《微生物培养技术》课件

微生物培养技术微生物培养技术是现代生物学和生物技术的基础，涉及微生物的分离、纯化、培养和保存等核心技术本课程将系统介绍微生物培养的理论基础和实验方法，包括培养基制备、无菌操作、分离纯化技术以及各种培养条件的控制课程大纲1微生物学基础2培养原理与技术包括微生物的基本特点、分类体系和在自然界中的分布规涵盖培养基类型、制备方法、无菌技术和各种培养方式律3分离纯化与计数应用与问题解决介绍微生物分离纯化技术、计数方法和保存技术第一章微生物学基础基本特点分类体系分布规律微生物具有个体微小、繁殖迅速、种类根据细胞结构和分子特征，微生物分为微生物广泛分布于自然界各种环境中，繁多的特点，需要通过显微镜观察，通原核生物、真核生物和病毒三大类，各从深海到高山，从极地到热带，展现出常以群体形式进行研究类具有不同的生物学特性惊人的适应能力微生物的基本特点个体微小群体研究繁殖迅速大多数微生物的个体直径由于单个微生物太小，实多数微生物的世代时间很在微米之间，必须际研究中通常以包含数百短，在适宜条件下，细菌1-10借助显微镜才能观察到其万个体的群体作为研究对可在分钟内完成一20-30形态结构和生命活动象，通过群体行为了解其次分裂，实现指数级增长特性代谢多样微生物具有极其多样的代谢类型，可利用各种有机物和无机物作为营养源，适应不同的生存环境微生物的分类病毒1无细胞结构的微生物真核微生物2酵母菌、霉菌等原核微生物3细菌、蓝藻、放线菌现代微生物分类学不仅基于传统的形态学特征，更多依赖生理生化特性和分子生物学证据序列分析已成为微生物分类鉴定的金DNA标准，为准确识别和命名微生物提供了可靠依据微生物在研究中的重要性应用研究工业和医学应用的基础•发酵工业生产基础研究•生物医药开发作为生命科学研究的模式生物•环境治理技术分子生物学机制研究•教学实验•基因表达调控生物技术教育的重要载体•细胞生物学过程•实验技能训练•科学思维培养•创新能力开发第二章微生物培养的基本原理生长特性生长曲线影响因素二分裂繁殖和指数增长四个不同的生长阶段环境条件对生长的调控理解微生物的生长规律是成功培养的前提微生物在适宜环境中表现出特定的生长模式，这种模式可以通过生长曲线来描述和预测掌握这些基本原理有助于优化培养条件，提高培养效率微生物的生长特性二分裂繁殖指数增长大多数细菌通过二分裂方式繁在理想条件下，微生物种群按指殖，一个母细胞分裂产生两个子数规律增长，即每个世代细胞数细胞这种繁殖方式简单高效，量翻倍这种增长模式意味着少是细菌快速增殖的基础分裂过量起始菌株可在短时间内产生大程包括复制、细胞壁合成和量后代，为工业化生产提供可DNA细胞质分配等步骤能世代时间世代时间是指微生物完成一次分裂所需的时间不同微生物的世代时间差异很大，从数十分钟到数小时不等了解世代时间有助于预测培养时间和优化培养条件微生物生长曲线1延滞期细胞适应新环境，合成必需酶类，细胞数量基本不变，为快速生长做准备2对数生长期细胞以最大速度分裂增殖，生长速率恒定，是收获细胞的最佳时期3稳定期营养耗尽或代谢产物积累，新生细胞数与死亡细胞数达到平衡4衰亡期环境恶化导致细胞大量死亡，活细胞数量急剧下降影响微生物生长的因素营养因素碳源、氮源、磷源、硫源以及各种微量元素和生长因子的充足供应是微生物正常生长的物质基础不同微生物对营养的需求差异很大，需要针对性配制培养基物理因素温度、值、氧气浓度、渗透压等物理因素直接影响微生物的酶活pH性和代谢过程每种微生物都有其最适的物理环境范围，超出范围会导致生长受阻甚至死亡化学因素除营养物质外，环境中的有毒化学物质、抑制剂、抗生素等化学因子也会显著影响微生物生长合理利用这些因素可以实现选择性培养或抑制有害微生物第三章培养基类型与制备培养基概念1为微生物提供营养的人工环境基本成分2碳源、氮源、无机盐等必需营养分类方法3按成分、状态、用途的不同分类制备流程4配制、调节、灭菌的标准程序培养基的概念与作用营养供应选择培养提供微生物生长繁殖所需的各种营养物通过调整成分和条件，实现对特定微生质，包括宏量营养素和微量营养素物的选择性培养或抑制研究工具鉴定功能作为研究微生物生理特性、代谢过程和利用微生物对不同培养基的反应差异，遗传变异的重要工具进行菌种鉴定和分类培养基的基本成分碳源氮源无机盐与生长因子提供细胞骨架和能量的主要来源，构成蛋白质和核酸的必需元素，可磷酸盐、硫酸盐等无机盐维持细胞包括葡萄糖、蔗糖、淀粉等糖类，分为有机氮源和无机氮源蛋白的渗透压平衡，参与酶的激活维以及醋酸、柠檬酸等有机酸碳源胨、酵母提取物属于有机氮源，硫生素、氨基酸等生长因子是某些微的选择直接影响微生物的生长速率酸铵、硝酸钾属于无机氮源生物必需的营养补充和代谢产物培养基的分类（按成分）培养基类成分特点优点缺点应用场合型合成培养化学成分重现性成本高，基础研究基明确好，便于制备复杂研究半合成培部分天然成本适成分不够常规培养养基成分中，效果明确好天然培养天然原料营养丰成分复工业生产基配制富，成本杂，批间低差异大培养基的分类（按状态）液体培养基不含凝固剂的培养基，用于大量培养微生物、研究生理特性和工业发酵具有营养分布均匀、便于取样检测的优点，是深层发酵的基础半固体培养基含琼脂的培养基，主要用于细菌动力性检测、厌氧培养和保存菌种其特殊的胶体状态为微生物提供了独特的生长环境

0.3-

0.7%固体培养基含琼脂的培养基，是微生物分离纯化的重要工具固体表面可形成单菌落，便于观察菌落形态和进行纯化操作

1.5-

2.0%培养基的分类（按用途）12基础培养基选择性培养基满足一般微生物基本营养需求的培养基通过添加抑制剂选择性培养目标微生物34鉴别培养基富集培养基利用颜色变化等现象鉴别不同微生物为特定微生物提供最适宜的营养环境培养基的制备方法配方设计根据目标微生物的营养需求和培养目的，确定各组分的种类和用量参考文献配方或根据经验进行优化调整称量溶解按配方准确称量各种原料，先溶解易溶组分，再加入难溶组分注意溶解顺序和温度控制，避免成分间反应调节pH使用或调节培养基至目标范围大多数细菌适宜中性环NaOH HClpH境（），真菌偏好弱酸性环境（）pH

6.5-

7.5pH

4.5-

6.5灭菌处理采用高压蒸汽灭菌（℃，分钟）或过滤除菌灭菌后立即12115-20冷却至室温，避免营养成分分解培养基的灭菌第四章无菌技术无菌技术是微生物培养的基础技能，包括预防污染的各种操作规程掌握正确的无菌操作方法是确保实验成功的前提，也是保证操作者安全的重要措施无菌操作的目的防止污染避免交叉保证可靠避免环境中的杂菌防止不同微生物间确保实验数据的真进入培养系统，确的相互污染，特别实性和科学性，为保获得纯培养物，是在处理多种菌株后续研究和应用提保证实验结果的准时，确保各菌株的供可靠的基础资料确性和可重复性纯度和特性确保安全保护操作人员免受病原微生物感染，维护实验室环境安全，符合生物安全规范要求无菌操作的基本原则1彻底灭菌所有与微生物接触的器具、培养基和工作表面都必须经过严格的灭菌处理，确保无活菌存在灭菌是无菌操作的基础和前提2火焰保护在酒精灯或本生灯火焰附近进行操作，利用火焰形成的上升气流减少空气中微生物的干扰火焰是无菌区域的天然屏障3快速操作减少培养物和器具暴露在空气中的时间，降低污染概率动作要熟练、准确，避免不必要的停顿和重复操作4正确处理使用后的器具要立即灭菌处理，废弃物要按规定分类处置避免用手直接接触无菌表面，保持工作区域整洁有序常用器具及其灭菌方法器具类型材质特点灭菌方法灭菌条件注意事项玻璃器皿耐高温，干热湿热℃避免急冷/160/2透明灭菌或急热h℃121/20min金属器具导热好，火焰高压红热状态防止过度/坚固灭菌或加热变形℃121/20min塑料制品轻便，不化学辐射环氧乙烷注意材质/易破碎灭菌或射线兼容性γ无菌操作的具体步骤1环境准备清洁工作台面，点燃酒精灯，穿戴防护用品，准备所需器具和培养基2器具灭菌接种环在火焰中烧至红热，试管口在火焰附近转动加热，镊子等器具酒精擦拭3接种操作挑取菌体，插入培养基，按特定模式划线或点种，避免交叉污染4收尾工作再次灭菌接种环，封闭培养皿，标记培养条件，清理工作台面接种操作技术划线分离法倾注平板法在固体培养基表面按特定模式划将菌液与温热的培养基混合后倾线，使菌体逐渐稀释分散，最终注入培养皿，冷却凝固后菌体分获得单菌落这是最常用的分离散在培养基内部适用于不耐热纯化方法，包括三区划线法、四的微生物和厌氧菌的培养分离区划线法等不同模式涂布平板法将稀释的菌液涂布在固体培养基表面，使用无菌玻璃棒或涂布器均匀分散常用于菌落计数和表面分离培养第五章微生物的分离与纯化混合培养物自然界或实验室获得的含多种微生物的培养物分离纯化通过各种技术手段获得单一菌株纯培养物只含有一种微生物的培养物纯度检验确认培养物的纯度和特性混合培养物与纯培养物混合培养物特点纯培养物意义含有多种不同的微生物，各菌株间可能存在竞争、协同或拮抗关只含有一种微生物的培养物，是微生物学研究的基础纯培养物系自然环境中的微生物群落通常以混合状态存在，体现生态系使研究者能够准确了解特定微生物的生物学特性，为深入研究和统的复杂性实际应用提供可靠材料•菌落形态多样便于特性研究••代谢产物复杂•确保实验重现性•难以研究单一菌株特性•满足工业应用需求分离纯化的意义深入研究研究单一菌株的详细特性确保重现性保证实验结果的可重复性和一致性工业应用为发酵工业和生物技术提供标准菌株基因工程4作为基因工程和分子生物学研究的基础材料常用分离方法

（一）稀释平板法倾注平板法通过系列稀释降低菌体浓度，然后制备平板平板划线分离法将菌液与液体培养基混合后倾注成平板，菌培养这种方法可以获得适当的菌落密度，最经典的分离方法，通过在培养基表面按特体分散在培养基内部形成菌落该方法特别便于挑选单菌落，常与其他方法联合使用以定模式划线，使菌体逐渐稀释三区划线法适用于厌氧菌和对氧敏感微生物的分离，也提高分离效果和连续划线法是最常用的模式，操作简单，常用于菌落计数效果可靠，适用于大多数微生物的分离常用分离方法

（二）挑取单菌落法物理分离法直接挑取形态特异的单菌落利用物理特性差异分离•观察菌落特征•显微操作技术12•选择目标菌落•梯度离心分离•转接纯化培养•电泳分离技术稀释至限度法选择性培养法通过极限稀释获得单细胞利用营养需求差异选择43•系列稀释培养•特异性培养基•统计学分析•抑制剂筛选•单细胞培养•环境条件选择纯度检验形态学观察生理生化检验分子生物学检验通过肉眼观察菌落形态特征，包括检测培养物对不同碳源、氮源的利采用扩增、指纹图谱、PCR DNA大小、颜色、形状、边缘、质地用能力，酶活性测定，代谢产物分基因序列分析等现代分16S rRNA等显微镜观察细胞形态，检查是析等通过比较不同菌落或培养物子技术这些方法具有高精度和高否存在不同类型的微生物这是最的生化特性，判断是否为同一菌特异性，是目前最可靠的纯度检验直观的纯度检验方法株手段第六章培养方式与条件控制静置培养摇床培养发酵罐培养培养物在静止通过振荡增加大规模工业化状态下生长，溶氧量，提高培养，可精确适用于表面需传质效率，适控制各种环境氧菌和厌氧菌用于好氧菌液参数培养体培养连续培养持续补充新鲜培养基，维持稳定的生长状态培养方式的分类培养方式操作特点适用范围主要优点主要缺点静置培养培养物静厌氧菌、操作简传质效率止不动表面膜菌单，成本低低摇床培养振荡提供好氧菌液增氧效果容量有限氧气体培养好搅拌培养机械搅拌大规模液传质效率设备复杂混合体培养高连续培养持续流加稳态生理条件稳定操作复杂培养基研究好氧培养氧气供应温度控制通过振荡、搅拌或通气方式增加培养物维持适宜的培养温度，大多数细菌适宜中的溶氧量，满足好氧微生物的呼吸需℃，酵母菌适宜℃30-3725-30求转速调节监测调控摇床转速通常为，发酵150-200rpm实时监测、溶氧、生物量等参数，及pH罐搅拌速度根据规模调整，平衡增氧与时调整培养条件以维持最佳生长状态剪切力厌氧培养除氧处理通过抽真空、通入惰性气体或化学除氧剂移除环境中的氧气厌氧装置使用厌氧培养箱、厌氧袋或厌氧罐等专用设备创建无氧环境防氧措施操作过程中避免空气接触，使用预还原培养基和抗氧化剂环境验证使用氧敏感指示剂或电极监测厌氧环境的有效性特殊培养条件温度控制值调节特殊环境需求pH不同微生物对温度要求差异很大嗜大多数细菌适宜中性环境（光合细菌需要特定波长的光照，高压pH

6.5-冷菌适宜℃，中温菌适宜），而真菌偏好弱酸性环境（菌需要增压环境，嗜盐菌需要高盐浓4-1520-

7.5pH℃，嗜热菌需要℃甚至更）某些特殊微生物如嗜酸度这些特殊条件的控制往往需要专4545-

804.5-

6.5高精确的温度控制对维持微生物活菌需要的强酸环境，嗜碱菌门的设备和技术支持pH2-4性和代谢状态至关重要则需要的碱性条件pH9-11第七章微生物计数方法直接计数法显微镜直接观察计数，包括血球计数板和电子计数器方法平板计数法基于菌落形成单位的间接计数，是最常用的活菌计数方法统计学方法最大或然数法，适用于难以分离的微生物群体计数间接测定法通过浊度、干重或代谢产物间接推算微生物数量直接计数法

0.1400计数室体积显微镜倍数血球计数板每个小格体积为，为准确计数提供标准空间通常使用倍显微镜观察，确保能清晰识别单个微生物细胞

0.1mm³4002595计数格数方法准确性一般计数个中格或更多，减少随机误差，提高计数准确性直接计数法准确性可达以上，但无法区分活菌与死菌2595%平板计数法1样品稀释制备倍系列稀释液，选择适当稀释度进行平板接种102平板制备采用倾注法或涂布法制备平板，确保菌体均匀分布3培养计数适宜条件下培养小时，计数菌落数量24-484结果计算根据稀释倍数和菌落数计算原样品中的活菌浓度最大或然数法（法）MPN浊度法测定原理操作方法应用优势微生物在液体培养基中生长时会使培养使用分光光度计在波长下测定吸操作简便快速，无需等待培养时间，可600nm液变浑浊，浊度与微生物浓度呈正相光度（₆₀₀），或使用比浊计直接实时监测微生物生长动态广泛应用于OD关通过测定特定波长下的吸光度或透读取浊度值需要建立标准曲线关联浊发酵工业的在线监测和实验室快速检射率，可快速估算微生物数量度与活菌数的关系测其他计数方法干重法代谢产物法分子生物学法通过测定微生物干重间测定微生物代谢产生的利用、流式细胞术PCR接计算细胞数量适用特征性化合物，如、等现代技术快速准确计ATP于大规模发酵过程的生蛋白质或特定酶活性，数可定量检测特qPCR物量监测，但无法区分间接反映微生物数量和定微生物，流式细胞术活菌与死菌活性可区分活死细胞图像分析法结合显微镜和计算机图像处理技术，自动识别和计数微生物细胞，提高计数效率和准确性第八章微生物培养物的保存短期保存（个月）1-6适用于日常实验使用的菌株保存，包括斜面保存、液氮速冻等方法操作简便，成本较低，但保存时间有限，需要定期转接中期保存（个月年）6-2在℃或℃条件下冷冻保存，加入甘油等冷冻保护剂适用-20-80于阶段性研究项目的菌株储备，平衡了保存时间和成本长期保存（年以上）2采用液氮冷冻、冷冻干燥等方法，可保存数十年甚至更长时间适用于珍贵菌株的永久保存和菌种库建设，是最可靠的保存方式短期保存斜面保存低温保存将微生物接种在琼脂斜面上，在℃冰箱中保存微生物-20℃冰箱保存这是最传统和培养物，通常加入415-20%常用的短期保存方法，适用于甘油作为冷冻保护剂操作简大多数细菌和真菌保存期单，适合日常使用的菌株保个月，需要定期检查和存，保存期可达年1-61转接矿物油覆盖法在斜面培养物表面覆盖无菌液体石蜡，隔绝空气防止干燥特别适用于厌氧菌和对氧敏感微生物的保存，可延长保存时间至年以上1长期保存超低温冷冻冷冻干燥在液氮（℃）中保存去除细胞内水分制成干粉-196•细胞活性几乎完全停止•常温下长期稳定可保存数十年•便于运输和储存••复苏率高•适用于细菌和孢子保护剂应用真空干燥使用专业冷冻保护剂在真空条件下除水保存甘油、等•防止氧化变质•DMSO•减少冰晶损伤保持生物活性•提高存活率•成本相对较低•。