《微生物复苏保藏》课件

微生物复苏保藏微生物复苏与保藏技术是现代生物技术领域的重要基础技术，为微生物资源的长期保存和有效利用提供了科学保障本课程将系统介绍微生物保藏的基础理论、操作技术和实际应用，帮助学员掌握微生物资源管理的核心技能课程内容涵盖微生物保藏的意义、原理、方法以及复苏技术的实际操作，结合产业应用案例和最新技术发展趋势，为从事微生物相关研究和生产的专业人员提供全面的技术指导绪论微生物资源的重要性保藏与复苏的应用背景技术发展趋势微生物是地球上最古老、最丰富的随着生物技术产业的快速发展，对现代微生物保藏技术正朝着标准化、生命形式，具有极其重要的生态和微生物资源的需求日益增长有效自动化和智能化方向发展，为建立经济价值它们在生物圈的物质循的保藏技术能够确保珍贵微生物资大规模微生物资源库提供了技术支环、能量转化中发挥着不可替代的源的长期保存，而可靠的复苏技术撑，推动了生物医药、农业和环保作用，同时也是生物技术产业的重则保证了保藏菌株的重新激活和应等领域的技术进步要基础资源用微生物保藏的意义遗传资源保存科研与生产支撑微生物保藏的首要意义在于保护珍贵的遗传资源许多微生物具有效的微生物保藏为科学研究提供了稳定可靠的实验材料研究有独特的生物学特性和遗传背景，一旦失去将无法恢复通过科人员可以随时获得性状一致的菌株，确保实验结果的可重现性和学的保藏技术，我们能够维持菌株的遗传稳定性，防止有益基因可比性，提高科研工作的效率和质量的丢失在工业生产中，保藏技术保证了生产菌株的稳定供应，避免了因保藏技术还能够防止微生物在连续传代过程中发生的遗传漂变，菌株变异或丢失造成的生产中断，为生物技术产业的持续发展提确保原始菌株特性得以长期保持，为后续的科学研究和产业应用供了重要保障奠定坚实基础微生物保藏的历史发展1斜面法早期应用世纪初期，斜面培养基保藏法成为微生物保存的主要方法20这种方法简单易行，成本低廉，适合一般实验室使用然而，保存时间有限，需要定期转接，存在污染和变异风险2冷冻技术引入世纪中期，低温冷冻技术开始应用于微生物保藏°20-20C和°冷冻技术显著延长了保存时间，降低了代谢活动，-80C减少了遗传变异的发生3现代冻干技术真空冷冻干燥技术的发展标志着微生物保藏进入现代化阶段这种技术能够在常温下长期保存微生物，保存期可达数十年，成为目前最可靠的保藏方法之一常见微生物保藏对象细菌真菌放线菌包括好氧菌、厌氧菌、包括丝状真菌和酵母菌是抗生素的重要来源，兼性厌氧菌等各类细菌青霉菌用于抗生素生产，链霉菌属是最主要的代大肠杆菌、枯草芽孢杆曲霉菌用于酶制剂生产，表许多重要的抗生素菌等常用于分子生物学而各种食用菌则在食品如链霉素、土霉素等都研究，而乳酸菌、醋酸工业中发挥重要作用来源于放线菌的代谢产菌等在食品发酵中应用物广泛酵母在发酵工业中占据重要地位，酿酒酵母用于酒类生产，面包酵母用于烘焙工业，工业酵母则用于各种生物制品的生产微生物保藏的基本原理降低代谢速率通过降低温度或去除水分，显著减缓微生物的新陈代谢活动低温条件下，酶活性降低，生化反应速度减慢，细胞进入休眠状态，从而延长保存时间保护细胞结构使用适当的保护剂如甘油、二甲基亚砜等，防止冷冻过程中冰晶对细胞膜和细胞器造成的机械损伤，维持细胞的完整性和活力延缓变异和衰退在适宜的保藏条件下，微生物的遗传物质保持稳定，减少了突变和遗传漂变的发生，确保菌株的原始特性得以长期保持保藏过程中的影响因素温度控制湿度管理温度是影响微生物保藏效果的关键因素不适宜的湿度条件能够防止微生物过度脱水或同的保藏方法需要不同的温度条件，从吸湿在冻干保藏中，残余水分含量必须控°的冷藏到°的液氮保存，温度制在适当范围内，过高或过低都会影响保藏4C-196C的精确控制直接影响保藏成功率效果营养需求氧气环境保藏前的菌体状态和营养储备影响保藏效果根据微生物的氧气需求特性，需要创造相应通常在对数生长期收集菌体，此时细胞活力的气体环境厌氧菌需要无氧环境，而好氧最强，营养储备充足，更容易成功保藏菌则需要适量氧气供应保藏标签和信息管理标签内容规范标准的保藏标签应包含菌株的完整名称、分类地位、菌株编号、保藏代次、操作人员、保藏日期等基本信息这些信息必须准确、清晰、耐久，确保在长期保存过程中不会模糊或脱落编码系统建立统一的菌株编码系统，采用字母数字组合的方式，体现菌株的来源、特性、保藏时间等信息编码系统应具有唯一性、可扩展性和易识别性记录标准化制定详细的记录标准，包括保藏操作记录、质量检测记录、复苏试验记录等记录应采用标准化格式，便于数据统计分析和质量追溯可追溯性管理建立完整的菌株追溯体系，从原始分离、鉴定、保藏到复苏使用的全过程都要有详细记录，确保每个环节都可查询、可追溯、可验证微生物保藏常用方法总览斜面保藏法最传统的保藏方法，将菌株接种在斜面培养基上，在低温条件下保存操作简单，成本低廉，但保存时间相对较短，需要定期转接维持活力干燥保藏法利用硅胶、乳糖等干燥剂除去菌体中的水分，在干燥状态下保存微生物适用于孢子形成菌和耐干燥的微生物，保存期较长冷冻干燥保藏法通过真空冷冻干燥技术，在保持菌体结构完整的前提下除去水分保存时间最长，可达数十年，是目前最可靠的保藏方法低温保藏法在°、°或液氮温度下保存微生物保存效果好，适用范围广，-20C-80C但需要连续的低温设备支持斜面保藏法培养基制备选择适合目标微生物生长的培养基，制备成斜面形式常用的培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯葡萄糖培养基等培养基的营养成分要充足但不过于丰富，避免菌株过度生长接种与培养将活化的菌株接种到斜面培养基上，在适宜温度下培养至菌苔生长良好但未老化的状态接种量要适中，确保菌苔覆盖面积合适，便于后续取样使用低温保存将培养好的斜面密封后置于°冰箱中保存定期检查菌苔状态，4C通常每个月需要转接一次，以维持菌株活力和避免培养基6-12老化干燥保藏法脱水保存去除菌体水分延长保存期干燥剂选择硅胶、无水乳糖、氯化钙等低温储存°条件下密封保存4C适用菌种主要适合土壤放线菌和孢子菌干燥保藏法是一种经济实用的保藏方法，特别适合放线菌等耐干燥的微生物操作时需要严格控制脱水速度和程度，避免过度脱水导致细胞死亡保存期间要定期检查干燥剂的有效性，及时更换失效的干燥剂冷冻干燥（冻干）保藏法预冻阶段升华干燥将菌悬液在°以下快速冷冻，形在真空条件下，冰晶直接升华为水蒸气-40C成均匀的冰晶结构预冻温度和速度直这个过程需要严格控制温度和真空度，接影响后续干燥效果和菌体存活率确保干燥彻底但不损伤细胞结构密封保存解析干燥将干燥后的菌体密封在安瓿瓶中，充入去除残留的结合水分，进一步降低含水惰性气体防止氧化在常温或°条件4C量温度逐步升高，但不能超过菌体的下可保存年，基本维持遗传稳定5-20耐受温度，通常控制在°以下40C性低温保藏法°°°-20C-80C-196C家用冷冻超低温冷冻液氮保存适合短期保存，保存期年工业标准，可保存年理论上可永久保存，活性最佳1-25-10低温保藏法通过降低温度来抑制微生物的代谢活动和酶反应，是目前应用最广泛的保藏方法之一不同温度条件下的保藏效果差异明显，温度越低，保存效果越好在实际操作中，需要注意冷冻和解冻的速度快速冷冻能够减少冰晶对细胞的损伤，而快速解冻则能够最大限度地恢复细胞活力同时要避免反复冻融，每次冻融都会造成细胞活力的损失悬液保藏法保护剂配制常用甘油、等作为冷冻保护剂，浓度通常为DMSO10-20%菌液制备将新鲜培养的菌体与保护剂混合，调节菌体浓度分装冷冻小体积分装后快速冷冻至°或更低温度-20C长期保存在稳定低温下可保存数年，使用时取出解冻比较不同保藏方法保藏方法保存温度保存年限操作难度适用对象成本投入斜面保藏°年简单绝大多数低4C

0.5-2微生物冷冻干燥室温°年复杂细菌、某高/4C5-20些真菌低温保藏年中等绝大多数中等-5-10°微生物20C/-°80C干燥保藏°年简单孢子菌、低4C2-5放线菌悬液保藏年简单大多数微中等-3-8°生物20C/-°80C冻干保藏流程菌体制备培养微生物至对数生长期，此时细胞活力最强，代谢旺盛收集菌体并用适当的缓冲液洗涤，去除培养基残留，调节菌体浓度至适宜范围保护剂添加加入冷冻保护剂如脱脂牛奶、血清、甘露醇等，保护细胞在冷冻和干燥过程中免受损伤保护剂的种类和浓度需要根据菌种特性进行优化冷冻干燥3将菌悬液分装到安瓿瓶中，在冷冻干燥机中进行预冻、升华和解析干燥整个过程需要小时，严格控制温度和真空度变化12-24密封储存将干燥后的安瓿瓶进行火焰封口或机械密封，充入惰性气体，贴上标签后在阴凉干燥处保存定期检查密封性和菌体状态低温保藏操作要点快速降温保护剂选择小体积分装温度监控采用程序化降温或直接投根据微生物类型选择合适将菌悬液分装成小体积建立温度监控系统，实时入液氮的方式，使菌体快的保护剂甘油适用于大（），确保冷监测保存环境的温度变化

0.5-2ml速通过°到°多数细菌，适用冻和解冻的均一性使用设置报警系统，在温度异-5C-30C DMSO的危险温度区间，避免大于真菌和酵母，蔗糖和甘专用的冷冻管，确保密封常时及时处理，避免菌株冰晶的形成对细胞造成机露醇适用于某些特殊菌株性良好，防止交叉污染活力损失械损伤浓度通常为10-20%悬液甘油法细节甘油浓度优化操作标准流程甘油作为最常用的冷冻保护剂，其浓度需要精确控制一般推荐将新鲜培养的菌体离心收集，用无菌生理盐水洗涤一次按比例浓度为，过低无法起到保护作用，过高则可能对细胞加入无菌甘油溶液，轻柔混匀避免产生气泡10-15%产生渗透压损伤分装到预冷的冷冻管中，每管，立即置于°或

0.5-1ml-20C-不同微生物对甘油的耐受性不同，需要通过预实验确定最适浓度°保存首次冷冻前可在°平衡分钟，有助于80C4C10-15某些敏感菌株可能需要降低甘油浓度或采用其他保护剂保护剂渗透保藏用容器与封存方式安瓿瓶特点安瓿瓶是冻干保藏的理想容器，具有优异的气密性和耐低温性能玻璃材质化学稳定性好，不会与保存物质发生反应火焰封口后可实现完全密封，防止外界污染和内容物氧化冷冻管优势冷冻管适用于低温保藏，具有良好的耐低温性能和密封性螺旋盖设计便于开启和密封，内螺纹设计防止泄漏材质通常为聚丙烯，耐受°的极低温度-196C标签耐久性保藏容器的标签必须具有良好的耐久性，能够在低温、潮湿等恶劣环境下保持清晰可读推荐使用防水、耐低温的专用标签，或采用激光刻印的方式进行标识批量操作考虑对于大规模菌种保藏，需要考虑容器的标准化和操作便利性选择规格统一的容器，建立标准化的封装流程，提高工作效率和保藏质量的一致性常见保藏标签示例基本信息标注菌株名称、编号、保藏日期必须清晰操作人员记录操作人员姓名、联系方式便于追溯代次与批次管理准确记录传代次数和批次编号标准化的标签格式有助于提高菌种管理的效率和准确性建议采用统一的标签模板，包含所有必要信息字段对于重要菌株，还应该包含备份保藏的位置信息和相关文献引用现代菌种库越来越多地采用条形码或二维码技术，将菌株信息数字化存储，提高查询效率和减少人为错误这种电子标签系统可以与实验室信息管理系统（）集成，实现自动化管理LIMS保藏过程中菌株变异问题遗传漂变表型丧失长期保藏过程中，微生物可能发生随机的遗某些重要的生理功能如产酶能力、抗性特征传变异，导致某些基因功能的丢失或改变等可能在保藏过程中逐渐丢失表型丧失往这种变异通常是不可逆的，会影响菌株的原1往与质粒的不稳定性有关DNA有特性交叉污染病毒污染不同菌株之间的交叉污染可能导致菌种纯度噬菌体等病毒的潜伏感染可能在保藏复苏过下降，影响实验结果的可靠性这种污染通程中被激活，导致菌株活力下降或完全死亡常发生在操作不当或容器密封不良的情况下这种污染往往难以检测和预防保藏菌株的变异控制控制传代次数严格限制菌株的传代次数，建立主库、工作库的分级保藏体系主库菌株不得用于日常实验，仅用于制备工作库工作库菌株传代次数不超过代，超过10后需要从主库重新制备避免不利条件严格控制保藏和复苏过程中的温度条件，避免高温处理和反复冻融建立标准化的操作程序，培训操作人员掌握正确的技术要领多重备份保藏对重要菌株采用多种保藏方法同时保存，在不同地点建立备份这样可以降低单一保藏方法失败的风险，确保珍贵菌株资源的安全定期质量检测建立定期的菌株质量检测制度，包括形态学观察、生化特性检测、分子生物学鉴定等及时发现变异菌株，采取相应的处理措施复苏流程总览解冻复水准备根据不同的保藏方法采用相应的复苏程序冻干菌株需要无菌水或培养基复水，冷冻菌株需要快速解冻，干燥菌株需要适宜的复水介质操作前要检查菌株标签信息，确认菌株身份活化培养操作将复苏的菌株接种到适宜的培养基上，在最适生长条件下进行活化培养初次培养可能需要延长培养时间，因为保藏菌株的活力可能有所下降，需要更长时间恢复正常生长状态性状复核验证对复苏后的菌株进行全面的性状检测，包括形态特征、生化特性、生理功能等比较检测结果与原始菌株记录，确认菌株特性是否保持一致，判断复苏是否成功冻干菌株的复苏步骤1表面消毒用酒精彻底擦拭安瓿瓶外表面，特别是瓶颈部位让酒精充分作用后75%自然挥发干净，避免酒精残留影响菌株活力安全开启用专用的安瓿瓶切割器在瓶颈细处划痕，然后用纱布包裹折断动作要轻柔，避免玻璃碎片飞溅，同时防止瓶内菌粉飞散造成污染3复水混匀用无菌移液器加入无菌水或培养基，轻轻摇动使冻干菌粉完全

0.2-

0.5ml溶解避免剧烈振摇产生气泡，复水后的菌悬液应该澄清无颗粒4接种培养将复水后的菌悬液接种到适宜的培养基上，包括液体和固体培养基培养条件要严格按照该菌株的最适条件，初次培养时间可适当延长低温甘油保存菌株的复苏快速解冻°水浴中快速解冻避免冰晶损伤137C稀释处理2用新鲜培养基稀释降低甘油浓度接种培养3接种斜面或液体培养基活化观察生长监测菌株生长状况和形态特征低温甘油保存的菌株复苏相对简单，但需要注意解冻速度和甘油的去除快速解冻能够最大限度地保持细胞活力，而适当的稀释处理可以降低甘油对后续培养的影响复苏后的菌株活力可能需要几代培养才能完全恢复到原有水平因此，不要急于进行重要实验，应该先通过几次传代培养让菌株充分适应和恢复微生物复苏的注意事项避免反复冻融冷冻保存的菌株应该一次性使用完毕，避免反复冻融造成的活力损失如果需要多次使用，应该在保藏时就分装成小份，每次只取用需要的数量培养条件匹配复苏培养的条件应该与原始保藏时的条件保持一致，包括温度、值、培养基成分pH等突然改变培养条件可能会加重菌株的应激反应，影响复苏效果复核验证重要性复苏后必须进行全面的性状检测，确认菌株特性是否保持一致即使外观正常的菌株也可能已经发生了某些功能性变异，需要通过系统检测才能发现无菌操作规范整个复苏过程都要严格执行无菌操作规程，防止外源微生物污染使用无菌器具、在无菌环境中操作、及时处理废料等都是必要的防护措施复苏后性能检测形态学检测功能性检测通过显微镜观察菌株的细胞形态、大小、排列方式等特征，与原检测菌株的关键生理功能，如产酶活性、代谢产物生成、抗性表始记录进行对比注意观察是否出现形态异常、细胞破损或异型达等这些功能特性往往是菌株应用价值的核心，必须确保在保细胞增多等现象藏复苏过程中得到良好保持对于产孢子的微生物，还需要检查孢子的形成能力和形态特征对于工业用菌株，还需要进行发酵性能测试，评估其生产能力是某些菌株在保藏过程中可能会丧失产孢能力，这是需要重点关注否达到原有水平如果发现性能下降，需要分析原因并决定是否的变异指标继续使用该批次菌株复苏失败的常见原因菌株死亡培养基不适微生物污染保藏过程中操作不当、保存使用了不适合该菌株生长的复苏过程中发生了细菌、真条件不良或保存时间过长都培养基，或者培养基成分发菌或噬菌体污染，掩盖了目可能导致菌株完全失活冷生了变化某些菌株对营养标菌株的生长或直接杀死了冻干燥不彻底、冷链中断、需求比较特殊，需要使用专目标菌株污染往往来源于容器破损等都是常见的致死用培养基或添加特定的生长操作环境、器具或培养基的因素因子不洁净条件不当培养温度、值、氧气条pH件等与菌株要求不符某些菌株对环境条件要求严格，微小的偏差都可能影响其正常生长和复苏效果解决复苏失败的对策更换备份样品尝试使用同一菌株的其他保藏批次或不同保藏方法的样品优化培养条件调整培养基配方、培养温度、值等关键参数pH加强无菌控制3重新检查操作流程，提高无菌操作标准当遇到复苏失败时，首先要系统分析可能的原因，然后采取针对性的解决措施不要急于下结论认为菌株已经死亡，很多看似失败的复苏实际上是操作条件的问题建议建立复苏失败的记录档案，总结失败原因和解决方案，为今后类似问题的处理提供参考对于珍贵菌株，应该尝试多种复苏条件和方法，最大限度地提高复苏成功率菌种保藏与复苏的标准规范国际标准体系遵循生物资源中心标准，该标准规定了生物资源收集、保藏、分发和质量管理ISO20387的通用要求还要参考世界微生物菌种保藏联合会的技术指南和最佳实践WFCC国家标准要求严格执行相关标准，包括微生物保藏方法、质量控制要求、标识规范等国家标准为GB/T菌种保藏工作提供了具体的技术规范和操作指导操作手册制定建立详细的标准操作程序，涵盖菌种接收、鉴定、保藏、复苏、质量控制等各个环节SOP操作手册应该定期更新，反映最新的技术发展和标准要求记录追溯系统建立完整的记录体系，确保每个操作步骤都有详细记录，支持全程追溯记录格式要标准化，便于数据统计分析和质量审核保藏与复苏的质量控制定期性状复核存活率监测建立定期的菌株质量检测制度，通常每定期检测不同保藏条件下菌株的存活率年或每两年对保藏菌株进行一次全面检变化趋势，及时发现保藏效果下降的迹测检测内容包括存活率、纯度、典型象建立存活率数据库，为保藏方法优特征等关键指标化提供数据支持持续改进机制备份保藏策略根据质量监测结果持续改进保藏技术和对重要菌株采用多点、多法保藏策略，管理流程定期评估保藏效果，优化操在不同地点、用不同方法建立备份这3作参数，提高保藏成功率和菌株质量稳样可以有效降低单点失败的风险，确保定性珍贵资源的安全污染防控措施严格无菌操作在生物安全柜中进行所有菌株处理操作，使用无菌器具和试剂操作前要充分清洁和消毒工作台面，操作过程中避免不必要的开启和移动定期检测操作环境的微生物污染水平定期纯度检查建立菌株纯度检测制度，使用显微镜观察、平板划线、生化鉴定等方法验证菌株纯度对于怀疑有污染的菌株要立即隔离，进行详细的污染源分析和处理分离存储管理不同来源和类型的菌株要分别存储，避免交叉污染建立清晰的储存区域划分和标识系统，定期清理和消毒储存设备对高风险菌株采用特殊的隔离措施人员培训制度定期对操作人员进行无菌技术培训和考核，确保每个人都掌握正确的操作方法建立污染事故报告和处理制度，及时总结经验教训，防止类似问题再次发生菌种遗传稳定性考核16S核糖体基因基因序列分析验证菌株身份rRNARAPD随机扩增多态性指纹图谱分析DNAPFGE脉冲电泳大分子限制性酶切分析DNAMLST多位点测序管家基因序列类型分析遗传稳定性是评价菌株保藏质量的重要指标现代分子生物学技术为遗传稳定性检测提供了精确可靠的方法，能够在水平上检测菌株的遗传变DNA异对于重要的生产菌株和科研用菌株，建议定期进行遗传稳定性检测，特别是在长期保藏后的复苏菌株通过比较保藏前后的分子指纹图谱，可以准确判断菌株是否发生了遗传变异保藏菌种的信息化管理数据库建设建立完整的菌种信息数据库，包含菌株的分类学信息、来源、特性、保藏历史、质量检测结果等全面信息数据库应该具有良好的可扩展性和兼容性条码标识系统为每个保藏菌株分配唯一的条形码或二维码标识，实现快速准确的身份识别条码系统要与数据库系统无缝集成，支持快速查询和追溯智能检索功能开发强大的检索功能，支持按菌种名称、特性、来源、应用领域等多种方式查询提供高级搜索和模糊匹配功能，提高信息检索的效率和准确性统计分析模块内置数据统计分析功能，能够生成各种统计报表和趋势分析图表为菌种资源管理和科研决策提供数据支持。