胞呈球形或形，个存具有分枝构的长胞，如对链状状线态杂在或成、、群集排放菌、分枝杆菌，形复链列，如葡萄球菌、球菌多样微生物生理生化鉴定代谢产物检测过检测养产谢产来鉴谢产通微生物在特定培基中生的代物定菌种常见的代物检测产鉴别包括有机酸、气体、色素、抗生素等例如，乳酸的生可以乳酸杆检测氢产鉴别肠细这检测菌，硫化的生可以某些杆菌科菌些通常使用化学指剂谱术示或色分析技酶活性测定过检测进鉴不同微生物具有不同的酶系统，通特异性酶的活性可以行准确测试过氢定常用的酶活性包括氧化酶、氧化酶、脲酶、β-半乳糖苷酶这细简结稳等些酶的存在与否是菌分类的重要依据，操作便快速，果定可靠营养需求分析过对营养进鉴试通分析微生物不同成分的需求特性行定包括碳源利用验试验维试验细、氮源利用、生素需求等某些菌只能利用特定的碳源这选择鉴营养或氮源，种性利用能力是定的重要特征需求分析有助于态习了解微生物的生理特性和生性常见生化鉴定实验糖发酵实验检测细对产菌不同糖类的发酵能力，包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇等发酵酸使剂产细谱鉴指示变色，气在倒管中形成气泡不同菌的糖发酵具有特征性，是定的重要依据氨基酸分解实验测细产产氢定菌分解特定氨基酸的能力，如色氨酸分解生吲哚，蛋氨酸分解生硫化这验过显应来检测结些实通特异性底物和色反，果明确可靠柠檬酸盐利用试验检测细柠盐为养蓝菌能否以檬酸作唯一碳源生长，阳性菌株使培基pH升高，溴百里酚剂绿为蓝这肠细鉴试验指示从色变色是杆菌科菌定的经典之一运动性观察过悬养观细细通滴法或半固体培基察菌的运动能力有鞭毛的菌具有主动运动能力，显镜观显这态在微下可察到明的游泳运动，是重要的形学和生理学特征氧化酶、过氧化氢酶试验氧化酶试验过氧化氢酶试验试验检测细细这过氢过氢产这细氧化酶用于菌是否含有胞色素氧化酶，种酶参与氧化酶能够分解氧化生氧气和水，是菌抵抗氧化细链传过试验试纸试剂应试验简单过氢菌的呼吸电子递程使用氧化酶或，阳性激的重要机制快速，在菌落上滴加3%氧化溶应数内现绿单应肠产数反在秒出紫色铜假胞菌呈强阳性反，而杆菌液，阳性菌株立即生气泡葡萄球菌和大多需氧菌呈阳性，细为阴这区这细标链厌阴应科菌均性，是分两大类菌的重要指而球菌和氧菌呈性反试验组IMViC1吲哚试验I检测产试剂检色氨酸酶活性，阳性菌能分解色氨酸生吲哚，用Kovac测红环状应呈色反甲基红试验M检测产混合酸发酵能力，阳性菌生大量有机酸使pH降至

4.4以下，甲红剂红基指示呈色VP试验V检测径产氢2,3-丁二醇发酵途，阳性菌生乙酰甲基甲醇，与α-萘酚和钾应红氧化反呈色柠檬酸盐试验C检测柠盐为蓝养以檬酸唯一碳源的生长能力，阳性菌使溴百里酚培基绿为蓝由色变色微生物分子生物学鉴定测序原理核酸探针技术16S rDNA细针16S核糖体RNA基因在所有菌利用特异性DNA或RNA探与目区标杂现中都存在，包含保守和可变微生物的核酸序列交，实区区计鉴针标记保守用于设通用引物，快速准确的定探可以区关荧过可变序列差异反映系统发育光、酶或放射性同位素，通过扩测检测断标系通PCR增和序分析，信号强度判目微生物的鉴细数这可以准确定菌到种的水平，存在和量种方法特异性现细标是代菌分类学的金准强，灵敏度高扩增应用PCR链应过扩标结聚合酶式反通特异性引物增目基因片段，合电泳分析或实时荧检测鉴术时检测光，可以快速定微生物多重PCR技能够同多种病检测临诊断应原菌，大大提高了效率和准确性，在床中用广泛生物化学快速鉴定系统API鉴定条VITEK全自动系统数据库支持将试验现鉴API系统多个生化集成VITEK系统采用微量滴定板代定系统都配备强大的术数库数在一个塑料条上，每个小室技，自动化程度高系统据，包含千种微生物试剂鉴质应过含有脱水的生化接种包含定卡、药敏卡和控的生化反模式系统通细悬养颜时内识别较测试结菌液后培，根据色菌株，能够在4-8小完成模式算法比果读结过数编细鉴试验数库给变化判果，通值菌定和药敏，大幅与据模式，出可能的码数库查找据确定菌种身份提高了工作效率菌种及其可信度快速高效特点鉴将传数快速定系统统需要鉴过缩时天的定程短到几小，标为准化程度高，减少了人误别临验差特适合床实室紧诊的大批量样品处理和急断需求微生物鉴定数据库与信息化国际数据库资源数库录GenBank、EMBL、DDBJ等国际核酸序列据收了全球微生物基因序列信息序列比对分析将测结数库进对寻使用BLAST等工具序果与据行比，找相似度最高的已知序列系统发育分析树进关构建系统发育分析化系，确定新分离菌株在分类学上的准确位置结果输出解读综对结数区给鉴结论合比果、相似度值和置信间，出准确的定现鉴来赖数库资质数库鉴础进则证结代微生物定越越依于生物信息学工具和据源高量的参考据是准确定的基，而先的分析算法保了果的可靠性测术数库断鉴为随着序技的发展和据的不完善，分子定已成微生物分类学的主流方法微生物鉴定与分类的关系分子特征1基因序列分析提供最准确的分类依据生化特性2谢代能力和酶活性反映生理功能差异形态特征细态础鉴标胞和菌落形是基定指生态习性环线栖息境和生长条件提供分类索进化关系亲缘关系统发育分析揭示物种间的系鉴关过鉴过则现综微生物定与分类是相互联的程，定是确定已知微生物身份的程，而分类是建立微生物系统分类体系的科学活动代微生物分类学采用多相分类方法，合形态态、生理、生化、分子和生等多方面信息，建立自然的分类系统微生物保藏方法概述低温冷藏冻干保藏将将冻菌株保存在-20°C或-80°C超低温冰箱菌株在真空冷干燥后密封保存，去谢稳中，或使用液氮-196°C长期保藏，能除水分防止代活动，是最定的长期数够有效保持菌株活性十年保藏方法矿物油保藏斜面保藏养矿绝养简在斜面培物上覆盖无菌物油，隔在琼脂斜面上培后4°C保存，操作缓谢时数传氧气减代，延长保存间至年便成本低，但需要定期代以保持活性。