《生物分子提取》课件

生物分子提取专题课件本课程专为本科及研究生生物科学相关专业设计，深入探讨生物分子提取的理论基础与实践技术课程内容涵盖蛋白质、核酸、多糖、脂类等主要生物分子的提取原理、方法选择与操作技巧，结合经典教材知识与前沿技术发展课程目录与学习目标1基础理论模块掌握生物分子分类、提取原理和基本实验流程设计2技术方法模块学习蛋白质、核酸、多糖、脂类的专门提取技术3分离纯化模块熟悉层析、电泳、萃取等分离纯化基本方法实践应用模块生物分子提取绪论生物分子定义与分类提取技术意义生物分子是构成生命体的基本化学成分，主要包括蛋白质、核生物分子提取是生命科学研究的基础技术，广泛应用于医药开酸、多糖和脂类四大类每类分子具有独特的结构特征和生物功发、食品工业、环境监测等领域掌握科学的提取方法，对于获能，在细胞内分布位置不同，因此需要采用相应的提取策略得高质量的生物分子样品，确保后续分析检测的准确性具有重要意义生物分子种类与提取目的蛋白质核酸酶活性研究、结构分析、功能验证基因克隆、测序分析、分子诊断膜蛋白与可溶性蛋白完整性保持••DNA•酶活性保持•RNA防降解处理•纯度与得率平衡•纯度检测标准脂类多糖膜结构研究、营养分析、代谢研究生物活性研究、食品添加、药物开发•极性与非极性3•结构多样性•氧化敏感性•水溶性特征•溶剂选择性•分子量分布生物分子提取的重要意义科学研究基础生物分子提取是生命科学研究的起点，为蛋白质功能研究、基因表达分析、代谢组学研究等提供高质量样品只有获得纯净的目标分子，才能确保后续实验结果的可靠性和重现性医药产业应用在药物开发中，需要提取和纯化活性蛋白、多糖等生物大分子作为药物候选物生物分子提取技术直接影响药物的纯度、活性和安全性，是生物制药产业的核心技术之一食品与环境领域食品工业中需要提取天然抗氧化剂、功能性多糖等成分环境监测中通过提取环境样品中的进行微生物群落分析这些应用都依赖于DNA高效的生物分子提取技术提取的基本原理溶解性原理相似相溶原理是生物分子提取的基础•极性分子溶于极性溶剂•非极性分子溶于非极性溶剂•两性分子需特殊考虑细胞结构分析了解目标分子的细胞内定位•细胞壁破碎策略•细胞膜通透性•细胞器分离技术分配平衡建立合适的分配系数实现分离•液液分配•固液分配•气液分配提取策略与流程设计1样品分析分析目标分子的理化特性，包括分子量、等电点、稳定性、溶解性等关键参数，为选择适宜的提取方法提供依据2方法选择根据分子特性选择破碎方法、提取溶剂、操作条件等考虑分子稳定性，平衡提取效率与活性保持的关系3条件优化通过正交实验或响应面法优化、温度、时间、溶剂比例等关键参pH数，建立最佳提取工艺条件4质量评估建立完善的质量评估体系，包括得率测定、纯度分析、活性检测等，确保提取效果达到预期目标细胞破碎方法综述物理破碎法化学破碎法•匀浆法高速剪切破碎细胞壁•酶解法特异性酶破坏细胞壁•超声波空化效应破坏细胞结构•表面活性剂破坏膜脂双分子层•冷冻融化冰晶形成破坏膜结构•渗透压细胞膨胀破裂•高压均质瞬间压力变化破碎•酸碱处理改变膜蛋白构象方法选择原则•根据细胞类型选择破碎方法•考虑目标分子的稳定性平衡破碎效率与分子活性••综合成本与操作便利性蛋白质提取基础蛋白质分布分析蛋白质在细胞内分布广泛，包括可溶性蛋白、膜蛋白、核蛋白等不同类型蛋白质的提取策略差异显著，需要根据目标蛋白的性质选择合适的提取方法可溶性蛋白相对容易提取，而膜蛋白则需要使用表面活性剂或有机溶剂样品前处理要点样品新鲜度直接影响蛋白质提取效果需要在低温条件下快速处理样品，加入蛋白酶抑制剂防止蛋白降解对于植物样品，还需要去除多酚、多糖等干扰物质动物组织样品需要充分匀浆破碎提取环境控制蛋白质提取过程中需要严格控制温度、和离子强度低温操作可pH以保持蛋白质活性，适宜的范围避免蛋白质变性，合适的离子强pH度有利于蛋白质溶解整个过程需要在无菌条件下进行典型蛋白质提取实例动物组织蛋白提取微生物蛋白提取以肝脏组织为例，首先将新鲜肝脏组织在冰浴中快速切碎，加入细菌和酵母细胞具有较厚的细胞壁，需要更强烈的破碎方法可含有蛋白酶抑制剂的提取缓冲液使用组织匀浆机充分破碎组以使用超声波破碎、高压均质或酶解法对于革兰氏阳性细菌，织，然后在条件下离心分离，收集上清液即可获得可溶性蛋可先用溶菌酶处理细胞壁，再进行物理破碎4°C白酵母细胞可以使用玻璃珠振荡破碎或液氮研磨法破碎后的细胞整个过程需要严格控制温度，避免蛋白质降解缓冲液的选择对悬液需要离心去除细胞碎片，获得含有蛋白质的上清液提取效果至关重要，通常使用磷酸缓冲液或缓冲液Tris蛋白质溶剂选择策略缓冲液系统维持适宜和离子强度pH盐溶液调节影响蛋白质溶解性和稳定性表面活性剂用于膜蛋白的溶解提取酶解辅助特异性破坏细胞壁结构保护剂添加防止蛋白质氧化和降解盐溶盐析分离技术盐溶现象盐析分离低盐浓度下，盐离子与蛋白质表面的荷随着盐浓度增加，蛋白质分子表面的水电基团结合，增加蛋白质的溶解度这化层被破坏，蛋白质分子间相互作用增种现象称为盐溶效应，有利于蛋白质从强，导致蛋白质析出沉淀硫酸铵是最细胞或组织中溶出常用的盐析试剂溶解回收分级沉淀沉淀的蛋白质可以用低盐缓冲液重新溶通过控制盐浓度梯度，可以实现不同蛋解，去除多余的盐分通过透析或凝胶白质的分级沉淀先用低浓度盐析去除过滤进一步纯化，获得所需的蛋白质样杂蛋白，再用高浓度盐析目标蛋白质，品实现初步纯化蛋白质提取参数优化4°C最适提取温度低温操作保持蛋白质活性和结构稳定性

7.4生理pH范围维持蛋白质天然构象，避免变性失活2-4h提取时间控制充分提取与防止降解的平衡时间窗口1mM抑制剂浓度PMSF等蛋白酶抑制剂的有效工作浓度核酸提取基础知识特性特性细胞定位样品准备DNA RNA双链螺旋结构稳定，耐酸单链结构不稳定，易被需要破碎细胞壁和核膜才能快速冷冻保存，防止核酸酶RNA碱，主要位于细胞核和线粒酶降解，分布于细胞质和核释放核酸分子到溶液中降解，保持分子完整性体中中提取经典方法DNA1细胞裂解使用含的裂解液破坏细胞膜和核膜，释放到溶液中加入蛋SDS DNA白酶降解与结合的蛋白质，去除蛋白质干扰K DNA2苯酚抽提加入等体积的苯酚氯仿混合液，充分振荡混合苯酚可以使蛋白质变性沉淀，留在水相中，实现与蛋白质的分离DNA DNA3相分离离心后形成明显的两相分层，上层水相含有，下层有机相含有变DNA性蛋白质小心吸取上层水相，避免污染4DNA沉淀向水相中加入倍体积的无水乙醇和体积的醋酸钠，混匀后在21/103M放置过夜，使完全沉淀析出-20°C DNA提取关键技术RNA污染防控RNase使用处理所有器具和试剂，建立无环境DEPC RNase冷链操作系统全程低温操作，样品保存在液氮或冰箱中-80°C快速提取流程减少暴露时间，快速完成提取和纯化过程RNA分子极易被酶降解，因此提取需要建立严格的无酶环境所有的器具、试剂都需要用处理或高温高压灭菌RNA RNA RNARNADEPC操作过程中要戴手套，避免皮肤接触样品提取得到的应立即进行反转录或保存在条件下RNA-80°C核酸纯化质量评估核酸提取常见问题与解决蛋白质污染苯酚残留盐分干扰A260/A280比值偏低表明蛋白苯酚残留会影响后续实验，表A260/A230比值偏低提示盐分质污染解决方法包括增加蛋现为280nm吸收异常可以用或多糖污染可以通过乙醇洗白酶K处理时间、多次苯酚抽提、氯仿再次抽提去除苯酚，或者涤、透析或使用商业化的核酸使用RNA酶A去除RNA污染使用乙醚挥发残留的有机溶剂纯化柱去除注意乙醇洗涤时严重时可以使用蛋白质沉淀剂确保最后一次抽提使用纯氯仿要使用70%乙醇，避免DNA溶或离子交换层析进一步纯化解降解问题DNA降解通常由DNase污染引起，RNA降解由RNase引起预防措施包括使用EDTA螯合金属离子、添加酶抑制剂、严格无菌操作、快速处理样品等多糖分子提取概述多糖结构特点细胞内分布多糖是由多个单糖分子通过糖苷键连接形成的大分子化合物具植物多糖主要存在于细胞壁中，如纤维素、半纤维素和果胶细有高分子量、强亲水性、结构多样性等特点不同来源的多糖具胞质中含有淀粉等储存性多糖微生物多糖分布在细胞壁、细胞有不同的单糖组成、连接方式和分支结构，决定了其独特的生物膜和胞外基质中动物多糖主要是糖原，存储在肝脏和肌肉中活性多糖分子通常具有良好的水溶性，但溶解速度较慢部分多糖具不同部位的多糖提取难度差异很大，细胞壁多糖需要更强烈的提有凝胶特性，在提取过程中可能形成高粘度溶液，影响分离效取条件胞外多糖相对容易提取，而细胞壁多糖通常需要酶解辅果助热水提取法技术温度控制95-100°C高温水浴，促进多糖溶解•破坏细胞壁结构•增强分子运动•提高溶解速率时间优化连续提取2-4小时，多次重复提取•第一次提取2小时•第二次提取

1.5小时•合并提取液浓缩过滤分离趁热过滤除去不溶性杂质•使用多层纱布过滤•离心去除细胞碎片•澄清透明提取液浓缩处理减压浓缩至原体积的1/4-1/5•避免高温破坏结构•控制浓缩速度•准备醇沉步骤酶解辅助提取技术纤维素酶系统蛋白酶处理针对植物细胞壁中的纤维素成分，使用去除与多糖结合的蛋白质，常用木瓜蛋纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的复合白酶、胰蛋白酶等在酶解多糖之前先酶系统酶解条件通常为pH

4.5-

5.0，用蛋白酶处理，可以提高后续多糖的纯温度45-50°C，处理时间2-4小时度和得率•提高多糖溶出率•优化pH和温度条件•减少机械损伤•控制酶解时间•保持生物活性•防止过度水解工艺参数优化酶浓度、温度、pH、时间等参数需要根据具体样品和目标多糖进行优化通过正交实验设计确定最佳工艺条件，平衡得率与成本的关系•单因素实验筛选•正交实验优化•验证实验确认多糖醇沉分析与分离1醇沉原理多糖在高浓度乙醇中溶解度急剧下降，形成白色絮状沉淀乙醇浓度通常控制在75-85%，低于此浓度沉淀不完全，高于此浓度可能共沉淀其他杂质2操作要点向浓缩的多糖提取液中缓慢加入3-4倍体积的无水乙醇，边加边搅拌在4°C条件下静置12-24小时，使沉淀完全析出沉淀颗粒大小与搅拌速度相关3分离纯化用离心或过滤收集沉淀，用75%乙醇洗涤2-3次去除杂质最后用无水乙醇和乙醚洗涤，真空干燥得到粗多糖纯度可达70-85%4质量评估测定多糖含量、蛋白质含量、灰分含量等指标评估纯度通过HPLC分析单糖组成，IR光谱分析结构特征分子量测定了解多糖聚合度脂类分子提取概述极性脂类中性脂类磷脂、糖脂等甘油三酯、胆固醇酯•极性溶剂提取•非极性溶剂提取•甲醇氯仿体系1•己烷石油醚体系•膜结构组分•储能分子检测方法提取策略脂类组分分析混合溶剂系统•薄层层析定性•Folch法经典方案•气相色谱定量•Bligh-Dyer改良方法•质谱结构鉴定•溶剂极性调节有机溶剂萃取系统经典方法Folch使用氯仿甲醇体系进行脂类全提取这是最经典的脂类提取方法，适2:1用于各种生物样品氯仿溶解非极性脂类，甲醇溶解极性脂类，两者配合可以提取几乎所有脂类成分操作简单，重现性好改良法Bligh-Dyer针对水分含量高的样品，使用氯仿甲醇水体系该方法降低1:2:

0.8了有机溶剂用量，提高了提取效率，特别适合新鲜组织和细胞样品形成的两相分层更加清晰，操作更加方便相分离与收集萃取后的混合液通过加水或盐溶液形成两相分层下层氯仿相含有脂类，上层甲醇水相含有极性化合物小心分离两相，收集氯仿相并用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发去除溶剂得到脂类脂质氧化防护技术惰性气体保护全程氮气环境操作低温条件控制4°C以下温度提取和保存抗氧化剂添加BHT、维生素E等保护剂避光操作使用棕色瓶避免光照氧化快速处理减少脂质暴露时间不饱和脂肪酸极易发生氧化反应，产生醛酮等有害物质，影响脂质的生物活性和营养价值因此脂类提取过程中必须采取严格的抗氧化措施，确保提取产物的质量和稳定性脂类分离纯化技术固相萃取硅胶柱分离不同极性脂类组分薄层层析快速分离鉴定脂类种类银离子层析根据不饱和度分离脂肪酸分子筛层析按分子大小分离脂类化合物脂类的分离纯化需要根据目标化合物的性质选择合适的方法固相萃取可以快速分离不同极性的脂类，薄层层析适合定性分析，银离子层析专门用于分离不同不饱和度的脂肪酸，分子筛层析则按分子大小进行分离小分子代谢物提取酚类化合物生物碱类挥发油成分花青素、单宁、黄酮类等抗氧具有生理活性的含氮化合物，萜类、芳香族等挥发性成分，化成分，多存在于植物细胞液如咖啡因、尼古丁等多数生具有特殊香味和生物活性由泡中提取时需要破坏细胞壁物碱呈碱性，可以与酸形成盐于易挥发，提取时需要低温操和液泡膜，常用乙醇水溶液或类提取时先用酸性溶液提作或使用水蒸气蒸馏法也可甲醇提取pH对提取效果影取，再用碱性条件转化为游离以使用超临界CO2萃取，避免响很大，酸性条件有利于酚类碱，最后用有机溶剂萃取有机溶剂残留稳定糖苷类化合物由苷元和糖基结合形成的化合物，如皂苷、强心苷等水溶性较好，但稳定性差，易被酶水解提取时需要快速操作，使用沸水或含酶抑制剂的溶剂提取分离纯化基本原理物理分离方法化学分离方法基于分子大小、密度、溶解性等物理性质差异进行分离沉淀法利用分子间化学性质差异，如酸碱性、氧化还原性、络合能力等利用溶解度差异，离心法利用密度差异，过滤法利用粒径差异，进行分离萃取法利用在不同相中的分配系数差异，离子交换利膜分离法利用分子大小差异这些方法操作简单，成本较低用电荷差异，络合分离利用配位能力差异•酸碱萃取分离•重力沉降与离心分离•络合沉淀法•微滤、超滤、反渗透•氧化还原分离•结晶与重结晶层析分离技术概览纸层析技术最简单的层析方法，利用纸张作为固定相，适合小分子化合物的定性分析操作简便，成本低廉，但分离效果有限，主要用于教学和初步分析薄层层析使用硅胶板作为固定相，分离效果优于纸层析可以进行定性定量分析，操作快速，适合多样品并行分析广泛用于脂类、生物碱等小分子化合物分离离子交换层析基于离子交换原理分离带电分子，特别适合蛋白质和核酸的分离纯化可以通过改变pH和盐浓度控制分离效果，分辨率高，载量大凝胶过滤层析根据分子大小进行分离，又称分子筛层析大分子先洗脱，小分子后洗脱适合蛋白质分子量测定和脱盐纯化，条件温和，不影响生物活性电泳分离技术应用琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳毛细管电泳主要用于和的分离分析琼脂糖凝分辨率高于琼脂糖凝胶，主要用于蛋白质分高效分离技术，分辨率极高，样品用量少DNA RNA胶具有较大的孔径，适合大分子核酸的分离可以使蛋白质变性，按分子适合小分子化合物、多肽、蛋白质的高精度SDS-PAGE离可以根据分子大小分离不同长度的量分离保持蛋白质天然结分析可以进行手性分离、离子分析等特殊DNA Native-PAGE片段，常用于产物检测、质粒分析构，按电荷和大小分离应用PCR DNA等•浓缩胶和分离胶系统•毛细管材质选择•DNA分子量标准对照•蛋白质标准品选择•电泳条件优化•电泳缓冲液选择•染色和检测方法•检测器类型选择•凝胶浓度优化萃取分离方法详解溶剂选择萃取操作根据目标化合物的极性选择合适的萃取将样品溶液与萃取溶剂充分混合，通过溶剂极性化合物用极性溶剂，非极性振荡或搅拌增加两相接触面积萃取时化合物用非极性溶剂溶剂与水的互溶间和振荡强度影响萃取效率，但过度操性要小，密度差异要大，便于分层作可能形成乳化相分离溶剂回收停止搅拌后静置分层，必要时进行离心萃取完成后需要去除有机溶剂，通常采分离分离时要避免机械夹带，确保两3用旋转蒸发或氮气吹干溶剂可以回收相完全分离可以多次萃取提高回收再利用，降低成本并减少环境污染率影响提取效率的关键因素样品新鲜度新鲜样品中目标分子含量高，酶活性强•采集后立即处理或冷冻保存•避免长时间室温放置•选择最佳采收时间•建立标准化采样流程缓冲体系选择维持适宜的pH环境保护分子稳定性•磷酸缓冲液适用范围广•Tris缓冲液用于蛋白质提取•柠檬酸缓冲液用于酸性条件•缓冲容量要足够离子强度调节适当的盐浓度影响分子溶解和稳定•低盐条件促进蛋白质溶解•高盐条件用于盐析分离•EDTA螯合金属离子•避免盐浓度过高结晶温度对提取效率的影响机械力对提取过程的促进20kHz超声频率超声波空化效应破坏细胞壁提高提取效率300rpm最适搅拌速度适度搅拌促进传质过程避免机械损伤30min处理时间超声辅助提取的最佳时间窗口2-5°C温升控制机械处理过程中的温度上升范围与离子强度的协同调节pH测定与调节pH使用精密计监测溶液酸碱度pH离子强度计算根据盐浓度计算溶液离子强度协同优化平衡溶解性与稳定性要求和离子强度是影响生物分子稳定性和溶解性的两个关键因素蛋白质在等电点附近溶解度最低，远离等电点时溶解度增加适当的pH离子强度有助于维持蛋白质的天然构象，但过高的离子强度可能导致盐析现象需要通过实验确定最佳的和离子强度组合pH。