《生物化学实验教程》课件

生物化学实验教程本教程全面介绍生物化学实验的基础理论与应用技术，专为医学及生物学专业学生精心设计课程涵盖从基础实验操作到高级分子生物学技术的完整实验体系，帮助学生掌握现代生物化学研究的核心技能教程注重理论与实践相结合，通过个学时的系统训练，培养学生的科学思50维能力和实验操作技能每个实验都配有详细的操作指导和安全规范，确保学生能够安全、高效地完成各项实验任务，为未来的科研工作奠定坚实基础课程概述1实验重要性生化实验是连接理论知识与实际应用的重要桥梁，通过动手操作加深对生物分子结构与功能的理解，培养严谨的科学态度和创新思维能力2安全操作建立完善的实验室安全意识，掌握化学品安全使用、生物安全防护等基本规范，确保实验过程中人员和环境的安全3数据处理学习科学的实验数据分析方法，包括统计学原理应用、图表制作、结果解读等核心技能，提高实验结果的可靠性和科学性4课时安排个实验课时的系统设计，涵盖基础操作、蛋白质技术、酶学研究、核酸分50析等多个重要领域，循序渐进地提升实验技能第一章生化实验基本操作安全规范仪器使用溶液配制掌握实验室安全操熟练掌握常用生化学习标准溶液配制作的基本要求，包仪器的操作方法，的基本原理和操作括个人防护设备使如分光光度计、离技术，包括浓度计用、化学品安全处心机、电泳装置等算、调节、缓pH理、应急处理程序设备的正确使用和冲液制备等核心技等关键内容维护能无菌操作掌握无菌操作的基本要点和技术规范，为后续的细胞培养和分子生物学实验奠定基础生化实验室安全规范化学品安全管理建立完善的化学品分类存储系统，易燃、易爆、腐蚀性化学品需分类保存使用前仔细阅读安全数据表（SDS），了解化学品的危险特性和防护要求配备相应的个人防护设备，包括实验服、护目镜、防护手套等生物安全防护建立分级生物安全管理制度，根据实验材料的生物安全等级采取相应防护措施微生物培养操作必须在生物安全柜内进行，废弃物品需经高温灭菌处理工作人员需接受专业的生物安全培训危险因素识别识别实验过程中的潜在危险因素，包括化学烧伤、生物感染、电击伤害、机械伤害等建立风险评估机制，制定针对性的预防措施和应急预案定期进行安全检查和隐患排查应急处理程序制定完善的实验室紧急情况处理流程，包括化学品泄露、火灾、人员受伤等应急预案设置应急设备如洗眼器、安全淋浴、灭火器等建立24小时应急联系机制，确保紧急情况下能够及时有效处理常用仪器使用方法分光光度计离心机技术分光光度计是生化实验中最常用的检测仪器，基于朗伯比尔定离心机通过高速旋转产生离心力分离不同密度的物质使用前检-律测定样品在特定波长下的吸光度实验前需用空白对照校零，查转子平衡，确保样品管对称放置根据分离目的选择适当的离选择合适的比色皿，确保光路畅通心速度和时间，一般细胞分离用，细胞器分离1000-3000rpm需以上10000rpm操作时注意比色皿的清洁和正确放置，避免指纹污染透光面根据待测物质的吸收特性选择最佳检测波长，一般蛋白质在操作过程中严禁打开离心机盖，等待完全停止后再取出样品定，核酸在有最大吸收期维护转子，检查是否有裂纹或变形，确保实验安全和结果准确280nm260nm性溶液配制技术缓冲溶液原理浓度换算方法缓冲溶液由弱酸及其共轭碱组掌握摩尔浓度（）与质量浓mol/L成，能够抵抗变化度（）之间的换算关系摩尔pH g/L方程描浓度等于质量浓度除以分子量Henderson-Hasselbalch述了缓冲系统的与各组分浓度配制溶液时需考虑溶质的纯度和pH的关系常用缓冲系统包括磷酸含水量，准确计算所需试剂用缓冲液（）、缓量稀释计算遵循公pH

6.8-

8.0Tris C1V1=C2V2冲液（）等缓冲容式pH

7.0-

9.0量在范围内最大pKa±1标准溶液制备标准溶液的制备需要高精度的分析天平和容量瓶基准物质应具有高纯度、稳定性好、分子量大等特点配制过程包括称量、溶解、转移、定容等步骤，每步都需严格控制误差，确保最终浓度的准确性第二章蛋白质实验技术蛋白提取定性定量采用物理和化学方法破碎细胞，释放胞内蛋白质常用方法使用Bradford法、BCA法等方法测定蛋白质浓度SDS-包括超声破碎、冻融循环、去垢剂处理等，需要添加蛋白酶PAGE电泳分析蛋白质分子量和纯度Western blot检测特抑制剂防止降解定蛋白质的表达分离纯化功能研究根据蛋白质的理化性质差异进行分离，包括盐析、离子交通过酶活性测定、蛋白质相互作用、结构分析等方法研究蛋换、凝胶过滤、亲和层析等技术选择合适的分离策略可显白质的生物学功能结合生物信息学分析预测蛋白质功能域著提高纯化效率和结构特征实验一蛋白质定量测定法应用法操作Bradford BCA考马斯亮蓝染料与蛋白质结合后基于双缩脲反应原理，蛋白质在碱性条G-250吸收峰从转移至，颜色件下与结合，将其还原为，465nm595nm Cu²⁺Cu⁺由棕色变为蓝色该方法快速简便，线与试剂形成紫色络合物在Cu⁺BCA性范围，对大多数蛋白处测定吸光度，线性范围更宽，

0.05-

0.5mg/ml562nm质响应良好耐受性更好数据分析处理标准曲线制作根据标准曲线方程计算未知样品的蛋白使用牛血清白蛋白（）作为标准蛋BSA质浓度进行三次独立重复实验，计算白，配制系列浓度梯度平行测定每个平均值和标准偏差分析可能的误差来浓度点的吸光度值，绘制浓度吸光度标-源，提出改进措施准曲线，计算回归方程和相关系数法蛋白定量Bradford染料结合机理考马斯亮蓝G-250染料在酸性条件下主要以阳离子形式存在，与蛋白质中的碱性氨基酸残基（主要是精氨酸、组氨酸、赖氨酸）结合结合后染料分子构象发生改变，吸收光谱发生显著位移光谱特性变化自由染料在465nm处有最大吸收峰，呈棕红色与蛋白质结合后，吸收峰红移至595nm，溶液呈现稳定的蓝色这种光谱变化与蛋白质浓度呈线性关系，为定量检测提供基础检测范围优化Bradford法的线性检测范围为

0.05-

0.5mg/ml，超出此范围准确性下降低浓度样品可适当浓缩，高浓度样品需稀释至线性范围内反应在室温下进行，5分钟内完成显色干扰因素控制去垢剂、高盐浓度、某些缓冲液成分可能影响测定结果SDS浓度超过

0.1%会产生显著干扰样品中含有酚类化合物也会影响显色反应，需要相应的空白对照法蛋白定量BCA双缩脲反应蛋白质肽键与Cu²⁺络合还原反应Cu²⁺被还原为Cu⁺离子显色络合Cu⁺与BCA形成紫色络合物标准曲线建立浓度-吸光度关系浓度计算562nm测定未知样品浓度BCA法基于蛋白质在碱性条件下与铜离子的双缩脲反应，具有更宽的线性范围和更好的重现性该方法对去垢剂和还原剂的耐受性较强，适用于含有这些物质的样品检测反应需要在37°C孵育30分钟或室温孵育2小时，显色稳定，可在1小时内完成测定实验二乙酸纤维素薄膜电泳电泳原理带电粒子在电场中的迁移现象，迁移速率取决于电荷量、分子大小和电场强度样品处理血清样品稀释至适当浓度，去除脂质和其他干扰物质，确保样品清澈透明条件优化选择合适的缓冲液值、电压和电泳时间，确保蛋白质充分pH分离乙酸纤维素薄膜电泳是分离血清蛋白质的经典方法，能够将血清蛋白分离为白蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白和球蛋白五α1-α2-β-γ-个主要组分该技术操作简便，结果直观，广泛应用于临床检验和蛋白质分析领域通过分析各蛋白组分的相对含量变化，可以诊断多种疾病状态电泳分离蛋白质原理等电点概念支持介质选择蛋白质净电荷为零的值载体材料的重要特性pH低于等电点时带正电荷孔径大小均一••高于等电点时带负电荷化学性质稳定••影响电泳迁移方向电渗透作用小••常见问题排除电场强度影响影响实验结果的因素决定分离效果的关键因素样品浓度过高导致拖尾电压过低分离不充分••缓冲液离子强度不当电压过高产生热效应••薄膜处理不当影响分离最适条件需要优化••电泳实验步骤

8.65-10μl缓冲液上样量pH维生素-盐酸缓冲系统，确保蛋白质适当带电血清样品最适上样体积，避免过载影响分离分钟120V45电泳电压电泳时间恒定电压条件，平衡分离效果与实验时间充分分离各蛋白组分的最佳时间参数电泳实验的成功关键在于严格控制各项操作参数缓冲液配制需要精确的pH控制，使用pH

8.6的巴比妥-巴比妥钠缓冲液样品上样时需均匀涂布，避免产生不规则条带电泳过程中保持恒定电压，防止因热效应导致的蛋白质变性染色使用考马斯亮蓝R-250，染色后用脱色液去除背景，直至条带清晰可见第三章酶学实验酶活性测定通过测定单位时间内底物消耗或产物生成的量来评价酶活性选择合适的底物和检测方法，控制反应条件如温度、pH、离子强度等，确保酶促反应在线性范围内进行影响因素研究系统研究温度、pH、底物浓度、抑制剂等因素对酶活性的影响通过单因素变量实验确定最适反应条件，了解酶的性质特点和稳定性，为酶的应用提供理论依据动力学参数测定酶的米氏常数Km和最大反应速率Vmax等重要动力学参数通过Lineweaver-Burk双倒数作图法或非线性回归分析确定参数值，揭示酶与底物的亲和力和催化效率实验三酶特异性研究底物特异性设计选择结构相似但功能基团不同的多种底物，设计对照实验验证酶的底物特异性每种底物设置相同浓度和反应条件，确保实验结果的可比性活性比较分析测定酶对不同底物的催化活性，计算相对酶活性以最适底物的酶活性为，比较其他底物的相对活性，绘制底物特异性图谱100%结果解释方法结合酶的三维结构和底物结合位点特征，分析底物特异性的分子机理解释不同底物活性差异的原因，预测酶的生理功能和代谢意义误差控制策略设置空白对照和阴性对照，排除非特异性反应的干扰多次重复实验，计算统计学参数，评估实验结果的可靠性和重现性影响酶活性的因素影响因素测试范围最适条件影响机理温度影响分子运动和10-80°C37-40°C蛋白构象值影响活性位点电pH

3.0-

10.

07.0-

8.5离状态底物浓度饱和浓度遵循米氏方程动

0.1-10Km力学抑制剂竞争性非竞争性无抑制剂改变或/Km值Vmax酶活性受多种环境因素影响，其中温度和是最重要的两个因素温度升高可以增加pH分子运动速率，提高酶与底物的碰撞频率，但过高温度会导致酶蛋白变性失活的pH变化影响酶活性位点氨基酸残基的电离状态，改变酶与底物的结合能力底物浓度的影响遵循米氏方程，当底物浓度远大于值时，酶接近饱和状态Km温度对酶活性的影响对酶活性的影响pH通过影响酶分子和底物分子的电离状态来调节酶活性酶的活性位点通常含有可电离的氨基酸残基，如组氨酸、半胱氨酸、天冬氨pH酸等，这些残基的电离状态直接影响酶与底物的结合和催化反应的进行每种酶都有其特定的最适范围，在此范围内酶的活性位点pH保持最佳的电离状态和空间构型偏离最适范围时，不仅影响活性位点的催化能力，还可能改变酶的整体构象，导致活性下降甚至pH完全失活实验四碱性磷酸酶提取酶的来源特性提取缓冲系统碱性磷酸酶广泛存在于动物组织中，以肝脏、肾脏、肠道含量最使用的缓冲液作为提取缓冲液，添加pH

8.0Tris-HCl1mM高该酶是锌金属酶，最适为，在碱性条件下催化和维持酶活性缓冲液中加入蛋白酶抑制pH

9.0-

10.5MgCl₂

0.1mM ZnCl₂磷酸单酯的水解反应剂防止蛋白质降解PMSF不同组织来源的碱性磷酸酶具有不同的同工酶形式，电泳迁移率有机溶剂如丁醇可用于沉淀去除脂质和其他杂质，提高酶的纯和热稳定性存在差异临床上常用于肝功能和骨代谢的检测指度整个提取过程需在低温条件下进行，防止酶失活4°C标碱性磷酸酶提取步骤组织匀浆冰浴条件下匀浆处理差速离心离心分钟分离10,000g20盐析分离硫酸铵分级沉淀30-60%透析纯化透析除盐小时4°C16碱性磷酸酶提取需要严格控制温度和条件组织匀浆时加入等体积的提取缓冲液，使用pH匀浆器在冰浴中处理分钟差速离心去除细胞碎片和细胞核，上清液含有可溶性酶蛋2-3白硫酸铵分级沉淀是常用的蛋白质初步纯化方法，饱和度范围内可以沉淀大部30-60%分碱性磷酸酶最后通过透析去除小分子盐类，获得相对纯化的酶制备实验五碱性磷酸酶比活性测定比活性定义底物法原理反应条件控制比活性是指单位质量蛋白质的使用对硝基苯磷酸（pNPP）反应在37°C、pH

10.0的碳酸酶活性，单位为U/mg蛋白作为人工底物，在碱性条件下钠-碳酸氢钠缓冲液中进行质它反映酶制备的纯化程被碱性磷酸酶水解产生对硝基严格控制反应时间，确保在酶度，比活性越高表示酶的纯度苯酚，在405nm处有强烈吸促反应的线性期内测定初速越好，是评价酶纯化效果的重收，可用分光光度法定量检度，避免底物耗尽或产物抑要指标测制数据处理分析根据吸光度变化计算酶活性，结合蛋白质含量测定结果计算比活性进行统计分析，计算标准偏差和变异系数，评价实验结果的精密度和准确性比活性测定方法蛋白质含量测定酶活性单位定义摩尔消光系数应用采用法测定酶制备中的总蛋一个酶活性单位（）定义为在特定条对硝基苯酚在处的摩尔消光系Bradford U405nm白质含量使用牛血清白蛋白作为标件下每分钟催化产生产物所需数根据1μmolε=

18.5×10³L·mol⁻¹·cm⁻¹准蛋白，绘制标准曲线准确移取酶的酶量对于碱性磷酸酶，即每分钟朗伯比尔定律，可以从吸光度-A=εbc样品，加入试剂，在水解对硝基苯磷酸产生对变化计算产物的摩尔浓度变化，进而Bradford595nm1μmol1μmol处测定吸光度，根据标准曲线计算蛋硝基苯酚的酶量温度，计算酶活性光径长度通常为37°C1cm白质浓度pH

10.0实验六碱性磷酸酶测定Km定义意义Km米氏常数Km是反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度，表示酶对底物的亲和力Km值越小，酶与底物亲和力越强，在较低底物浓度下即可达到较高活性双倒数作图Lineweaver-Burk方程将米氏方程转化为线性关系1/v=Km/Vmax1/[S]+1/Vmax以1/[S]为横坐标，1/v为纵坐标作图，直线斜率为Km/Vmax，纵截距为1/Vmax底物浓度设计设计6-8个不同的底物浓度点，范围涵盖

0.05-

2.0mM浓度点应在Km值附近分布较密，低浓度和高浓度区域各设置2-3个点，确保能准确确定Km和Vmax值4生物学意义Km值反映酶在生理条件下的工作状态当细胞内底物浓度接近Km值时，酶活性对底物浓度变化敏感，便于调节代谢流不同底物的Km值差异反映酶的底物特异性酶动力学参数测定

0.05-

2.0mM底物浓度范围涵盖从低浓度到饱和浓度的完整范围，确保能观察到完整的米氏动力学曲线°37C反应温度人体生理温度条件，pH

9.0碳酸钠缓冲液，模拟酶的生理工作环境

0.95线性相关系数双倒数作图的相关系数应大于

0.95，确保线性回归分析结果的可靠性值Km亲和力参数从直线斜率和截距计算得出，反映酶与底物结合的紧密程度和催化效率酶动力学参数测定需要精确控制实验条件和数据处理方法初速度测定在反应开始后的线性期内进行，通常在前2-5分钟内每个底物浓度点都需要做平行重复，计算平均值数据处理时可以采用多种线性化方法，如Lineweaver-Burk图、Hanes图或Eadie-Hofstee图，相互验证结果的准确性现代分析软件也可以直接进行非线性回归分析，获得更准确的参数值第四章糖代谢实验代谢途径糖原代谢糖酵解过程储存与释放25%30%葡萄糖分解产能糖原合成过程••丙酮酸生成途径糖原分解调节••合成机制血糖平衡维持•ATP•关键酶类运动影响调节机制代谢调节20%25%己糖激酶活性肌肉糖原消耗••磷酸果糖激酶胰岛素敏感性••丙酮酸激酶糖异生激活••实验七肝糖原的提取与鉴定1糖原结构功能肝糖原是由葡萄糖单位通过α-1,4糖苷键连接形成的分支状多糖，分子量可达10⁶Da作为重要的储能物质，在维持血糖稳定中发挥关键作用，可快速动员释放葡萄糖2提取原理TCA三氯乙酸（TCA）能够沉淀蛋白质而不影响糖原的溶解性，有效分离糖原与蛋白质10%TCA溶液在酸性条件下使蛋白质变性凝固，而糖原仍保持在上清液中碘化钾显色碘-碘化钾溶液与糖原结合形成特征性的棕红色络合物，这是基于碘分子插入糖原螺旋结构的显色反应颜色深浅与糖原浓度成正比，可用于定性和半定量分析含量测定方法采用酚-硫酸法精确测定糖原含量，该方法基于糖类在强酸条件下形成糠醛衍生物与酚试剂的显色反应在485nm波长下测定吸光度，建立标准曲线定量分析肝糖原提取步骤干燥收集糖原沉淀以离心分钟收集糖原3000rpm10蛋白质沉淀向上清液中逐滴加入无水乙醇，边沉淀，用乙醇洗涤次除去75%2-3组织预处理向组织匀浆中缓慢加入10%TCA溶加边轻缓搅拌，使乙醇终浓度达到残留将沉淀转移至预先称重TCA新鲜肝脏组织立即置于冰浴中，快液，边加边搅拌，使最终TCA浓度75%糖原在高浓度乙醇中沉淀析的表面皿中，在50°C烘箱中干燥2速称重并切成小块在冰浴条件下达到5%在4°C条件下静置30分出，形成白色絮状沉淀在4°C条小时至恒重冷却后称重计算糖原用组织匀浆器制备均匀的组织匀钟，使蛋白质充分变性沉淀然后件下静置过夜，使糖原完全沉淀产量和提取率浆，匀浆时间控制在2-3分钟，避以3000rpm离心15分钟，收集含有免摩擦产热影响糖原稳定性加入糖原的上清液，弃去沉淀等体积的冷蒸馏水稀释匀浆肝糖原鉴定方法实验八转氨酶的转氨基作用转氨反应氨基在氨基酸间的转移转氨酶种类ALT和AST的特异性差异纸层析分离氨基酸分离鉴定技术活性检测酶活性定量测定方法临床意义肝功能诊断重要指标转氨酶催化的转氨基反应是氨基酸代谢的核心环节，连接糖代谢和蛋白质代谢丙氨酸转氨酶（ALT）主要存在于肝脏，天冬氨酸转氨酶（AST）分布于心肌、肝脏、骨骼肌等组织转氨反应需要磷酸吡哆醛作为辅酶，通过席夫碱中间体实现氨基的转移这一反应在细胞能量代谢和氨基酸合成中具有重要意义，是连接不同代谢途径的关键步骤纸层析鉴定转氨基作用反应体系设计层析分离技术标准转氨反应体系包含谷氨酸（）作为氨基供体，丙酮使用正丁醇冰醋酸水（，）作为展开剂，在L-10mM::4:1:1v/v/v酸（）作为氨基受体，酶液（适量），磷酸吡哆醛辅号滤纸上进行上行展开样品点样量控制在，10mM ALTWhatman12-5μl酶（）点样直径不超过

0.1mM5mm反应在的磷酸缓冲液中进行，孵育分钟设置对展开时间约小时，直至溶剂前沿达到滤纸顶端处展开pH

7.437°C304-63/4照组包括无酶对照、无底物对照等，验证反应的特异性反应结完成后取出滤纸，通风晾干，准备进行显色检测不同氨基酸的束后加入终止反应值差异显著，便于分离鉴定TCA Rf第五章核酸实验技术结构功能概述核酸是遗传信息的载体，DNA储存遗传信息，RNA参与蛋白质合成双螺旋结构通过氢键和碱基堆积力维持稳定，磷酸基团赋予负电荷特性，为分离纯化提供基础提取分离原理细胞裂解释放核酸，去除蛋白质和多糖杂质酚-氯仿抽提利用有机溶剂变性蛋白质，乙醇沉淀利用核酸在高离子强度下的不溶性，实现核酸的分离纯化定量纯度检测紫外分光光度法基于核酸在260nm的特征吸收A260/A280比值评估蛋白质污染，A260/A230比值评估多糖和盐类污染荧光染料法具有更高的灵敏度和特异性电泳分析技术琼脂糖凝胶电泳根据分子大小分离核酸片段DNA标准分子量标准用于确定片段大小，溴化乙锭或SYBR染料用于核酸可视化检测，紫外光激发观察结果。