《微生物菌种的管理与保存》课件

微生物菌种的管理与保存微生物菌种作为生物技术、医药、食品、环保等众多领域的基础资源，其科学管理与有效保存对于保障科研质量、产业发展和生物安全具有重要意义随着生物技术产业的快速发展，菌种资源的价值日益凸显，建立规范化的菌种管理体系已成为各类实验室和生产企业的必然要求国家对微生物菌种管理制定了严格的规范性要求，包括《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《微生物菌种保藏管理办法》等法规，要求各单位建立完善的菌种管理制度，确保菌种资源的安全、有效利用本课件将系统介绍微生物菌种管理与保存的理论基础、技术方法和实践经验微生物菌种的定义与分类基本定义分类依据分类意义菌种是指具有特定遗传特征和生物学性微生物菌种的分类主要基于三个层面科学的分类体系有助于准确识别菌种特状的微生物个体或群体，是微生物分类形态学特征包括细胞形状、大小、染色性，指导合理的保存方法选择，确保菌学的基本单位菌株是从同一菌种中分性质等；生理生化特征涵盖代谢类型、种资源的有效管理和利用同时为菌种离获得的具有相同或相似特征的微生物酶活性、营养需求等；分子特征则包括间的比较研究、功能开发和应用提供重个体，而标准菌株则是经过权威机构认序列、蛋白质谱、基因组结构等现要依据DNA定、具有标准生物学特征的参考菌株代分子生物学指标微生物菌种的来源实验室采集菌种库引进通过环境采样、临床分离、发酵从国内外权威菌种保藏机构购买过程筛选等方式获得的原始菌或交换获得的标准菌株和功能菌株包括土壤、水体、植物根株这些菌株通常具有明确的分际、动物肠道等自然环境中的微类地位、详细的生物学特征描述生物资源，以及工业发酵、食品和质量保证加工过程中分离的功能菌株工业与环境微生物工业微生物通常经过人工选育，具有特定的生产性能；环境微生物则保持自然状态的遗传多样性两者在管理要求、保存方法和应用目标方面存在显著差异菌种管理的意义科研基础保障高质量的菌种资源是微生物学研究、生物技术开发的重要基础规范化管理确保研究结果的可重现性和数据的可靠性，为科学发现和技术创新提供稳定的材料支撑医疗诊断支撑标准菌株在临床诊断、药敏试验、质量控制中发挥关键作用准确的菌种鉴定和规范化管理直接关系到诊断结果的准确性和患者的生命安全工业生产基础在发酵工业、生物制药、食品加工等领域，优良菌种是产品质量和生产效率的决定因素有效的菌种管理能够防止生产菌株的退化和污染，保障产品稳定性风险防控措施规范化管理能够有效避免菌种污染、遗失和变异等风险，防止病原微生物的扩散，保障实验室安全和公共卫生安全国内外主要菌种保藏中心中国微生物菌种保藏中美国典型培养物保藏中德国微生物菌种保藏中心心心作为国家级菌种保藏机构，成立于年，是全专门从事微生物和细ATCC1925DSMZ收藏各类微生物菌株超过球最大的生物资源保藏机构胞培养物的收集、鉴定和保13万株，涵盖细菌、放线菌、之一，收藏微生物、细胞存，收藏菌株超过万株3酵母菌、丝状真菌等多个类系、基因材料等超过万在厌氧微生物、极端环境微375群提供菌种保藏、鉴定、种生物材料其严格的质量生物保藏方面具有独特优分发等专业服务，是我国微管理体系和标准化服务在国势，为全球科研机构提供高生物资源保护和利用的重要际上享有盛誉质量的标准菌株平台国际合作网络世界微生物数据中心、全球生物多样性信息网络等国际组织推动菌种资源共享，建立了统一的数据标准和交换机制，促进全球微生物资源的有效利用和保护管理流程概览登记建立详细的菌种档案，记录来源、特征、用途等基本信息检测进行纯度检查、形态鉴定、生化特征测定等质量控制使用按照规定程序取用，记录使用情况和实验结果保存采用适当方法长期保存，定期检查保存状态处置对失效或不再需要的菌种进行安全灭活和记录注销管理岗位与职责菌种管理员质量控制员负责日常菌种管理负责菌种质量检验菌种登记与台账维护纯度检测••保存条件监控活力测定••使用记录管理鉴定确认••双人双锁机制安全管理员重要菌种实行双重管理负责生物安全管理共同保管密钥风险评估••相互监督核查安全培训••记录交叉验证应急处置••菌种登记管理制度初始登记新获得菌种时建立基础档案，包括菌种名称、编号、来源单位、获取日期、初步特征等基本信息确保每个菌种都有唯一标识符详细记录补充完善菌种的详细信息，包括分类学地位、生物学特征、培养条件、保存方法、质量检测结果等建立完整的技术档案动态更新及时记录菌种的流转、使用、传代、质检等动态信息每次操作都要有详细记录，确保菌种历史的完整追溯定期维护定期检查台账的完整性和准确性，及时更新菌种状态信息对长期未使用或状态异常的菌种进行专门标注和处理菌种信息化管理系统构建LIMS实验室信息管理系统是现代菌种管理的核心工具系统集成了菌种登记、库存管理、质量控制、使用追踪等功能模块，实现菌种管理的全流程数字化通过条码技术和自动识别系统，大大提高了管理效率和准确性数据安全保障建立多层次的数据备份机制，包括本地备份、云端存储和异地灾备采用区块链技术防止数据篡改，确保菌种信息的真实性和完整性设置严格的访问权限控制，保护重要菌种资源信息智能化应用利用人工智能技术进行数据分析和预警，自动识别菌种管理中的异常情况通过物联网技术实时监控保存环境，实现设备故障自动报警和远程维护建立智能化的菌种推荐系统，提高资源利用效率菌种纯度与真实性检查菌落形态学鉴定通过观察菌落的大小、形状、颜色、质地、边缘特征等宏观形态，初步判断菌种的纯度和真实性这是最基础也是最直观的检测方法，需要丰富的实践经验和标准对照显微镜检查利用光学显微镜观察细胞形态、大小、排列方式、运动性等微观特征通过革兰氏染色、芽孢染色等特殊染色方法，进一步确认菌种的分类学特征和纯度状况分子检测技术采用扩增、测序、基因指纹图谱等现代分子生物学技术，从基因水平验证菌PCR DNA种的真实性这些方法具有高度的特异性和准确性，是菌种鉴定的金标准生理生化测试通过糖发酵试验、酶活性检测、抗生素敏感性测试等生理生化特征分析，验证菌种的功能特性建立标准化的检测流程和判定标准，确保检测结果的可靠性菌种编码溯源全球唯一编码国际标准编码体系机构内部编码实验室自定义编号系统批次标识编码每次传代的唯一标识时间戳编码操作时间的精确记录操作员编码责任人身份标识完善的编码溯源体系是菌种管理的重要基础通过建立多层次的编码系统，可以实现从全球范围到具体操作的完整追溯每个菌种都应具有全球唯一的标识符，同时结合机构内部的管理编码，形成完整的身份标识体系批次追踪功能能够准确记录每次传代、保存、使用的详细信息，为质量问题的追根溯源提供可靠依据污染控制与异常处理定期检测污染识别建立标准化的纯度检测计划，根据菌种通过形态观察、显微镜检查、生化测试特性和保存方法确定检测频率一般情等方法及时发现污染征象建立污染类况下，工作菌株每月检测一次，保存菌型判定标准，区分细菌、真菌、酵母等株每季度检测一次不同污染源报告记录处理恢复详细记录污染发现时间、污染类型、可对污染样本进行高压灭菌处理，从备份能原因、影响范围等信息及时上报相菌株中重新分离纯化分析污染原因，关部门，启动应急处理程序，防止污染完善防控措施，建立长效管理机制扩散菌种灭活与处置流程高温高压灭活采用℃、分钟的标准高压灭菌程序，确保所有微生物完全死亡对于芽孢菌株，需要延长灭菌时间至分钟以上12115-3060化学灭活处理使用乙醇、次氯酸钠等化学消毒剂处理液体培养物确保消毒剂与菌体充分接触，作用时间不少于分钟75%

0.5%30记录注销程序详细记录灭活处理的时间、方法、操作人员、处理结果等信息在菌种管理系统中标记为已注销状态，更新库存数据废料安全处置将灭活后的菌种按照生物废料管理规定进行分类收集和处置确保不对环境造成二次污染，符合环保要求菌种制备与分装4-6制备周期标准菌种制备周期为小时，包括培养基配制、接种、培养、收获等步骤4-

60.5mL标准分装量液体菌种通常分装毫升每管，固体培养物分装毫升每管

0.51-2100批次规模每批次制备管菌种，满足个月的使用需求100-2003-699%纯度要求制备完成的菌种纯度必须达到以上，无其他微生物污染99%常规保存方法比较保存方法保存期限适用范围技术要求成本投入斜面低温个月多数细菌简单低6-12法液体石蜡年需氧菌中等低2-5法甘油冻存年大部分菌中等中等5-10法种冻干保存年耐干燥菌高高10-30法种液氮保存几十年所有菌种很高很高法斜面低温保存适用范围实施步骤保存条件斜面低温保存法适用于大多数普通细菌制备斜面培养基，接种菌种培养小保存温度为℃，相对湿度控制在18-244±260-的短期保存，特别是实验室常用的大肠时至对数生长期检查纯度后，用石蜡避免频繁开启冰箱门造成温度波70%杆菌、金黄色葡萄球菌等标准菌株该封口或橡胶塞密封，标注菌种信息存动定期检查斜面是否干燥、变色或出方法操作简便，成本低廉，是实验室最放于℃冰箱中，避免光照和温度波动现污染一般每个月传代一次以保持活46常用的保存方法之一力制备斜面培养基

1.常见病原菌保存温度℃•接种纯化菌株•4±

22.工作菌株日常保存湿度•培养至对数期•60-70%

3.教学实验菌种避光保存•密封标识保存•

4.定期传代•液体石蜡覆盖法原理机制隔绝空气创造厌氧环境操作技术无菌石蜡油覆盖培养物长期保存可稳定保存年时间2-5液体石蜡覆盖法通过在培养基表面覆盖一层无菌液体石蜡，形成与空气隔绝的厌氧环境，显著延缓微生物的代谢活动该方法特别适用于需氧菌的中长期保存，操作简便且成本较低石蜡油的覆盖厚度应为毫米，确保完全隔绝空气保存期间应定期检查石蜡层5-10的完整性，防止挥发和污染适用于不产芽孢的细菌，如肠道细菌、葡萄球菌等常见菌种的保存甘油冻存法冷冻保护机制温度控制要求长期稳定性甘油作为冷冻保护剂，能够防保存温度必须维持在℃以在适当条件下可保存年以-305-10止冰晶形成对细胞膜的损伤下，最好在℃温度稳定上，活菌率仍能维持在以-8080%通常配制的甘油浓性是保存成功的关键因素避上定期抽检保存菌株的活力15-20%度，与菌悬液等体积混合甘免反复冻融造成的细胞损伤，和纯度，建立质量监控档案油能够降低冰点，减缓冷冻过每次取用应快速操作是实验室菌种长期保存的首选程中的渗透压变化方法分装管理采用小体积分装，通常为

0.5-毫升每管使用专用冷冻

1.0管，确保密封性良好标签必须耐低温，信息清晰完整建立取用记录，避免重复冻融冻干保存技术预冻阶段将菌悬液快速冷冻至℃以下，形成均匀的冰晶结构添加冷冻保-40护剂如海藻糖、明胶等，提高细胞存活率真空干燥在真空条件下升华除去水分，整个过程保持低温干燥时间通常需要小时，确保残余水分含量低于12-485%密封包装在干燥氮气保护下密封包装，防止吸湿和氧化包装材料必须具有良好的阻湿性能，确保长期保存稳定性长期储存可在常温下保存数十年，是最稳定的菌种保存方法复苏率通常可达到，适合珍贵菌种的永久保存80-95%液氮超低温保存超低温环境设备要求液氮保存温度为℃，在此温需要专用的液氮储存罐、冷冻-196度下微生物的所有生物活动完全盒、冷冻管等设备储存罐必须停止，理论上可以无限期保存定期补充液氮，建立自动监控和这是目前最可靠的长期保存方报警系统设备投资较大，但保法，适用于所有类型的微生物存效果最佳安全措施液氮操作必须严格遵守安全规程，佩戴防护用品防止冻伤储存区域要有良好通风，防止氮气浓度过高造成窒息建立应急处理预案和安全培训制度不同保存方法的选择保存期限需求菌种类型特性短期使用选择斜面法根据菌种耐受性选择个月内斜面保存普通细菌多种方法可选•6•年甘油冻存芽孢菌耐干燥，冻干适宜•1-5•长期保存冻干或液氮脆弱菌株液氮保存最佳••技术条件限制成本效益考虑评估实验室条件平衡投入与效果基础条件斜面保存低成本斜面、石蜡覆盖••一般条件冻存技术中等成本甘油冻存••高级条件冻干液氮高成本冻干、液氮••菌种复苏流程环境准备在无菌操作台内进行复苏操作，紫外灯照射分钟消毒工作台面准备新30鲜培养基、无菌移液器、培养皿等必需用品检查培养箱温度设置，确保培养条件适宜预热培养基至室温，避免温度冲击对细胞造成损伤复苏操作从保存容器中快速取出菌种样品，避免长时间暴露于室温根据保存方法选择适当的复苏程序冻存菌株需快速融化，冻干菌株需缓慢复水接种至新鲜培养基中，轻柔混匀后置于适宜温度培养质量检验复苏后小时内进行纯度检查和活力测定观察菌落形态是否正48常，检查是否有污染征象进行必要的生化鉴定确认菌种特性活力不佳的菌株需要连续传代培养恢复活性，记录复苏成功率质量控制与监测定期抽检计划建立系统性的质量监测计划，根据菌种重要性和保存方法确定检测频率重要菌种每月检查一次，一般菌种每季度检查检测内容包括活力、纯度、形态特征等关键指标生长状态评估通过接种培养观察菌种的生长速度、菌落形态、生物量等指标变化建立标准化的评估方法和判定标准，量化菌种活力水平对比历史数据，分析菌种性能的变化趋势纯度检测方法采用显微镜检查、选择性培养基、分子生物学方法等多种手段确认菌种纯度建立污染识别标准，及时发现并处理纯度问题记录检测结果，建立质量档案监测档案管理详细记录每次质量检测的结果、异常情况、处理措施等信息建立电子化的质量档案系统，便于数据查询和趋势分析定期汇总分析，持续改进质量管理体系保藏时间与变异风险遗传稳定性监控传代频率控制定期检测菌种的遗传标记，监控基因组严格控制菌种传代次数，避免频繁传代1稳定性采用分子指纹图谱、抗性基因导致的遗传漂移建立传代记录系统，检测等方法评估遗传一致性建立基线追踪每个菌株的传代历史原始菌株保数据库，比较分析遗传变异程度存期限一般不超过规定的最大传代数定期更新策略保存条件优化建立菌种更新制度，定期从原始来源重优化保存温度、湿度、培养基成分等条新获取菌株对于重要菌种，建立多点件，减少环境应激对菌种遗传稳定性的备份保存策略制定菌种退役标准，及影响定期评估保存条件的适宜性，及时淘汰老化菌株时调整保存参数标准菌株的作用检验标准参照标准菌株作为质量检验的参照物，确保检测结果的准确性和可比性在药敏试验、消毒效果评价、培养基质量检测等方面发挥基准作用比对鉴定工具通过与标准菌株的特征比较，准确鉴定未知菌株的种属标准菌株具有完整的表型和基因型特征描述，为分类鉴定提供可靠依据仪器设备校准用于校准检测仪器和验证检测方法的准确性通过标准菌株的已知特性，评估检测系统的性能指标，确保检测结果的可靠性质量认证支撑在实验室认证、产品注册、质量体系建设中提供技术支撑标准菌株的使用是、等质量管理体系的重要要求ISO GMP使用与取用流程申请审批使用者需填写菌种使用申请表，明确使用目的、实验内容、预期用量等信息管理员审核申请的合理性和安全性，确认使用者具备相应的操作资质和实验条件无菌取用在无菌操作台内进行菌种取用，严格遵守无菌操作规程使用专用工具取用适量菌种，避免污染原始保存菌株取用过程中保持菌种容器的密封性详细记录记录取用时间、取用人员、取用数量、使用目的等详细信息建立使用台账，追踪菌种的流向和用途每次取用都要有完整的记录和签字确认交叉污染防控严格执行一次性使用原则，避免重复取用造成的交叉污染使用后的器具必须彻底清洗和灭菌建立污染应急处理机制菌种送检与鉴定送检流程管理生化鉴定方法分子鉴定技术建立标准化的送检流程，包括样品制传统的生化鉴定通过糖发酵、酶活性、基于序列分析的分子鉴定是目前最DNA备、包装运输、委托协议等环节选择代谢产物等生理生化特征进行菌种鉴准确的菌种鉴定方法基因测16S rRNA具有资质的检测机构，确保检测结果的定虽然耗时较长，但成本低廉，适合序、全基因组测序等技术能够提供精确权威性和可靠性明确检测项目、技术基础实验室使用现代自动化生化鉴定的分类学信息虽然成本较高，但准确要求和完成时限系统大大提高了效率和准确性性和特异性极佳样品标准化制备糖发酵试验测序•••16S rRNA冷链运输保障酶活性检测多位点序列分析•••委托协议签署代谢产物分析全基因组测序•••结果接收确认自动化鉴定系统基因指纹图谱•••进口与引进菌种管理法规申报要求严格遵守国家相关法规检疫检验程序完成必要的检疫检验本地化保存转入本地菌种库管理进口菌种必须严格遵守《中华人民共和国生物安全法》等相关法规，履行申报、检疫、许可等程序申报材料应包括菌种的详细信息、用途说明、安全性评估等内容检疫部门需对进口菌种进行病原性检测，确认其生物安全等级通过检疫后的菌种应立即转入本地菌种库进行规范化管理，建立完整的保存档案同时要加强对引进菌种使用过程的监管，防止扩散和滥用建立进口菌种的追溯机制，确保来源可查、去向可追微生物质控菌种管理标准化认证定期复核制度专用保存条件质控菌株必须来源于权威机建立质控菌株的定期复核机质控菌株需要更加严格的保构，具有完整的质量证书和制，通常每季度进行一次全存条件，通常采用冻干或液特性描述定期验证其标准面检测包括活力检测、纯氮保存保存环境必须有完特性，确保质控功能的有效度确认、特征验证等项目善的监控和报警系统建立性建立质控菌株的专用档复核结果异常时应立即停用备份保存制度，确保供应的案系统并重新采购连续性质控要求管理严格按照相关标准执行质控程序，记录质控结果并进行统计分析质控数据应纳入实验室质量管理体系，作为检测能力评估的重要依据实验室常见失误与案例管理疏漏示例污染事故分析某实验室因菌种标签脱落导致菌操作环境不洁净、器具消毒不彻株身份混乱，影响了为期三个月底、交叉操作等是导致菌种污染的实验项目另一案例中，管理的主要原因某医院实验室因空员未及时更新菌种状态，导致使调系统故障导致大面积菌种污用了已失活的菌株这些疏漏强染，损失价值数万元的珍贵菌调了标准化管理的重要性株变异与丢失案例频繁传代导致菌株遗传特性发生漂移，影响实验结果的可重现性设备故障造成的菌种丢失也时有发生，如某研究所因冰箱故障损失了多年积累的菌种资源菌种安全与生物安全高致病性菌种级别管理BSL-3/BSL-4中等风险菌种级别防护措施BSL-2低风险菌种基础安全要求BSL-1风险评估体系系统性安全风险分析操作规程制定标准化安全操作程序生物安全管理是菌种管理的核心要素根据菌种的致病性和传播风险，采用相应等级的生物安全防护措施高致病性菌种需要在或实验室中操作，配备负压环BSL-3BSL-4境、过滤系统等专业设备建立完善的人员培训和健康监护制度，确保操作人员的安全制定应急预案，应对可能的生物安全事故HEPA法律法规与国际公约国内法律法规《生物安全法》、《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《微生物菌种保藏管理办法》等构成了我国菌种管理的法律框架这些法规明确了菌种管理的基本要求、责任主体和处罚措施国际公约协议《生物多样性公约》、《卡塔赫纳生物安全议定书》等国际公约规范了微生物资源的国际交流与合作《马德里菌种公约》建立了菌种国际交换的技术标准和程序技术标准规范、实验室生物安全手册等国际标准为菌种管理提供了技术指导国ISO20387WHO家标准等规定了实验室生物安全的具体要求GB19489合规管理要求各单位必须建立健全的合规管理体系，定期进行合规性审查违反法规要求将面临行政处罚、刑事责任等法律后果加强法律法规培训，提高管理人员的合规意识知识产权与使用协议分发使用协议成果归属约定明确菌种分发的条件、用途限制、责任明确使用菌种产生的研究成果、发明专归属等关键条款协议应涵盖使用范利、商业化产品等的知识产权归属建围、传递限制、保密要求等内容建立立合理的利益分享机制，保护各方的合标准化的协议模板，确保法律条款的完法权益整性专利菌株管理保密信息保护对于已申请专利或具有商业价值的菌建立健全的保密制度，保护菌种相关的株，实施更加严格的管理措施建立专技术秘密和商业信息签署保密协议，门的许可制度，规范专利菌株的使用和规范信息披露和使用行为转让。